微波輔助離子液體提取黃檗生物堿的工藝研究

摘 要：采用微波輔助離子液體提取方法從黃檗樹皮中提取3種生物堿（藥根堿、巴馬汀和小檗堿）。首先基于單因素試驗(yàn)考察離子液體的種類和料液比對(duì)提取效率的影響，進(jìn)一步考察離子液體濃度、提取時(shí)間和溫度3種因素對(duì)提取效率的影響，最終應(yīng)用Box-Behnken響應(yīng)面方法優(yōu)化，得到最佳提取工藝，并與傳統(tǒng)提取方法進(jìn)行比較。研究結(jié)果表明，1-丁基-3-甲基咪唑嗅鹽（［Bmim］［Br］）溶液對(duì)生物堿的提取效率最高，最佳提取條件為離子液體濃度為0.31 mol/L，溫度為94 ℃，時(shí)間為15 min，在該條件下藥根堿得率為0.047%±0.003%，巴馬汀得率為0.421%±0.011%，小檗堿得率為1.150%±0.028%。與傳統(tǒng)水加熱回流法相比，提取效率分別高出9.3%、12.8%和23.6%。該研究表明，利用微波輔助離子液體提取技術(shù)可以高效地從黃檗樹皮中提取生物堿，為提取黃檗中活性成分提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)證支持。

關(guān)鍵詞：離子液體； 微波； 黃檗； 生物堿； 響應(yīng)面

中圖分類號(hào)：S713 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.7525/j.issn.1006-8023.2024.05.017

Study on the Process of Microwave-Assisted Ionic Liquid Extraction of Alkaloids from Phellodendron amurense Rupr.

Abstract： This study employed a microwave-assisted ionic liquid extraction method to extract three alkaloids （berberine， palmatine， and berbamine） from the bark of Phellodendron amurense Rupr.. Initially， the impact of the type of ionic liquid and liquid-to-solid ratio on extraction efficiency was investigated through single-factor experiments. Subsequently， the effects of ionic liquid concentration， extraction time， and temperature on extraction efficiency were further explored. The Box-Behnken response surface methodology was then applied to optimize and obtained the optimal extraction process， which was subsequently compared with traditional extraction methods. The research findings indicated that ［Bmim］［Br］ solution exhibited the highest extraction efficiency for the alkaloids. The optimal extraction conditions included an ionic liquid concentration of 0.31 mol/L， a temperature of 94°C， and an extraction time of 15 minutes. Under these conditions， the yields of berberine， palmatine， and berbamine were 0.047%±0.fPzfuvg8MhOcc1v3qLNe3lBh8bwosEFpn1r8x6Az34Y=003%， 0.421%± 0.011%， and 1.150%±0.028%， respectively. Compared to the traditional water heating reflux method， the extraction efficiencies were 9.3%， 12.8%， and 23.6% higher， respectively. This study demonstrates that the use of microwave-assisted ionic liquid extraction technology can efficiently extract alkaloids from the bark of Phellodendron amurense Rupr.， providing a theoretical basis and empirical support for the extraction of active components from Phellodendron amurense Rupr..

Keywords： ionic liquid； microwave； Phellodendron amurense Rupr.； alkaloids； response surface

0 引言

黃檗（Phellodendron amurense Rupr.）屬于蕓香科植物，主要分布于中國(guó)東北地區(qū)［1］。黃檗樹皮的主要生物活性成分是異喹啉生物堿等，其藥理作用包括抗炎、抗衰老、抗損傷、利尿、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗菌和神經(jīng)保護(hù)等，被用于治療糖尿病和痢疾等各種疾?。?-6］。提取是從植物內(nèi)得到活性物質(zhì)的第一步［7］，傳統(tǒng)的提取方法包括熱回流提取、索氏提取和滲濾等［8-10］。然而，這些方法通常需要較長(zhǎng)的提取時(shí)間或較高的提取溫度，并且提取效率常常不能達(dá)到預(yù)期。新穎的提取技術(shù)逐步被應(yīng)用于從植物中提取活性成分，如超聲輔助提取和微波輔助提取技術(shù)等。新技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是環(huán)保、提取效率高、能耗低、溶劑消耗少及操作簡(jiǎn)便等。微波輔助提取技術(shù)可以通過微波輻射迅速增加固體基質(zhì)的內(nèi)部壓力并誘導(dǎo)植物細(xì)胞破裂，加速細(xì)胞內(nèi)容物向提取溶劑中的釋放，從而增加提取率［11-13］。

