海水魚腸道中丁酸梭菌的篩選及發(fā)酵工藝優(yōu)化

摘要：為對海水魚腸道中的丁酸梭菌進(jìn)行分離篩選并且對其發(fā)酵工藝進(jìn)行改良優(yōu)化，首先利用含有RCM培養(yǎng)基篩選出厭氧菌株，通過革蘭氏染色、菌體形態(tài)、厭氧特性篩選出1株丁酸梭菌，對其進(jìn)行16S rDNA序列和系統(tǒng)發(fā)育樹分析鑒定，進(jìn)行單因素實驗并且在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗改良其發(fā)酵工藝。試驗結(jié)果顯示，經(jīng)過鑒定菌株CBL1為丁酸梭菌，并確定菌株CBL1的發(fā)酵工藝最優(yōu)條件為：發(fā)酵溫度為37℃、發(fā)酵時間為24 h、接種量3%、大豆蛋白胨40 g/L、葡萄糖35 g/L、碳酸氫鈉1.5 g/L、氯化鈉5 g/L、乙酸鈉3 g/L、鹽酸半胱氨酸0.5 g/L，在此條件下丁酸梭菌CBL1的發(fā)酵液活菌數(shù)為2.85×109 CFU/mL。本研究結(jié)果對水產(chǎn)養(yǎng)殖中丁酸梭菌制劑的開發(fā)具有一定的參考價值。

關(guān)鍵詞：海水魚腸道；丁酸梭菌；分離篩選；發(fā)酵工藝

中圖分類號：S965 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

水產(chǎn)養(yǎng)殖在促進(jìn)全球糧食安全以及人們對優(yōu)質(zhì)蛋白、微量元素等營養(yǎng)的攝取中發(fā)揮著重要作用［1］。隨著人們對水產(chǎn)品的需求日益增長，水產(chǎn)養(yǎng)殖也逐漸向著集約化和多樣化的方向發(fā)展［2］。集約化的養(yǎng)殖方式雖然符合水產(chǎn)品養(yǎng)殖的發(fā)展方向，但是水產(chǎn)品的集約化養(yǎng)殖也導(dǎo)致了飼料的利用率低、環(huán)境污染嚴(yán)重、水體富營養(yǎng)化、疾病暴發(fā)、抗生素濫用等問題［3-6］。為了提高水產(chǎn)養(yǎng)殖的安全、促進(jìn)水產(chǎn)品的生長，開發(fā)益生菌制劑促進(jìn)水產(chǎn)品生長、減少疾病的暴發(fā)越來越重要［7］。

丁酸梭菌又名酪酸梭菌，是專性厭氧的革蘭氏陽性菌，廣泛存在于人類及動物腸道、糞便和土壤中，是重要的益生菌［8-9］。丁酸梭菌具備促進(jìn)腸道營養(yǎng)物質(zhì)吸收、保護腸道健康、抗氧化、抗炎、提高免疫力、抗腫瘤等功能［10-13］。目前已有研究將丁酸梭菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中以提高水產(chǎn)品的品質(zhì)和安全，例如：徐創(chuàng)文等［14］發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌可以提高花鱸幼魚的消化、免疫、抗氧化能力，促進(jìn)幼魚生長；Meng等［15］發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌可以調(diào)節(jié)鯉魚的腸道菌群，提高免疫力；Bi等［16］研究表明丁酸梭菌H129可以提高大菱鲆的免疫力，減少疾病的發(fā)生；Wang等［17］研究表明丁酸梭菌可以增強南美白對蝦對弧菌的抵抗能力。綜上所述，丁酸梭菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域具有巨大的潛力和應(yīng)用市場。

但目前有關(guān)從海水魚腸道分離丁酸梭菌的報道較少，從魚腸道分離的丁酸梭菌可能對水產(chǎn)養(yǎng)殖具有更好的適應(yīng)性。本研究從海水魚腸道中分離篩選丁酸梭菌，并對其液體發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，為其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

