青海草原毛蟲成蟲觸角感器觀察及GqinOBPs表達分析

摘要為明確青海草原毛蟲Gynaephora qinghaiensis觸角感受器的類型、分布及GqinOBPs基因在嗅覺識別過程中的功能，本研究利用掃描電鏡對其觸角進行觀察，并通過RT-qPCR測定GqinOBPs基因在雌雄成蟲組織中的表達情況。在青海草原毛蟲雌雄成蟲觸角上發(fā)現(xiàn)分泌孔及8種感器，包括刺形感器、毛形感器、B?hm氏鬃毛、單孔栓感器、鱗形感器、錐形感器、柱形感器和腔錐形感器。其中刺形感器、毛形感器、B?hm氏鬃毛和錐形感器分別有6、3、2和3種亞型。GqinOBPs的組織表達結(jié)果顯示，GqinOBP6、GqinOBP8、GqinOBP9和GqinOBP16在雄成蟲觸角中的相對表達量顯著高于其他組織，GqinOBP4、GqinOBP10、GqinOBP13～ GqinOBP15和GqinOBP17在雄成蟲翅中的相對表達量最高。GqinOBP2、GqinOBP12和GqinOBP17在雌蟲組織中的整體表達情況較好且GqinOBP17的表達具雌性偏好（P＜0.05）。本研究為深入了解青海草原毛蟲化學(xué)感受機制奠定基礎(chǔ)，同時也為尋找青海草原毛蟲綠色防治的分子靶標提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞青海草原毛蟲;觸角感器;掃描電鏡;氣味結(jié)合蛋白;組織表達

中圖分類號：S 812文獻標識碼：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023602Observations on the ultrastructure of adult Gynaephora qinghaiensis

antennal sensilla and tissue expression analysis of GqinOBPsNAN Yanbin，LIU Zhanling，KOU Guixiang，WANG Kexin，LI Rongrong，ZHOU Yuantao*（College of Agriculture and Animal Husbandry， Qinghai University， Xining810016， China）AbstractTo determine the types and distribution of antennal sensilla and the function of GqinOBP genes in the process of olfactory recognition， adult antennae of Gynaephora qinghaiensis were observed using a scanning electron microscope. The expression of GqinOBP genes in the tissues of female and male adults was determined by RT-qPCR. The antennae of G.qinghaiensis exhibited smell pores and eight types of sensilla： sensilla chaetica， sensilla trichodea， B?hm’s bristles， uniporous peg sensilla， sensilla squamous， sensilla basiconica， sensilla cylindric， and sensilla coeloconica. Notably， sensilla chaetica， sensilla trichodea， B?hm’s bristles， and sensilla basiconica had six， three， two， and three subtypes， respectively. Tissue expression analysis of GqinOBPs showed that the relative expression levels of GqinOBP6， GqinOBP8， GqinOBP9， and GqinOBP16 in the antennae of male adults were significantly higher than in other tissues. In contrast， GqinOBP4， GqinOBP10， GqinOBP13 to GqinOBP 15， and GqinOBP17 showed highest expression levels in the wings of male adults. Furthermore， the expressions of GqinOBP2， GqinOBP12， and GqinOBP17 were higher in female tissues， with GqinOBP17 showing a preference for females （P＜0.05）. This study provides foundational insights into the chemosensory mechanisms of G.qinghaiensis and offers a theoretical basis for finding molecular targets for the green control of G.qinghaiensis.

Key wordsGynaephora qinghaiensis;antennal sensilla;scanning electron microscope;odorant binding protein;

tissue expression昆蟲感受器是一種特殊的表皮結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)昆蟲對各種環(huán)境刺激的感知。昆蟲觸角上分布有許多感受器，在宿主定位、棲息地選擇、伴侶識別、覓食、交配等過程中發(fā)揮著重要作用［13］。研究表明，觸角中感受器的類型、分布與昆蟲性別［45］、覓食［6］以及種類等［7］有關(guān)。明確昆蟲觸角感受器的類型有助于闡明其在生物進化和嗅覺識別行為調(diào)控中的價值［810］。目前，大量的昆蟲觸角感器被發(fā)現(xiàn)。例如，長索跳小蜂Anagyrus vladimiri雌蟲觸角中發(fā)現(xiàn)了8種形態(tài)不同的感器類型［11］;黑跗眼天牛Bacchisa atritarsis觸角上共發(fā)現(xiàn)7類12種感器，其中刺形感器Ⅱ型在其雄成蟲觸角上呈現(xiàn)特異性分布，可能在雄蟲的某些行為中發(fā)揮主導(dǎo)作用［12］。阿小花尺蛾球果亞種Eupithecia abietaria debrunneata成蟲觸角上發(fā)現(xiàn)的感器類型為10類17種，且首次發(fā)現(xiàn)耳形感器Ⅲ，這是在鱗翅目昆蟲觸角感器研究中第一次報道［13］。昆蟲的嗅覺感知過程需要各種嗅覺蛋白的參與，包括氣味結(jié)合蛋白（odorant-binding proteins， OBPs）、化學(xué)感受蛋白（chemosensory proteins， CSPs）、氣味受體（olfactory receptors， ORs）、離子型受體（ionotropic receptors， IRs）和氣味降解酶（odorant degrading enzymes）等［14］。作為接收和感知化學(xué)信號的第一道屏障，OBPs在配體識別和氣味感知中起著至關(guān)重要的作用［15］。昆蟲OBPs屬于水溶性小分子蛋白家族，它們在昆蟲的化學(xué)感受器淋巴液中大量分布，被認為是昆蟲化學(xué)感受過程中氣味和信息素的載體［1617］。根據(jù)保守半胱氨酸殘基的數(shù)量及其分子結(jié)構(gòu)，OBPs主要分為5個類型：Classic OBPs， Dimer OBP， Plus-C OBPs， Minus-C OBPs， Atypical OBPss［1819］。OBPs作為昆蟲體內(nèi)最早被發(fā)現(xiàn)并開始研究的嗅覺蛋白，已經(jīng)在雙翅目Diptera、鱗翅目Lepidoptera、鞘翅目Coleoptera等昆蟲中被發(fā)現(xiàn)，目前被鑒定的OBPs超過600多個［20］。OBPs的功能已經(jīng)通過分子生物學(xué)、生物化學(xué)、生物物理學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、動力學(xué)和電生理學(xué)等手段逐步解析［2123］。大量研究表明，昆蟲OBPs蛋白基因主要在觸角中特異性表達，也在翅、生殖系統(tǒng)、下頜腺和唾液腺等非感覺組織和器官中表達［21，24］。由于昆蟲個體在不同性別、不同發(fā)育階段下進行的生命活動不同，因此與其相關(guān)的OBPs的表達情況也會隨之變化［25］。

