一株南方紅豆杉內(nèi)生菌HDSW的抗腫瘤活性研究

摘要［目的］鑒定南方紅豆杉抗腫瘤內(nèi)生菌HDSW，并初步研究其抗腫瘤機(jī)制。［方法］基于16S rDNA測(cè)序鑒定菌株HDSW的種屬，通過MTT試驗(yàn)、平板細(xì)胞集落形成試驗(yàn)、細(xì)胞黏附試驗(yàn)、劃痕試驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HDSW發(fā)酵液的有機(jī)溶劑提取物對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803的抑制活性，利用實(shí)時(shí)定量PCR方法探索其抗腫瘤的分子機(jī)制。［結(jié)果］菌株HDSW被鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus pumilus），其發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物作用于胃癌細(xì)胞MGC-803可有效降低其存活率，減弱其黏附能力，抑制遷移能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。菌株HDSW發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物可顯著增強(qiáng)促細(xì)胞凋亡基因p53、Bax和Caspase 3的表達(dá)水平，抑制細(xì)胞凋亡拮抗基因Bcl-2的表達(dá)。［結(jié)論］南方紅豆杉內(nèi)生菌HDSW可產(chǎn)生具有顯著抗胃癌細(xì)胞MGC-803活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，且乙酸乙酯可將其提取出來，具有潛在的開發(fā)價(jià)值。

關(guān)鍵詞 南方紅豆杉；內(nèi)生菌；抗腫瘤活性；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移

中圖分類號(hào) R285 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2024）19-0145-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.19.032

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Antitumor Activity of an Endophytic Bacteria HDSW from Taxus chinensis var.mairei Cheng et L.K.Fu

LI Ping，HU Jian-ran，GUO Chun-yan et al

（Department of Biological Science and Technology，Jinzhong University，Jinzhong，Shanxi 030619）

Abstract ［Objective］To identify the antitumor endophytic bacterium HDSW of Taxus chinensis var.mairei and preliminarily study its antitumor mechanism.［Method］The strain HDSW was identified based on 16S rDNA sequencing.The inhibitory activity of the organic solvent extract of HDSW fermentation broth on gastric cancer cell line MGC-803 was detected by MTT assay，plate cell colony formation assay，cell adhesion assay，scratch assay，and flow cytometry.The molecular mechanism was explored by real-time PCR.［Result］The strain HDSW was identified as Bacillus pumilus.The ethyl acetate extract of the fermentation broth could effectively reduce the survival rate，weaken the adhesion capability，inhibit migration capability，and induce cell apoptosis of the gastric cells MGC-803.The ethyl acetate extract from the fermentation broth of strain HDSW could significantly enhance the expression of pro-apoptotic genes p53，Bax and Caspase 3，and inhibit the expression of anti-apoptotic gene Bcl-2.［Conclusion］The endophytic Bacillus HDSW from Taxus chinensis var.mairei can produce secondary metabolites with significant anti-gastric cancer cell MGC-803 activity，which can be extracted by ethyl acetate，and possess potential development value.

Key words Taxus chinensis var.mairei Cheng et L.K.Fu;Endophytic bacteria;Antitumor;Cell proliferation;Cell migration

基金項(xiàng)目 山西省基礎(chǔ)研究計(jì)劃（自由探索類）青年項(xiàng)目（202203021222292）；山西省基礎(chǔ)研究計(jì)劃（自由探索類）面上項(xiàng)目（20210302123493）；山西省教育廳高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新項(xiàng)目（2022L501，2021L487）；晉中學(xué)院“百億工程”天然產(chǎn)物開發(fā)利用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)培育項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介 李平（1983—），女，山西大同人，副教授，博士，從事微生物學(xué)及天然產(chǎn)物活性研究。*通信作者，副教授，博士，從事天然產(chǎn)物活性研究。