湛江市售的海水魚。

1.1.2 培養(yǎng)基、試劑

梭菌增菌肉湯（RCM肉湯）、梭菌增菌培養(yǎng)基（RCM培養(yǎng)基），北京陸橋技術(shù)股份有限公司；液體石蠟、HCl，化學(xué)純，西隴化工股份有限公司；胃蛋白酶，上海源葉生物科技有限公司；蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉，分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨，生化試劑，上海源葉生物科技有限公司；牛肉膏、酵母膏、碳酸氫鈉，上海麥克林生化科技有限公司；2×MightyAmp Buffer Ver.2（Mg2+，dNTP plus）、MightyAmp DNA Polymerase Ver.2、DL 2000 DNA Marker，寶生物工程（大連）有限公司；50×TAE緩沖液，生工生物工程（上海）股份有限公司；Ultra GelRed（10000×），南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.1.3 實驗儀器

C-32.5L型密封培養(yǎng)罐，日本三菱MGC公司；Genbag型厭氧產(chǎn)氣袋，法國梅里埃集團；SW-CJ-2F型潔凈工作臺，博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SPX-250-II型生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；Varioskan型全自動酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；A300型基因擴增儀，由杭州朗基科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；ZF-20D型暗箱式紫外分析儀，由鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)；DYY-8C型電泳儀，由北京六一生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 丁酸梭菌的篩選

用無菌剪刀剪碎海水魚腸道，混合均勻，取10 g海水魚腸道樣品加入100 mL RCM肉湯（液體石蠟液封，封口膜隔絕氧氣）中，于37℃厭氧富集培養(yǎng)24 h。采用梯度稀釋法依次稀釋至10-5、10-6、10-7，分別取100 μL涂布于RCM培養(yǎng)基中，用封口膜隔絕氧氣，放入?yún)捬醮校?7℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h。挑取單菌落采用四區(qū)劃線法進(jìn)行分離純化直至得到純化單菌落，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 丁酸梭菌的鑒定

1.2.1.1丁酸梭菌的菌落形態(tài)鑒定

挑取丁酸梭菌單菌落點種于RCM培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，觀察其菌落顏色、形態(tài)、透明度、大小、氣味等，并且進(jìn)行革蘭氏染色。

1.2.1.2丁酸梭菌的分子鑒定

用牙簽挑取純化后單菌落的丁酸梭菌進(jìn)行16S rDNA序列擴增。引物為細(xì)菌通用引物1492R和27F。PCR反應(yīng)體系（30 μL）：15 μL 2×MightyAmp buffer、0.75 μL MightyAmp DNA聚合酶、上下游引物各0.75 μL和12.75 μL ddH2O。PCR擴增程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s；55℃退火20 s，72℃延伸110 s，共循環(huán)30次；72℃終延伸10 min。取4 μL PCR 產(chǎn)物于1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳，觀察結(jié)果并判斷分子質(zhì)量。選擇檢測合格的PCR產(chǎn)物，交由生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序工作。隨后，將測序結(jié)果上傳至EZBioCloud和NCBI進(jìn)行同源性檢索，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 丁酸梭菌種子液制備

從RCM培養(yǎng)基中挑取丁酸梭菌單菌落接種到100 mL滅菌后的強化梭菌肉湯（液體石蠟液封），37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，作為種子液備用。

1.2.4 丁酸梭菌培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.4.1 碳源優(yōu)化

以RCM肉湯為基礎(chǔ)，選取乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖、果糖作為碳源，其余成分不變，丁酸梭菌接種量為3%，37℃厭氧發(fā)酵24 h，測定OD600 nm的吸光值。

1.2.4.2 碳源添加量優(yōu)化

以RCM肉湯為基礎(chǔ)，葡萄糖作為碳源，選取15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L的添加量，其余成分不變，丁酸梭菌的接種量為3%，37℃厭氧發(fā)酵24 h，測定OD600 nm的吸光值。