青海草原毛蟲Gynaephora qinghaiensis（鱗翅目毒蛾科Lymantriidae）是為害高寒草甸最重要的害蟲之一，重點分布在青海門源、海晏、天俊、澤庫、瑪多、甘德、祁連、雜多和治多等地區(qū)［2627］。青海草原毛蟲幼蟲具有7個齡期，雌雄成蟲形態(tài)差異明顯，其雌成蟲翅、觸角、胸足皆退化，雄成蟲遷飛能力較強且具有發(fā)達的羽狀觸角［2829］。幼蟲背部有毒腺，可導(dǎo)致家畜和野生動物的口腔潰瘍和斷舌病，對人類和牲畜的健康構(gòu)成嚴重威脅［3031］。自20世紀60年代以來，在青海草原毛蟲的預(yù)防方面投入了巨大的努力，特別是在化學(xué)和生物殺蟲劑的研究和生產(chǎn)方面［3234］。然而，這仍未能從根本上有效地減輕其危害。伴隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，對青海草原毛蟲的研究開始涉及線粒體全基因組序列測定與分析［35］、線粒體基因的序列變異和表達模式［36］及轉(zhuǎn)錄組生物信息分析［26］等方面，目前尚未發(fā)現(xiàn)對其化學(xué)感器超微結(jié)構(gòu)和化學(xué)感受機制的研究。

研究昆蟲觸角感器類型、數(shù)量和分布是了解其嗅覺感器功能及感受機制的基礎(chǔ)。在害蟲生物防治過程中，可以利用昆蟲的嗅覺識別機制。對靶標害蟲嗅覺識別系統(tǒng)進行干擾可以實現(xiàn)對其的有效控制。因此，解析青海草原毛蟲嗅覺識別的分子機制，對于制定有效的綠色防控措施具有重要意義?；诖耍狙芯客ㄟ^掃描電鏡技術(shù)觀察并分析青海草原毛蟲成蟲觸角感器類型及分布狀況，同時利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測前期通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定出的15個氣味結(jié)合蛋白基因（GqinOBP2～GqinOBP6、GqinOBP8～GqinOBP17）［26］在成蟲不同組織中的表達情況，旨在為深入研究氣味結(jié)合蛋白在青海草原毛蟲嗅覺識別機制中的作用及基于嗅覺的青海草原毛蟲防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試昆蟲

供試青海草原毛蟲成蟲于2023年5月－8月采自青海省海北州（36°59′ N，100°52′ E，海拔3 095.1 m）野外。收集青海草原毛蟲雄成蟲的觸角、頭（去除觸角）、胸、腹、翅和足，獲得雄成蟲共6個部位的樣品。由于青海草原毛蟲雌成蟲觸角、翅和足發(fā)生退化，收集頭、胸、腹共3個部位的樣品。每個部位樣品取3個生物學(xué)重復(fù)。每個樣品的重復(fù)數(shù)量根據(jù)組織或個體大小從3～30個不等，用液氮速凍分裝儲存在-80℃冰箱中備用［21］。

1.2觸角掃描電鏡樣品的制備與超微結(jié)構(gòu)觀察

將青海草原毛蟲雌雄成蟲各9頭于-20℃冷凍1 min，在體視鏡下將雄成蟲的觸角從頭部分離，由于雌成蟲的觸角退化為肉突，無法與頭部分離，故取整個頭部。之后用30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇對雄成蟲觸角及雌成蟲頭部分別進行逐級脫水，每個濃度連續(xù)3次，每次脫水20 min;隨后將雄成蟲觸角及雌成蟲頭部用昆蟲針固定于泡沫板上，置于超凈工作臺中打開風(fēng)扇吹干12 h;干燥后的樣品于實驗臺上放置12 h。將干燥后的處理樣品用導(dǎo)電膠固定在樣品臺上;放入小型離子濺射儀（SBC-12）噴金1 min;之后在青海大學(xué)三江源國家重點實驗室進行掃描電鏡（JSM-7900F）拍攝。