離子液體（Ionic Liquids，ILs）是僅由有機(jī)陽(yáng)離子和無(wú)機(jī)或有機(jī)陰離子組成的鹽，在室溫下為液體，具有低蒸氣壓、低揮發(fā)性和高熱穩(wěn)定性的特性，因此被視為綠色溶劑［14-15］。此外，ILs可以根據(jù)植物中目標(biāo)活性成分的親疏水性調(diào)節(jié)其分子結(jié)構(gòu)，增加活性成分在提取溶液中的溶解性［16-17］。在本研究中，將微波技術(shù)與離子液體相結(jié)合，用于從黃檗樹皮中提取3種主要活性成分，包括小檗堿（BER）、藥根堿（JAT）和巴馬汀（PAL）。同時(shí)運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法優(yōu)化工藝參數(shù)并確定最佳提取條件。進(jìn)一步將新提取技術(shù)與傳統(tǒng)提取方法進(jìn)行比較，為黃檗資源的深度加工利用提供相應(yīng)的參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1290超高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Hypersil ODS2色譜柱（C18，250 mm×4.6 mm， 5 μm）（大連依利特分析儀器有限公司）；微波催化合成/萃取儀（908010，美國(guó)CEM公司）。

1.2 材料

黃檗樹皮購(gòu)買于黑龍江省哈爾濱市三棵樹藥材市場(chǎng)；十二烷基苯磺酸鈉及藥根堿、巴馬汀和小檗堿對(duì)照品（純度>98%）購(gòu)買于阿拉丁生物科技有限公司；乙腈和甲醇（色譜級(jí)）購(gòu)買于美國(guó)天地有限公司；離子液體購(gòu)買于上海成捷化學(xué)有限公司。

1.3 高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測(cè)定黃檗中3種生物堿方法

1）本試驗(yàn)使用HPLC對(duì)目標(biāo)生物堿進(jìn)行檢測(cè)分析［16］，檢測(cè)條件為：流動(dòng)相為乙腈和水溶液（體積比為1∶1），水溶液1 L內(nèi)含有1.7 g十二烷基磺酸鈉和3.4 g磷酸二氫鉀；進(jìn)樣量為5 μL；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為345 nm。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線配置方法。稱取4.68 mg藥根堿對(duì)照品、6.20 mg巴馬汀對(duì)照品和8.39 mg小檗堿對(duì)照品，分別裝入25 mL容量瓶中，用純水溶解并定容，采用對(duì)半稀釋法進(jìn)行稀釋，用0.45 μm微孔濾膜過濾后按照上述色譜條件對(duì)各個(gè)質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液的峰面積進(jìn)行測(cè)定，并利用軟件分別繪制3種生物堿標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，計(jì)算回歸方程?？v坐標(biāo)為峰面積分值，橫坐標(biāo)為對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度。

1.4 提取液中生物堿的含量計(jì)算方法

生物堿的得率為Y，計(jì)算公式為

式中：Y為生物堿的提取率，%；C為生物堿的質(zhì)量濃度，mg/mL；mp為黃檗藥材的質(zhì)量，g；1 000為生物堿的質(zhì)量由mg轉(zhuǎn)化為g；30為提取液體積30 mL。

1.5 單因素考察試驗(yàn)方法

將黃檗樹皮用粉碎機(jī)粉碎，過0.25mm篩網(wǎng)，烘箱烘干至恒重，作為試驗(yàn)原料。采用Standard Control微波模式，考查離子液體種類、料液比、離子液體濃度、微波提取時(shí)間和提取溫度對(duì)生物堿得率的影響。

1.5.1 離子液體種類

研究所用的4種離子液體的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。稱取4組0.20 g黃檗樹皮粉末，分別用1-丁基- 3-甲基咪唑溴鹽（［Bmim］［Br］）、1-己基-3-甲基咪唑鹽（［Hmim］［Br］）、1-辛基-3-甲基咪唑鹽（［Omim］［Br］）、1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（［Omim］［BF4］）離子液體水溶液作為溶劑（30 mL，0.30 mol/L），使用微波提取并控制溫度為60 ℃，提取5 min，隨 后使用HPLC方法對(duì)提取液中生物堿含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.2 料液比