1.2.4.3 有機氮源的優(yōu)化

以RCM肉湯為基礎(chǔ)，選取牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨作為氮源，其余成分不變，丁酸梭菌接種量為3%，37℃厭氧發(fā)酵24 h，測定OD600 nm的吸光值。

1.2.4.4 氮源添加量優(yōu)化

以RCM肉湯為基礎(chǔ)，根據(jù)有機氮源優(yōu)化的結(jié)果，選取大豆蛋白胨作為氮源，添加量分別為10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L、40 g/L，其余成分不變，丁酸梭菌接種量為3%，37℃厭氧發(fā)酵24 h，測定OD600 nm的吸光值。

1.2.4.5 碳酸氫鈉添加量優(yōu)化

以RCM肉湯為基礎(chǔ)，碳酸氫鈉添加量選取0 g/L、0.5 g/L、1 g/L、1.5 g/L、2 g/L，其余成分不變，丁酸梭菌的接種量為3%，37℃厭氧發(fā)酵24 h，測定OD600 nm的吸光值。

1.2.4.6 硫酸鎂添加量優(yōu)化

以RCM肉湯為基礎(chǔ)，硫酸鎂添加量選取0 g/L、0.5 g/L、1 g/L、1.5 g/L、2 g/L，其余成分不變，丁酸梭菌的接種量為3%，37℃厭氧發(fā)酵24 h，測定OD600 nm的吸光值。

1.2.4.7 磷酸氫二鉀添加量優(yōu)化

以RCM肉湯為基礎(chǔ)，磷酸氫二鉀添加量選取0 g/L、1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L，其余成分不變，丁酸梭菌的接種量為3%，37℃厭氧發(fā)酵24 h，測定OD600 nm的吸光值。

1.2.4.8 發(fā)酵培養(yǎng)基正交實驗優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取影響最為顯著的3個因素（葡萄糖、大豆蛋白胨、碳酸氫鈉）進(jìn)行正交實驗優(yōu)化，其余因素以單因子實驗優(yōu)化的水平為準(zhǔn)，采用L9（3^4）正交表。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗結(jié)果均為測定3次，采用 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析（P<0.05）分析數(shù)據(jù)之間的顯著性，并用 Origin 2021 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸梭菌的分離篩選

通過RCM培養(yǎng)基從海水魚腸道中分離出16株厭氧菌株，根據(jù)菌落形態(tài)、菌體、嚴(yán)格厭氧特性初步判斷其中1株符合丁酸梭菌特征。結(jié)果如表2所示。

2.2 丁酸梭菌的分子鑒定

將CBL1的測序結(jié)果與EzBioCloud和NCBI數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進(jìn)行核酸序列相似性對比，結(jié)果CBL1與模式菌中的丁酸梭菌的16S rDNA基因相似度最高。選擇相似度最高的模式菌株用軟件MEGA5軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1所示。CBL1與標(biāo)準(zhǔn)菌株Clostridium butyricum DSM 10702關(guān)系最近，聚同一支系上。綜合分析，可以得出菌株CBL1鑒定為丁酸梭菌。

2.3 丁酸梭菌培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.3.1 不同碳源添加對丁酸梭菌CBL1發(fā)酵的影響

由圖2可以得知，在接種量為3%，發(fā)酵時間為24 h的條件下，分別添加30 g/L的乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖、果糖。其中添加葡萄糖時丁酸梭菌CBL1生長最好，而添加乳糖時丁酸梭菌CBL1生長最差。它們在OD600 nm處的吸光度值分別為1.3350和0.7365，因此選擇葡萄糖進(jìn)行后續(xù)的添加量優(yōu)化實驗。