1.3掃描電鏡數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

感器的長度及寬度根據(jù)拍攝照片，借助Image J（U.S National Institute of Health）進行測量，運用IBM SPSS 26.0進行7c1191580e64e98ed15894e81b3b1bbebb154988c2816457bead2567c24f485e統(tǒng)計分析。利用Adobe Photoshop CS6（Adobe Systems）對感器類型進行標注并進行圖片的排版;感器的鑒定參考Schneider［37］和Zacharuk［38］。

1.4總RNA提取及cDNA合成

通過TRIzol法提取1.1節(jié)收集的青海草原毛蟲各部位樣品的RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳分析樣品RNA完整性及是否存在DNA污染。利用超微量分光光度計檢測RNA純度，當(dāng)OD260/OD280為1.8～2.2，表明提取的RNA合格。對純度合格的RNA樣品利用TRUEscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（艾德萊，北京）合成cDNA第一鏈并置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5引物設(shè)計與合成

本課題組前期根據(jù)青海草原毛蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定出17個青海草原毛蟲OBPs基因序列［26］。由于引物的長度問題我們最終利用Oligo7軟件設(shè)計出15對引物（表1），內(nèi)參基因（EF-1α）參考張棋麟等［39］，引物委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

1.6青海草原毛蟲OBPs基因的qPCR檢測

以1.4節(jié)合成的cDNA為模板，每個樣品含3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)進行3次技術(shù)重復(fù)，通過熔解曲線評估引物的特異性。擴增體系為20 μL：SYBR Green Real-time PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA 1 μL （100 ng），超純水7.4 μL。在ABI 7500型實時熒光定量PCR儀中進行qPCR反應(yīng)，運行程序：95℃ 1 min;95℃ 15 s，60℃ 15 s，循環(huán)40次;72℃ 45 s。每個OBP基因在成蟲各組織中的表達量以在雌性頭部中的表達量為基準。

1.7數(shù)據(jù)分析

基因在不同組織中的相對表達量利用2-ΔΔCt法進行計算，其中：ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因）;ΔΔCt=ΔCt（樣品）-ΔCt（對照）［40］。通過SPSS 26.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，對各基因在不同組織中的表達量差異進行單因素方差分析（One-way ANOVA），同時利用Duncan氏新復(fù)極差法進行多重比較;最后使用Graphpad prism繪制基因的組織表達譜。

2結(jié)果與分析

2.1青海草原毛蟲成蟲觸角形態(tài)

青海草原毛蟲雄蟲觸角由鞭節(jié)（flagellum， Fl）、梗節(jié)（pedicel， Pe）和柄節(jié)（scape， Sc）組成;雌蟲觸角退化，無鞭節(jié)（圖1a， b）。鞭節(jié)是雄蟲觸角的端節(jié)，由33個亞節(jié)組成（F1～ F 33），柄節(jié)和梗節(jié)上分布有大量絨毛（圖1c， d）。鞭節(jié)的第1亞節(jié)長度為（131.36±1.12） μm，基部直徑為（83.61±1.72） μm;第33亞節(jié)長度為（56.33±1.53） μm，基部直徑為（59.00±2.65） μm。雄蟲觸角全長（1 383.72±15.19） μm，顯著長于雌蟲觸角全長［（772.71±6.47） μm］（P＜0.05）。雄蟲觸角梗節(jié)、柄節(jié)的長度和基部直徑均顯著大于雌蟲觸角（P＜0.05）（表2）。

2.2青海草原毛蟲觸角感器類型

2.2.1刺形感器 （sensilla chaetica， Sch）

刺形感器數(shù)量較少，表面光滑，末端極尖。根據(jù)長度、是否著生于臼狀感器窩、有無縱裂紋、有無彎曲、是否從基部到末梢逐步變細，將青海草原毛蟲的刺形感器分為6個亞型（圖2a，2d，3d，3f，3i）。青海草原毛蟲的刺形感器主要分布在雄蟲觸角鞭節(jié)羽狀分支端部（圖2a， d）。Sch-Ⅰ在雄蟲觸角鞭節(jié)分布較密，長度和基部直徑為（22.64±2.68） μm和（5.59±4.35） μm，雌雄成蟲間Sch-Ⅱ的長度和基部直徑差異顯著（P＜0.05）（表3）。SchⅢ～ SchⅥ在雄蟲觸角沒有發(fā)現(xiàn)，廣泛分布于雌蟲觸角（圖3d，f，i）。

2.2.2毛形感器（sensilla trichodea， St）

青海草原毛蟲雄成蟲觸角上毛形感器數(shù)量最多，分布最廣，在觸角鞭節(jié)羽狀分支上分布尤為密集（圖2b， c， f），在雌蟲退化觸角上也發(fā)現(xiàn)該種感器（圖3e）。毛形感器是一種細長、徑直或略有彎曲，從基部到末梢逐步變細的感器，其呈毛發(fā)狀，表面有縱向分布的紋路。根據(jù)有無臼狀感器窩、有無彎曲或分叉將青海草原毛蟲的毛形感器分為3個亞型。St-Ⅰ、St-Ⅱ和St-Ⅲ外形類似，但St-Ⅰ的長度與基部直徑明顯大于St-Ⅱ和St-Ⅲ（表3）。