收稿日期 2024-05-05

南方紅豆杉（Taxus chinensis var.mairei Cheng et L.K.Fu）是常綠喬木，為我國一級(jí)瀕危保護(hù)植物，主要分布于我國陜西、河南、江西、廣西、福建等省（區(qū)）^［1］。山西省是南方紅豆杉在我國自然分布的最北界，主要位于太行山南段以及中條山東端區(qū)域，海拔750～1 000 m的濕潤山坡及水流旁^［2］。研究發(fā)現(xiàn)，紅豆杉屬植物含有多種藥理活性成分，如紫杉醇、槲皮素、紅豆杉多糖、紫杉?jí)A、胡蘿卜甾醇等。其中，紫杉醇是經(jīng)典的高效抗癌化合物，在20世紀(jì)90年代初已被美國食品藥品監(jiān)督管理局正式批準(zhǔn)為新抗癌藥物，但是，由于其在紅豆杉屬植株中的含量極低，無法滿足市場(chǎng)需求^［3］。因此，尋找新的紫杉醇等具有重要藥理活性的天然化合物資源成為當(dāng)前抗腫瘤新藥研發(fā)領(lǐng)域的重要科學(xué)任務(wù)。

植物內(nèi)生菌是一類在其生活史的某個(gè)或全部時(shí)期定殖于植物的組織和器官內(nèi)的微生物，宿主植物無明顯的感染癥狀，細(xì)菌、真菌和放線菌是其主要類群^［4］。在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，由于植物細(xì)胞內(nèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因發(fā)生水平轉(zhuǎn)移^［5］等因素，部分內(nèi)生菌具備了產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的化合物的能力。Li等^［6］從南方紅豆杉根部分離了一株內(nèi)生真菌IRB54，能夠產(chǎn)生10-DABⅢ（10-脫乙?；鶟{果赤霉素Ⅲ），可作為半合成生產(chǎn)紫杉醇的替代資源；陳淑娟等^［7］從南方紅豆杉內(nèi)生青霉菌Penicillum sp.H⑥.1 發(fā)酵產(chǎn)物中分離出了震顫毒素Penitrem A，可抑制黑色素瘤細(xì)胞A375；張盼盼等^［8］分離得到了111株南方紅豆杉內(nèi)生和根際放線菌，以腫瘤細(xì)胞株SGC-7901和NCI-H460為檢測(cè)對(duì)象，在抑制率超過40%的內(nèi)生放線菌中，內(nèi)生菌占44.4%。因此，南方紅豆杉內(nèi)生真菌和內(nèi)生放線菌是抗腫瘤天然產(chǎn)物的潛在資源庫，但是，目前鮮見在內(nèi)生細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的菌株。該研究以產(chǎn)自山西省東南部的南方紅豆杉植株為材料，獲得了一株能夠產(chǎn)生抗腫瘤有效物質(zhì)的內(nèi)生細(xì)菌，并對(duì)其活性進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試材與試劑。

南方紅豆杉植株樣本采自山西省晉城市陵川縣南方紅豆杉種植基地。胃癌細(xì)胞系MGC-803購買于武漢博士德生物工程有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI Medium 1640、胎牛血清（FBS）和TRIzol試劑購買于賽默飛世爾科技公司。二甲基亞砜（DMSO）、噻唑藍(lán)（MTT）和絲裂霉素C（Mitomycin C）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。溴化十六烷基三甲銨（CTAB）購買于北京索萊寶科技有限公司。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購買于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。SYBR Premix Ex Taq^TM GC和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購買于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-5ZAA（上海亞榮生化儀器廠）；高壓蒸汽滅菌鍋（日本TOMY SEIKO公司）；倒置顯微鏡CKX41-C31BF（奧林巴斯株式會(huì)社）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀Cellometer Auto1000［耐細(xì)隆生物儀器（上海）有限公司］；CO細(xì)胞培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司）；iMark酶標(biāo)儀［伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司］；高速冷凍離心機(jī)（日本日立公司）；流式細(xì)胞儀［碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司］；StepOne Plus 型實(shí)時(shí)定量PCR儀（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 南方紅豆杉內(nèi)生細(xì)菌的分離。

取新鮮的南方紅豆杉植株的枝條，用自來水沖洗干凈，再在超凈工作臺(tái)中用無菌蒸餾水洗滌3次，在75%乙醇溶液中浸泡殺菌1 min，用無菌蒸餾水清洗3次，在0.1% HgCl溶液中浸沒處理5 min，最后用無菌水洗滌3次。將最后一次洗滌后的無菌水涂布于平板培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，以確定南方紅豆杉植株表面消毒是否徹底。用無菌濾紙吸取樣本上的多余水分，用無菌手術(shù)刀將南方紅豆杉的枝條切成小塊（0.5 cm×0.5 cm），置于培養(yǎng)基上，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)，觀察平板上的菌落形態(tài)和數(shù)量。挑取單菌落劃線培養(yǎng)，并多次重復(fù)，以純化內(nèi)生菌株。