根據(jù)離子液體種類考察試驗(yàn)得到的結(jié)果，選用0.3 mol/L的［Bmim］［Br］水溶液為溶劑，進(jìn)行料液比考察試驗(yàn)。根據(jù)料液比0.1/30、0.2/30、0.3/30、0.4/30、0.5/30 g/mL的試驗(yàn)安排，分別稱量0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g黃檗樹皮粉末，加入到30 mL離子液體水溶液中。使用微波進(jìn)行提取，控制溫度為60 ℃，提取時(shí)間為5 min，隨后使用HPLC對(duì)提取液中生物堿含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.3 ［Bmim］［Br］濃度

根據(jù)離子液體種類篩選得到的試驗(yàn)結(jié)果，稱取5組0.20 g黃檗樹皮粉末，配置濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的［Bmim］［Br］離子液體水溶液，體積為30 mL，使用微波進(jìn)行提取，控制溫度為60 ℃，提取5 min，隨后使用HPLC方法對(duì)提取液中生物堿含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.4 提取時(shí)間

稱取6組0.20 g黃檗樹皮粉末，以30 mL、0.3 mol/L的［Bmim］［Br］水溶液為溶劑，在60 ℃下，分別使用微波提取3、6、9、12、15、18 min，隨后使用HPLC對(duì)提取液中生物堿含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.5 提取溫度

稱取6組0.2 g黃檗樹皮粉末，以30 mL、0.3 mol/L的［Bmim］［Br］水溶液為溶劑，分別在30、40、50、60、70、80、90 ℃下使用微波提取15 min，隨后使用HPLC對(duì)提取液中生物堿含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.6 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選?。跙mim］［Br］水溶液濃度、溫度、提取時(shí)間3個(gè)自變量，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以3種生物堿得率為考察指標(biāo)（響應(yīng)值）。效應(yīng)面法設(shè)計(jì)（Box-Behnken Design，BBD）響應(yīng)面設(shè)計(jì)的模型符合二次多項(xiàng)式方程

式中：Y為預(yù)測(cè)的生物堿得率；β0、βi、βii、βij分別表示常數(shù)項(xiàng)、線性系數(shù)項(xiàng)、二次系數(shù)項(xiàng)、交互系數(shù)項(xiàng)；Xi和Xj表示自變量。按照BBD的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，對(duì)各項(xiàng)系數(shù)進(jìn)行回歸分析。

1.6 對(duì)比試驗(yàn)考察方法

1）加熱回流法。稱取2組0.2 g黃檗樹皮粉末，分別以30 mL、0.3 mol/L［Bmim］［Br］和30 mL水為溶劑，油浴加熱90 ℃，回流10 h。

2）微波輔助提取法。稱取2組0.06 g黃檗樹皮粉末，分別以30 mL的水和0.31 mol/L［Bmim］［Br］水溶液為溶劑，使用微波加熱，在溫度為90 ℃下提取15 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照HPLC檢測(cè)條件，縱坐標(biāo)A為峰面積，X為對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（mg/mL），計(jì)算回歸方程。3種生物堿的線性方程及決定系數(shù)分別為JAT的峰面積：AJAT=6 971.4X+0.772，R2=0.999；PAL的峰面積：APAL=8 326.1X+8.967，R2=0.999 9；BER的峰面積：ABER=7 122X-4.732 7，R2=0.999 8。說(shuō)明3種生物堿在適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量濃度范圍內(nèi)和峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.2 離子液體種類篩選結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，圖2中縱坐標(biāo)表示生物堿的得率，可知相同濃度下［Bmim］［Br］水溶液對(duì)3種生物堿的得率均優(yōu)于其他3種類型離子液體，［Bmim］［Br］的提取效果優(yōu)于［Hmim］［Br］和［Omim］［Br］的原因是陽(yáng)離子的差異，［Bmim］［Br］的碳鏈短、極性大，而黃檗中的生物堿在極性大的溶劑中溶解性較好。［Omim］［BF4］由于極性較小，導(dǎo)致在水中的溶解度較?。?8］，對(duì)黃檗中的生物堿提取效果較差。因此，選擇［Bmin］［Br］水溶液作為溶劑進(jìn)行下一步提取工藝研究。