2.3.2 葡萄糖添加量對丁酸梭菌CBL1發(fā)酵的影響

由圖3可以得知，在接種量為3%，發(fā)酵時間為24 h的條件下，隨著葡萄糖添加量的增加，OD600 nm處的吸光度先增加后減少，當(dāng)添加量為30 g/L時吸光度達(dá)到最大值為1.3235。這可能是因為隨著葡萄糖的添加丁酸梭菌快速生長，但當(dāng)葡萄糖的含量過高后反而使其細(xì)胞失水，生長受到抑制。由此可以得知丁酸梭菌CBL1的最適葡萄糖添加量為30 g/L。

2.3.3 不同氮源添加對丁酸梭菌CBL1發(fā)酵的影響

由圖4可以得知，選取牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨作為有機氮源，接種量為3%，發(fā)酵24 h。丁酸梭菌CBL1受大豆蛋白胨的影響較為顯著，在OD600 nm處的吸光度為1.4215。因此選擇大豆蛋白胨進(jìn)行氮源添加量優(yōu)化。

2.3.4 大豆蛋白胨添加量對丁酸梭菌CBL1發(fā)酵的影響

由圖5可以得知，以大豆蛋白胨作為氮源，隨著大豆蛋白胨添加量的增加，OD600 nm處的吸光度先增加后減少，在添加量為35 g/L時吸光度達(dá)到最大值為1.3825。因此大豆蛋白胨添加量為35 g/L時最適合丁酸梭菌CBL1的生長。

2.3.5 碳酸氫鈉添加量對丁酸梭菌CBL1發(fā)酵的影響

由圖6可以得知，隨著碳酸氫鈉添加量的增加，OD600 nm處的吸光度先增加后減少，在添加量為1.5 g/L時吸光度達(dá)到最大值為1.4075。因此碳酸氫鈉添加量為1.5 g/L時最適合丁酸梭菌CBL1的生長。

2.3.6 硫酸鎂添加量優(yōu)化

由圖7可以得知，隨著硫酸鎂添加量的增加，OD600 nm處的吸光度先增加后減少，在添加量為1 g/L時吸光度達(dá)到最大值為1.2985。因此硫酸鎂添加量為1 g/L時最適合丁酸梭菌CBL1的生長。

2.3.7 磷酸氫二鉀添加量優(yōu)化

由圖8可以得知，隨著磷酸氫二鉀添加量的增加，OD600 nm處的吸光度先增加后減少，在添加量為4 g/L時吸光度達(dá)到最大值為1.3105。因此磷酸氫二鉀添加量為4 g/L時最適合丁酸梭菌CBL1的生長。

2.3.8 正交試驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇葡萄糖、大豆蛋白胨、碳酸氫鈉進(jìn)行正交試驗。結(jié)果如表3所示，極差順序為A（葡萄糖）＞B（大豆蛋白胨）＞C（碳酸氫鈉），可以得出對丁酸梭菌CBL1影響最大的單因子是葡萄糖，其次是大豆蛋白胨和碳酸氫鈉，各單因子水平的最優(yōu)組合為A3B3C2，即葡萄糖添加量為35 g/L，大豆蛋白胨添加量為40 g/L，碳酸氫鈉的添加量為1.5 g/L，該組合A3B3C2的OD600 nm處吸光度值為2.103，其活菌數(shù)為2.85×109 CFU/mL。

3 結(jié)論

本研究從海水魚腸道中篩選出16株厭氧菌株，通過菌落形態(tài)、菌體、嚴(yán)格厭氧特性確定其中1株為丁酸梭菌，通過鑒定CBL1與Clostridium butyricum DSM 10702親緣關(guān)系相近，確定為丁酸梭菌。通過控制變量法和正交試驗，得出丁酸梭菌CBL1的最佳培養(yǎng)基為大豆蛋白胨40 g/L、葡萄糖35 g/L、碳酸氫鈉1.5 g/L、氯化鈉5 g/L、乙酸鈉3 g/L、鹽酸半胱氨酸0.5 g/L，在此條件下丁酸梭菌CBL1的發(fā)酵液活菌數(shù)為2.85×109 CFU/mL。本研究可以為丁酸梭菌益生菌制劑的研發(fā)提供參考，為其在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的推廣和應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

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