2.2.3B?hm氏鬃毛（B?hm’s bristles，Bb）

B?hm氏鬃毛大多直立于觸角表面，感器表面光滑。Bb主要著生在青海草原毛蟲觸角的柄節(jié)和梗節(jié)基部，在雌、雄成蟲觸角上的分布無差異。青jy/MdPYHNpSSAEugMepcNIJnHAkZ0EyOo2CeHZX6K0Q=海草原毛蟲觸角的B?hm氏鬃毛有2種亞型，分別為B?hm氏鬃毛Ⅰ （Bb-Ⅰ）和B?hm氏鬃毛Ⅱ（Bb-Ⅱ）（圖2e）。B?hm氏鬃毛Ⅰ似刺形，基部較寬，端部尖細，表面無孔。青海草原草原毛蟲雄蟲Bb-Ⅰ的長度和基部寬度分別是（28.47±6.1） μm和（3.35±0.2） μm均顯著大于雌蟲的Bb-Ⅰ。B?hm氏鬃毛Ⅱ較短小，呈三角錐形，表面光滑，通常與B?hm氏鬃毛Ⅰ伴生（圖2g， h， i）。雌雄蟲間Bb-Ⅱ的長度和基部直徑差異均顯著（P<0.05，表3）。

2.2.4分泌孔（smell pores， Spo）

青海草原毛蟲的分泌孔主要分布在雄蟲觸角鞭節(jié)羽狀分支上（圖2d），且數(shù)量較少，雄蟲分泌孔的直徑為（5.19±0.42） μm（表3）。雌蟲觸角未發(fā)現(xiàn)該感器。

2.2.5鱗形感器（sensilla squamous， Ssq）

僅在青海草原毛蟲的雄蟲觸角發(fā)現(xiàn)該感器。鱗形感器是觸角柄節(jié)、梗節(jié)上的一種感器，著生于臼狀感器窩內(nèi)，中間較粗，基部、梢部均比中間部位細，呈狹長的鱗片形，表面具有縱裂紋，末梢端圓鈍（圖2a， 圖3c）。雄蟲鱗形感器長度和基部直徑分別為（11.27±1.44） μm、（1.89±1.19） μm（表3）。

2.2.6單孔栓感器 （uniporous peg sensilla， Up）

單孔栓感器由表皮特化形成，著生在深坑中，基部膨大，端部有1個小孔。其分布數(shù)量較少，在青海草原毛蟲雄成蟲觸角上僅發(fā)現(xiàn)2個，主要著生在觸角鞭節(jié)亞節(jié)的分支上（圖3a， b）。單孔栓感器基部直徑是（7.56±0.13） μm，感器環(huán)寬是（9.34±1.35） μm，感器柱高為（9.93±0.29） μm（表3）。

2.2.7錐形感器（sensilla basiconica， Sb）

錐形感器主要分布在青海草原毛蟲雌蟲觸角上（圖3d， g， h），雄蟲觸角上未發(fā)現(xiàn)。青海草原毛蟲的錐形感器比毛形感器粗，從基部到端部逐漸變細，基部有臼狀窩，末端較鈍，表面有縱向凹槽，根據(jù)長度和頂端形態(tài)將青海草原毛蟲的錐形感器分成3個亞型，即SbⅠ、SbⅡ和SbⅢ。

2.2.8柱形感器（sensilla cylindric， Scy）

青海草原毛蟲的柱形感器僅在雌蟲柄節(jié)部位發(fā)現(xiàn)，散生在柄節(jié)末端，數(shù)量較少。感器呈柱狀，端部有鈍圓狀微突，整體與觸角垂直（圖3d，f）。其長度和基部直徑分別為（24.33±1.47） μm、（2.19±0.27） μm（表3）。

2.2.9腔錐形感器（sensilla coeloconica，Sco）

只在青海草原毛蟲雌蟲觸角發(fā)現(xiàn)腔錐形感器。位于觸角柄節(jié)或梗節(jié)鉤狀突起上，腔中央的錐形變異較大， 略高于觸角表皮，周圍伴生錐形感器（圖3g）。其基部直徑為（1.38±0.04） μm。感器環(huán)寬和感器柱高分別是（1.62±0.02） μm和（3.17±0.2） μm。

2.3青海草原毛蟲OBP基因的組織表達分析

采用RT-qPCR技術(shù)測定已鑒定的OBP基因在青海草原毛蟲雄蟲頭、胸、腹、足、翅、觸角6個部位及雌蟲頭（包含退化觸角）、胸、腹3個部位的表達水平。結(jié)果表明：青海草原毛蟲15個OBP基因在成蟲各組織中表達量明顯不同（圖4）。雄成蟲中，GqinOBP6、GqinOBP8、GqinOBP9和GqinOBP16在觸角中的相對表達量顯著高于其他組織，分別是頭部中相對表達量的76.03、28.31、106.67和40倍，GqinOBP4、GqinOBP10、GqinOBP13～GqinOBP15和GqinOBP17在翅中的相對表達量顯著高于其他組織，分別為頭部相對表達量的2.42、5.82、5.21、2.35、31.71倍和2.06倍。GqinOBP11在觸角和翅中的相對表達量顯著高于其他組織（P＜0.05）。大部分GqinOBPs在雌成蟲的頭、胸和腹部幾乎不表達。GqinOBP2、GqinOBP12和GqinOBP17在雌蟲組織中的整體表達情況較好。GqinOBP4和GqinOBP17在雌蟲腹部的表達量最高，分別是頭部表達量的7.5和7.1倍，GqinOBP12在胸部的表達量最高，是頭部表達量的3.8倍，均達顯著水平（P＜0.05）。GqinOBP6、GqinOBP8、GqinOBP11和GqinOBP17在雌雄成蟲的頭、胸和腹中的表達存在顯著差異，且GqinOBP17在組織中的表達具雌性偏好（P＜0.05）。