2.3 料液比對(duì)生物堿提取效率的影響

在提取工藝中，藥材用量和提取液的投放比例是重要的考察因素，往往是提取液體積越大提取效率越好，但是從回收和經(jīng)濟(jì)角度考慮應(yīng)將溶劑量控制在一定范圍內(nèi)。本研究試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，生物堿的提取效率隨著加入的黃檗藥材質(zhì)量增加而減小（溶劑恒定為30 mL）。雖然在藥材質(zhì)量為0.1 g時(shí)，得率最高，但0.1/30 g/mL與0.2/30 g/mL得率差異不大，因此，研究選擇料液比為0.2/30 g/mL作為后續(xù)試驗(yàn)條件。

2.4 ［Bmim］［Br］水溶液濃度對(duì)生物堿提取效率的影響

進(jìn)一步考察離子液體濃度對(duì)提取效率的影響，隨著離子液體濃度增大，3種生物堿提取率均增加，這是由于當(dāng)離子液體濃度較低時(shí)，隨著離子液體濃度增加，離子液體改變水溶液極性，使得生物堿溶解性增大占了主導(dǎo)地位，從而提取效率增加。之后隨著離子液體黏度繼續(xù)增加阻礙溶劑的滲透和擴(kuò)散，從而降低生物堿的提取效率［19］。由圖4可知，當(dāng)離子液體濃度為0.3 mol/L時(shí)，生物堿的得率最高。

2.5 提取時(shí)間對(duì)生物堿提取效率的影響

隨著提取時(shí)間增加，生物堿的提取效率升高，如圖5所示。生物堿的得率在15 min內(nèi)緩慢增加，在15 min時(shí)生物堿的得率最高，但在18 min條件下略有下降。得率下降的原因可能是提取時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致生物堿降解［20］。因此，選擇15 min為后續(xù)優(yōu)化的中心點(diǎn)。

2.6 提取溫度對(duì)生物堿提取效率的影響

溫度對(duì)天然產(chǎn)物提取效率的影響多為隨著溫度升高，溶劑滲透能力、擴(kuò)散能力以及溶解性均增大。本試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。隨著溫度升高，生物堿的得率升高，在90 ℃條件下生物堿的得率最高。當(dāng)溫度高于90 ℃時(shí)，3種生物堿的得率均有降低的趨勢(shì)，這可能是過高的溫度使提取出來(lái)的生物堿部分被分解或轉(zhuǎn)化［21］。因此，選擇90 ℃為后續(xù)優(yōu)化的中心點(diǎn)。

2.7 響應(yīng)面法優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果

2.7.1 BBD模型的建立及其顯著性試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，使用軟件Design-Expert 13.0，采用BBD方法建立三因素三水平的模型。對(duì)響應(yīng)面進(jìn)行分析，研究各因素與響應(yīng)值之間以及各因素之間的相互關(guān)系，進(jìn)一步優(yōu)化3個(gè)獨(dú)立變量（X1［Bmim］［Br］水溶液濃度、X2溫度、X3時(shí)間）。表1展示了Box-Behnken Design的17組試驗(yàn)方案和對(duì)應(yīng)的生物堿的得率結(jié)果。

表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Design-Expert 13.0軟件回歸擬合處理，得到3個(gè)響應(yīng)值對(duì)YJAT、YPAL和YBER的二次多項(xiàng)式回歸模型為

表2為回歸方程模型中3種生物堿提取率的方差分析表，由表2中模型的質(zhì)量因素（F）（分別為71.61、49.03和76.05，P<0.000 1）可知，該模型顯著性非常明顯。失擬項(xiàng)不顯著，表明方程在試驗(yàn)所選范圍內(nèi)，擬合性較好；根據(jù)表3的結(jié)果可知，3種生物堿的決定系數(shù)分別為R2=0.989 3、0.984 4、0.989 9，說(shuō)明該模型能很好地解釋試驗(yàn)中響應(yīng)值的變化；變異系數(shù)為1.55%，1.03%，1.32%，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果的可靠性和回歸模型的準(zhǔn)確性。調(diào)和系數(shù)分別為R2adj=0.975 4、0.964 3、0.976 9，與決定系數(shù)R2很接近，說(shuō)明響應(yīng)預(yù)測(cè)值和實(shí)際值高度相關(guān)。根據(jù)上述對(duì)模型的分析，說(shuō)明該模型能對(duì)黃檗中3種生物堿的提取率進(jìn)行很好的預(yù)測(cè)。表中X1和X2項(xiàng)的P均小于0.01，說(shuō)明X1項(xiàng)和X2項(xiàng)對(duì)黃檗中3種生物堿的提取率線性效果非常明顯；生物堿PAL和BER二次項(xiàng)X12、X22和X32的P<0.01，JAT的二次項(xiàng)X12和X22的P<0.01，說(shuō)明此方法對(duì)生物堿提取率的影響非常顯著。