3討論

鱗翅目成蟲主要通過觸角上的各種感器感受外界的化學(xué)信號和機械刺激， 明確感器的類型和分布是闡明功能和機制的前提［41］。我們發(fā)現(xiàn)青海草原毛蟲觸角上分布著8種類型的感器，分別為刺形感器、毛形感器、B?hm氏鬃毛、單孔栓感器、鱗形感器、錐形感器、柱形感器和腔錐形感器。與報道的其他鱗翅目昆蟲，如豆卜饃夜蛾Bomolocha tristalis［42］、小菜蛾P(guān)lutella xylostella［43］、草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda［44］等感器類型基本一致。其中刺形感器、毛形感器、B?hm氏鬃毛和錐形感器分別有6、3、2和3種亞型，豐富的感器類型使青海草原毛蟲擁有廣闊的棲息環(huán)境、強大的生存能力和更強的繁殖力［45］。

昆蟲觸角的刺形感器主要感知外界的機械刺激［46］。青海草原毛蟲的刺形感器主要分布在雄蟲觸角鞭節(jié)羽狀分支端部，未發(fā)現(xiàn)頂孔，在木毒蛾Lymantria xylina的感器研究中發(fā)現(xiàn)該類感器在其活動中可以起到保護觸角的作用，因此推測青海草原毛蟲的刺形感器具有相似功能［47］。毛形感器一般在鱗翅目蛾類觸角上普遍存在，分布廣，數(shù)量多，青海草原毛蟲也不例外，其雄蟲觸角上的毛形感器具有3種亞型。在青海草原毛蟲的雄蟲觸角感器中以毛形感器的數(shù)量最多，分布最廣且具有多種亞型，這與毛形感器在鱗翅目昆蟲觸角上的分布特點一致［4849］。該類感器被證實具有嗅覺和感受性信息素的功能，青海草原毛蟲雄蟲的毛形感器較發(fā)達，推測其對雌蟲釋放的性信息素具有辨向功能［50］。當(dāng)昆蟲遇到機械刺激時，B?hm氏鬃毛能緩沖重力的作用力，從而控制昆蟲下降速度［4］。因此，推測B?hm氏鬃毛可能刺激了與大腦相連的底層神經(jīng)元，從而使青海草原毛蟲能夠主動控制飛行時的觸角定位［51］。青海草原毛蟲雄蟲觸角發(fā)現(xiàn)單孔栓感器，數(shù)量較少。研究發(fā)現(xiàn)，美國白蛾Hyphantria cunea雄成蟲觸角上都著生有單孔栓感器［52］，其分布狀況與青海草原毛蟲雄蟲觸角上單孔栓感器的分布具有相似性。該感器對任何信息素以及植物揮發(fā)物沒有反應(yīng)，推測其功能可能是感受濕度或?qū)Χ趸济舾校?354］。鱗形感器在草地貪夜蛾中也有發(fā)現(xiàn)，通常認為其有機械感知的功能［44］。感器除了能感受氣味外，還能感受外界的溫、濕度［47，55］，因此推測該類感器在青海草原毛蟲寄主選擇上發(fā)揮作用。錐形感器可感知植物的氣味和信息素。目前已經(jīng)報道的鱗翅目昆蟲觸角感器中，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)柱形感器，其功能有待進一步研究。

基因表達分析是預(yù)測基因功能的重要手段，目前大量的研究證明參與嗅覺識別的OBPs主要在觸角中特異性表達，而在其他組織中表達的OBPs可能參與其他的生理功能［25，56］。本研究中GqinOBP6、GqinOBP8、GqinOBP9和GqinOBP16在雄觸角中的相對表達量顯著高于其他組織。表明其對應(yīng)的4個GqinOBPs可能是參與青海草原毛蟲多種嗅覺識別過程的重要蛋白。雖然大部分OBPs存在于昆蟲觸角中， 被稱作觸角特定蛋白 （antennal-specific protein），但是， 越來越多的OBPs被發(fā)現(xiàn)在其他組織中也有表達， 如頭部、口器、足、翅、胸部和腹部等， 在不同的器官組織中可能發(fā)揮著不同的功能［5759］。青海草原毛蟲部分OBP基因在觸角以外的組織中均有一定的表達量，如GqinOBP4、GqinOBP10、GqinOBP13～GqinOBP15和GqinOBP17在翅中的相對表達量較高。這與前人報道的昆蟲翅部也分布有嗅覺感器相一致［60］。然而，目前對于在翅中高表達的OBPs基因的功能尚缺乏研究。GqinOBP2、GqinOBP12和GqinOBP17在雌蟲組織中的整體表達情況較好且GqinOBP17在組織中的表達具雌性偏好（P＜0.05）。該結(jié)果與甘薯蟻象Cylas formicarius［61］的CforOBP1～3基因表達譜類似，這可能與雌雄成蟲在生命活動中各自承擔(dān)的角色不同有關(guān)［62］。