2.7.2 響應(yīng)面分析及優(yōu)化

根據(jù)回歸方程，響應(yīng)面軟件生成3D響應(yīng)面圖，如圖7所示。確定1個(gè)變量，觀察2個(gè)連續(xù)變量對(duì)生物堿得率的影響的3D圖。由圖7可以直觀地反映出各因素對(duì)得率的作用。當(dāng)提取條件在合適范圍內(nèi)，生物堿的得率不斷提高，當(dāng)［Bmim］［Br］水溶液濃度在0.30～0.35 mol/L、提取溫度在90～95 ℃、提取時(shí)間在15～15.5 min，3種生物堿的得率達(dá)到最高。

2.7.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過對(duì)3種生物堿的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，使用Design Expert 13.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，BBD模型給出提取生物堿的最佳條件，最佳提取條件是提取液濃度為0.31 mol/L，溫度為94.10 ℃，時(shí)間為15.34 min，估測(cè)的最佳JAT得率為0.049%，PAL的得率為0.424%，BER的得率為1.170%。稍加修改獲得的最佳條件，統(tǒng)一生物堿提取條件，最終使用濃度是0.31 mol/L，溫度是94 ℃，時(shí)間是15 min，重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)來(lái)保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性并通過實(shí)際得到的生物堿得率驗(yàn)證模型優(yōu)化得出的提取條件是否可靠。3次試驗(yàn)的平均值分別為JAT得率0.047% ± 0.003%，PAL得率0.421% ± 0.011%，BER得率1.150% ± 0.028%，這些結(jié)果與BBD模型估測(cè)的理論值保持一致，這說(shuō)明該模型對(duì)生物堿提取方法的優(yōu)化是可靠的。

2.8 與其他提取方法的比較結(jié)果

將微波輔助離子液體提取方法與傳統(tǒng)水溶劑加熱回流法進(jìn)行對(duì)比。試驗(yàn)結(jié)果見表4。以加熱回流為提取方法，［Bmim］［Br］的提取效果優(yōu)于水溶液，這是由于離子液體可以改變?nèi)軇┑臉O性，從而增加對(duì)提取物溶解能力，提高提取率。以離子液體為溶劑，分別采用加熱回流和微波輔助提取技術(shù)， 2種方法的提取率接近，然而微波提取技術(shù)所需的時(shí)間約為15 min，更為高效。在微波輔助離子液體的最佳提取條件下，與傳統(tǒng)水加熱回流法相比，提取效率分別高出9.3%、12.8%和23.6%。

3 結(jié)論

本研究對(duì)黃檗的微波輔助離子液體提取工藝進(jìn)行系統(tǒng)性研究，對(duì)比分析具有不同性質(zhì)的4種離子液體提取黃檗中生物堿的提取效率，結(jié)果表明，具有短碳鏈和高極性的離子液體［Bmim］［Br］提取效率最高。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，使用效應(yīng)面法設(shè)計(jì)對(duì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的最優(yōu)工藝條件為離子液體濃度為0.31 mol/L，溫度為94 ℃，時(shí)間為15 min，在該條件下藥根堿提取率0.047%± 0.003%，巴馬汀提取率 0.421%±0.011%，小檗堿提取率1.150%±0.028%。與傳統(tǒng)水加熱回流法相比，提取效率分別高出9.3%、12.8%和23.6%。本研究結(jié)果表明，使用微波輔助離子液體提取技術(shù)從黃檗中提取生物堿，具有提取時(shí)間較短、節(jié)省溶劑以及噪聲小等優(yōu)點(diǎn)。本研究為黃檗中生物堿的提取提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。

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