青海草原毛蟲成蟲通過嗅覺感受系統(tǒng)完成尋找配偶、寄主定位及產(chǎn)卵地選擇等行為，氣味結(jié)合蛋白在此過程中發(fā)揮著重要作用。表達于雄蟲觸角的OBP基因?qū)π孕畔⑺氐淖R別很重要，除觸角外，其他部位的OBP基因表達量在雌雄成蟲間也存在一定差異。這些基因可能在雌雄之間交配時，或是與寄主互作的過程中發(fā)揮重要作用［25］。因此，深入研究青海草原毛蟲嗅覺識別的分子機制，將為高效、特異性的昆蟲行為調(diào)節(jié)劑研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

4結(jié)論

本研究從青海草原毛蟲雌雄蟲觸角上發(fā)現(xiàn)分泌孔和8種感器，分別為刺形感器、毛形感器、B?hm氏鬃毛、單孔栓感器、鱗形感器、錐形感器、柱形感器和腔錐形感器。作為了解基因功能的關(guān)鍵第一步，使用RT-qPCR對這些GqinOBPs基因在不同組織中的表達情況進行檢測。我們鑒定出4個在雄蟲觸角中高表達，6個在翅中高表達及3個在雌蟲組織中整體表達情況較好的GqinOBPs基因。我們的研究結(jié)果將為進一步闡明青海草原毛蟲的嗅覺機制奠定基礎(chǔ)，同時也為尋找青海草原毛蟲綠色防治的分子靶標提供理論依據(jù)。

參考文獻

［1］ZHU Wenli， YANG Lin， LONG Jiankun， et al. Morphology of the antennal sensilla of the nymphal instars and adults in Notobitus meleagris （Hemiptera： Heteroptera： Coreidae） ［J/OL］. Insects， 2023， 14（4）： 351. DOI： 10.3390/insects14040351.

［2］REN Lili， SHI Juan， ZHANG Yinan， et al. Antennal morphology and sensillar ultrastructure of Dastarcus helophoroides （Fairmaire） （Coleoptera： Bothrideridae） ［J］. Micron， 2012， 43（9）： 921928.

［3］XU Wentian， LIU Genting， WANG Qike， et al. Ultrastructure of antennal sensory organs in nine flesh flies （Diptera： Sarcophagidae）： New insight into the definition of family Sarcophagidae ［J/OL］. Insects， 2022， 13（7）： 602. DOI： 8118/10.3390/insects13070602.

［4］BABU M J. Antennal sensilla of the weaver ant Oecophylla smaragdina （F.）-males and females sense differently？ ［J］. Indian Journal of Entomology， 2019， 81（3）： 418422.

［5］OLSSONP C， ANDERBRANT O， LOFSTEDT C， et al. Electrophysiological and behavioral responses to chocolate volatiles in both sexes of the pyralid moths Ephestia cautella and Plodia interpunctella ［J］. Journal of Chemical Ecology， 2005， 31（12）： 29472961.

［6］POLIDORI C， GARCIA A J， NIEVES-ALDREY J L. Antennal sensillar equipment in closely related predatory wasp species （Hymenoptera： Philanthinae） hunting for different prey types ［J］. Comptes Rendus Biologies， 2012， 335（4）： 279291.

［7］那杰，于維熙，李玉萍， 等.昆蟲觸角感器的種類及其生理生態(tài)學(xué)意義［J］.沈陽師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2008（2）： 213216.

［8］REN Changshi， CHANG Zhimin， ZU Zhiyun， et al. Comparison of morphological characteristics of antennae and antennal sensilla among four species of bumblebees （Hymenoptera： Apidae） ［J/OL］. Insects， 2023， 14（3）： 232. DOI： 10.3390/insects14030232.

［9］GALVANI G L， GONZALEZ-VAQUERO R A， GUERRA-NAVARRO C， et al. Antennal sensilla of cleptoparasitic and non-parasitic bees in two subfamilies of Apidae ［J］. Apidologie， 2017， 48（4）： 437449.

［10］張方梅， 金銀利， 張麗麗， 等. 灰茶尺蠖成蟲觸角及幼蟲頭部感器超微結(jié)構(gòu) ［J］. 昆蟲學(xué)報， 2019， 62（6）： 743755.

［11］SEVARIKA M， GIANNOTTI P， LUCCHI A， et al. The antennal sensory structures of female Anagyrus vladimiri （Hymenoptera： Encyrtidae） ［J/OL］. Insects， 2022， 13（12）： 1138. DOI： 8118/10.3390/INSECTS13121138.

［12］羅鵬， 吳家展， 王廣利. 油茶藍翅天牛觸角感器掃描電鏡觀察［J］. 植物保護， 2023， 49（1）： 271277.

［13］王京楓， 莊宇彤， 羅雨昕， 等. 小花尺蛾觸角感器掃描電鏡觀察［J］. 植物保護， 2022， 48（5）： 174182.

［14］CHANG Xuefei， BI Yaluan， CHI Haipeng， et al. Identification and expression analysis of odorant-binding and chemosensory protein genes in virus vector Nephotettix cincticeps ［J/OL］. Insects， 2022， 13（11）： 1024. DOI： 10.3390/insects13111024.

［15］BRITO N F， MOREIRA M F， MELO A C A. A look inside odorant-binding proteins in insect chemoreception ［J］. Journal of Insect Physiology， 2016， 95（6）： 5165.

［16］朱宇， 劉洋. 菜粉蝶氣味結(jié)合蛋白和化學(xué)感受蛋白生物信息學(xué)分析［J］. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2019， 31（1）： 104112.

［17］ANDERSSON M N， GROSSE-WILDE E， KEELING C I， et al. Antennal transcriptome analysis of the chemosensory gene families in the tree killing bark beetles， Ips typographus and Dendroctonus ponderosae （Coleoptera： Curculionidae： Scolytinae） ［J/OL］. BMC Genomics， 2013， 14（1）： 198. DOI： 8118/10.1186/1471-2164-14-198.

［18］PELOSI P， CALVELLO M， BAN L P， et al. Soluble proteins in insect chemical communication ［J］. Cellular and Molecular Life Sciences， 2006， 63（14）： 16581676.

［19］杜亞麗， 徐凱， 趙慧婷， 等. 昆蟲氣味結(jié)合蛋白的研究進展［J］. 昆蟲學(xué)報， 2020， 63（3）： 365380.

［20］ZHOU Jingjiang. Odorant-binding proteins in insects ［J］. Vitamins and Hormones， 2010， 83： 241272.

［21］李凱旋， 李艷艷， 王樹娟， 等. 桃小食心蟲成蟲期高表達氣味結(jié)合蛋白基因的克隆與表達譜分析［J］. 昆蟲學(xué)報， 2022， 65（11）： 14261436.

［22］ZHANG Ruibin， WANG Bing， GERARDA G， et al. Molecular basis of alarm pheromone detection in aphids ［J］. Current Biology， 2017， 27（1）： 5561.

［23］ZHU Jiao， ARENA S， SPINELLI S， et al. Reverse chemical ecology： Olfactory proteins from the giant panda and their interactions with putative pheromones and bamboo volatiles ［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2017， 114（46）： E9802-E9810.

［24］豐國蕊， 魏洪媛， 許鑫， 等. 角倍蚜氣味結(jié)合蛋白和化學(xué)感受蛋白基因的鑒定及表達譜［J］. 昆蟲學(xué)報， 2023， 66（3）： 292302.

［25］王宏民， 張靜， 張沖， 等. 綠豆象氣味結(jié)合蛋白基因的克隆及表達分析［J］. 昆蟲學(xué)報， 2021， 64（8）： 920928.

［26］南彥斌， 張月， 何啟玥， 等. 青海草原毛蟲氣味結(jié)合蛋白基因與生物信息學(xué)分析［J］. 草地學(xué)報， 2023， 31（3）： 688689.

［27］WANG Haizhen， ZHONG Xin， LIN Huafeng， et al. Genetic diversity and population structure of Gynaephora qinghaiensis in Yushu prefecture， Qinghai province based on the mitochondrial COⅠgene ［J］. Biochemical Genetics， 2021， 59（6）： 117.

［28］嚴林. 草原毛蟲屬的分類、地理分布及門源草原毛蟲生活史對策的研究［D］. 蘭州： 蘭州大學(xué)， 2006.

［29］包明慧. 青藏高原草原毛蟲物種界定及譜系地理學(xué)研究［D］. 蘭州： 蘭州大學(xué)， 2023.

［30］YUAN Minglong， ZHANG Qilin， WANG Zhaofeng， et al. Molecular phylogeny of grassland caterpillars （Lepidoptera： Lymantriinae： Gynaephora） endemic to the Qinghai-Tibetan plateau ［J/OL］. PLoS ONE， 2015， 10（6）： e0127257. DOI： 8118/10.1371/journal.pone.0127257.

［31］王海貞， 劉昕. 玉樹州境內(nèi)草原毛蟲種群分布及其對生境草場植被的影響［J］. 環(huán)境昆蟲學(xué)報， 2022， 44（4）： 891902.

［32］涂雄兵， 杜桂林， 李春杰， 等. 草地有害生物生物防治研究進展［J］. 中國生物防治學(xué)報， 2015， 31（5）： 780788.

［33］楊志榮， 伍鐵橋， 劉世貴， 等. V.B草原毛蟲生物防治劑的應(yīng)用技術(shù)研究［J］. 草地學(xué)報， 1995（4）： 317323.

［34］Lü Yanyan， ZHANG Jianguo， CHEN Wei， et al. Mapping of Gynaephora alpherakii inhabitability area in the National Park of Qilian Mountain， China ［J/OL］. Agronomy， 2023， 13（2）： 594. DOI： 8118/10.3390/agronomy13020594.

［35］YUAN Minglong， ZHANG Qilin， GUO Zhonglong， et al. The complete mitochondrial genome of Gynaephora alpherakii （Lepidoptera： Lymantriidae） ［J］. Mitochondrial DNA. Part A， DNA Mapping， Sequencing， and Analysis， 2016， 27（3）： 22702271.

［36］ZHANG Qilin， ZHANG Li， ZHAO Tianxuan， et al. Gene sequence variations and expression patterns of mitochondrial genes are associated with the adaptive evolution of two Gynaephora species （Lepidoptera： Lymantriinae） living in different high-elevation environments ［J］. Gene， 2017， 610： 148155.

［37］SCHNEIDER D. Insect antennae ［J］. Annual Review of Entomology， 1964， 9（1）： 103122.

［38］ZACHARUK Y R. Ultrastructure and function of insect chemosensilla ［J］. Annual Review of Entomology， 1980， 25（1）： 2747.

［39］張棋麟. 兩種草原毛蟲的比較線粒體基因組學(xué)研究［D］. 蘭州： 蘭州大學(xué)， 2014.

［40］張方梅， 劉楊， 李祥瑞， 等. 馬鈴薯甲蟲氣味結(jié)合蛋白的序列和基因表達譜分析［J］. 昆蟲學(xué)報， 2019， 62（4）： 428441.

［41］田彩紅， 黃建榮， 王亞楠， 等. 草地貪夜蛾成蟲觸角感器的超微結(jié)構(gòu)觀察［J］. 植物保護， 2021， 47（5）： 216221.

［42］徐偉， 董亞南， 崔娟， 等. 豆卜饃夜蛾觸角感器的超微結(jié)構(gòu)與分布［J］. 植物保護， 2019， 45（5）： 190196.

［43］趙欣陽， 黃星， 葛思妍， 等. 小菜蛾觸角感器的掃描電鏡觀察［J］. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2018， 40（1）： 5862.

［44］雷婷， 郭峰， 陳思蓉， 等. 草地貪夜蛾成蟲觸角感器超微結(jié)構(gòu)觀察［J］. 生物安全學(xué)報， 2021， 30（3）： 183188.

［45］南彥斌， 王克鑫， 潘學(xué)能， 等. 青海草原毛蟲幼蟲感器類型及GqinOBPs表達分析［J］. 草地學(xué)報， 2023， 31（12）： 36263635.

［46］LONG Ma， LEI Bian， ZHAO Qunli， et al. Ultrastructure ofsqkmR1glR68YVw4J+rMIsg== chemosensilla on antennae and tarsi of Ectropis obliqua （Lepidoptera： Geometridae） ［J］. Annals of the Entomological Society of America， 2016， 109（4）： 574584.

［47］陳佳寧， 孫媛媛， 任昊杰， 等. 木毒蛾成蟲觸角感器超微結(jié)構(gòu)觀察［J］. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報， 2023， 52（4）： 445449.

［48］LIU Hongxia， LIU Zhixiong， ZHENG Huaxia， et al. Sensilla on the antennae and ovipositor of the carpenterworm， Streltzoviella insularis （Staudinger， 1892） （Lepidoptera， Cossidae） ［J］. Oriental Insects， 2018， 52（4）： 420433.

［49］楊慧， 嚴善春， 李杰， 等. 落葉松重要枝梢害蟲松癭小卷蛾觸角感器的超微結(jié)構(gòu)［J］. 林業(yè)科學(xué)， 2008（2）： 9398.

［50］張健， 程彬， 周毓麟， 等.鱗翅目昆蟲觸角感器研究進展［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2017， 45（18）： 129132.

［51］KRISHNAN A， PRABHAKAR S， SUDARSAN S， et al. The neural mechanisms of antennal positioning in flying moths ［J］. The Journal of Experimental Biology， 2012， 215（17）： 30963105.

［52］劉丹， 鄧竣丹， 許維康， 等. 美國白蛾觸角感器的超微結(jié)構(gòu)［J］. 植物保護學(xué)報， 2023， 50（2）： 507518.

［53］SEADA A M. Antennal morphology and sensillum distribution of female cotton leaf worm Spodoptera littoralis （Lepidoptera： Noctuidae） ［J］. The Journal of Basic and Applied Zoology， 2015， 68： 1018.

［54］RANI A T， SHASHANK P R， MESHRAM N M， et al. Morphological characterization of antennal sensilla of Earias vittella （Fabricius） （Lepidoptera： Nolidae） ［J/OL］. Micron， 2021， 140： 102957. DOI： 8118/101016/j.micron2020102957.

［55］席駁鑫， 尚素琴， 胡桂馨， 等.草地白刺粗角葉甲成蟲觸角感器的超微形態(tài)學(xué)［J］.草業(yè)科學(xué)， 2023， 40（7）： 19201931.

［56］RICHARD B， VANNICE K S， VOSSHALL L B. An essential role for a CD36-related receptor in pheromone detection in Drosophila ［J］. Nature， 2007， 450（7167）： 289293.

［57］楊海博， 胡鎮(zhèn)杰， 李定旭， 等. 懸鈴木方翅網(wǎng)蝽觸角氣味結(jié)合蛋白基因鑒定［J］. 昆蟲學(xué)報， 2018， 61（10）： 11211131.

［58］HE Ming， HE Peng. Molecular characterization， expression profiling， and binding properties of odorant binding protein genes in the whitebacked planthopper， Sogatella furcifera ［J］. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B， Biochemistry & Molecular Biology， 2014， 174： 18. DOI： 8118/101016/j.cbpb201404008.

［59］HULL J J， PERERA O P， SNODGRASS G L. Cloning and expression profiling of odorant-binding proteins in the tarnished plant bug， Lygus lineolaris ［J］. Insect Molecular Biology， 2014， 23（1）： 7897.

［60］和東風(fēng)， 張雪， 黃聰， 等. 蘋果蠹蛾氣味結(jié)合蛋白基因CpomOBP20的克隆及表達分析［J］. 生物安全學(xué)報， 2022， 31（1）： 1726.

［61］HUA Jinfeng， PAN Chao， HUANG Yongmei， et al. Functional characteristic analysis of three odorant-binding proteins from the sweet potato weevil （Cylas formicarius） in the perception of sex pheromones and host plant volatiles ［J］. Pest Management Science， 2020，77（1）： 300312.

［62］賈小儉， 高波， 馬娟， 等. 甘薯蟻象氣味結(jié)合蛋白CforOBP8的基因表達譜及配體結(jié)合特性分析［J］. 昆蟲學(xué)報， 2019， 62（3）： 275283.

（責(zé)任編輯：楊明麗）