1.2.2 南方紅豆杉內(nèi)生細(xì)菌的分子鑒定。

采用CTAB法提取細(xì)菌基因組DNA，步驟如下：收集適量菌體于1.5 mL離心管中，加入250 μL TE緩沖液重懸菌體，加入20 μL 10%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液混勻后，依次加入10 μL溶菌酶（20 mg/mL）和10 μL RNA酶，然后于37 ℃條件下水浴1 h；依次加入80 μL NaCl溶液（5 mol/L）和50 μL CTAB溶液，緩慢混勻后，置于65 ℃恒溫孵育10 min；加入500 μL苯酚/氯仿/異戊醇溶液（25∶24∶1），緩慢混勻后，12 000 r/min離心5 min，小心吸取上清液，重復(fù)2～3次，合并上清液；加入500 μL的氯仿/異戊醇（24∶1），緩慢混勻后，12 000 r/min離心5 min，小心吸取上清液，加入等體積異丙醇，緩慢顛倒數(shù)次，置于-20 ℃下20 min，12 000 r/min離心5 min，沉淀即為DNA；加入70%乙醇漂洗，12 000 r/min離心2 min，棄去上清，重復(fù)2次后，將管中殘余乙醇揮發(fā)完全，加入TE緩沖液充分溶解，然后保存于-20 ℃條件下備用。

以細(xì)菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增16S rDNA序列，引物序列為F8（5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和R1492（5′-CGGCTACCTTGTTACGAC-3′）。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃，7 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、膠回收和測(cè)序，將序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST分析，選擇相似性高的序列，然后利用Mega 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 南方紅豆杉內(nèi)生細(xì)菌的發(fā)酵及萃取。

將南方紅豆杉內(nèi)生細(xì)菌HDSW接種于LB液體培養(yǎng)基，于28 ℃下?lián)u床培養(yǎng)5 d，離心收集上清液。利用石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行順序萃取，步驟如下：將發(fā)酵上清液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入相同體積的石油醚，

充分混勻后靜置3 h，收集石油醚相，對(duì)水層重復(fù)萃取2次，合并石油醚相；向水相中加入等體積乙酸乙酯，充分混勻后靜置3 h，收集乙酸乙酯相，對(duì)水層重復(fù)萃取2次，合并乙酸乙酯相；分別對(duì)石油醚相和乙酸乙酯相進(jìn)行減壓濃縮，干燥后，分別獲得提取物，經(jīng)DMSO溶解后，配制濃度為100 mg/mL儲(chǔ)液。

1.2.4 MTT試驗(yàn)。

參照前期報(bào)道的方法^［9］進(jìn)行試驗(yàn)，步驟如下：將MGC-803細(xì)胞接種于96孔板中（5×10³個(gè)/孔），置于37 ℃、5%CO條件下孵育，細(xì)胞完全貼壁后，加入相應(yīng)濃度的無菌發(fā)酵上清液或有機(jī)試劑提取物DMSO溶液，繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間，再加入終體積10%的MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)孵育4 h后，棄去培養(yǎng)基，加入200 μL DMSO，避光混勻10 min后，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。對(duì)于處理0 h的孔，則在細(xì)胞完全貼壁后，立即加入MTT溶液，待孵育4 h 后，棄去培養(yǎng)基，加入200 μL DMSO混勻充分，測(cè)定OD值。

1.2.5 細(xì)胞集落形成試驗(yàn)。

參照前期報(bào)道的方法^［9］進(jìn)行試驗(yàn)，步驟如下：將MGC-803細(xì)胞接種于6孔板中（3×10²個(gè)/孔），置于37 ℃、5%CO條件下孵育，細(xì)胞完全貼壁后，加入終濃度10 mg/mL的不同有機(jī)溶劑提取物溶液，繼續(xù)培養(yǎng)10 d，每隔3 d更換細(xì)胞培養(yǎng)液，并添加對(duì)應(yīng)濃度的有機(jī)溶劑提取物溶液。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液漂洗后，利用甲醇固定，再用0.2%結(jié)晶紫溶液染色，棄去液體，即可觀察和拍照。

1.2.6 細(xì)胞黏附試驗(yàn) 。

參照前期報(bào)道的方法^［9］進(jìn)行試驗(yàn)，步驟如下：分別用終濃度10 mg/mL石油醚和乙酸乙酯的提取物處理MGC-803細(xì)胞72 h后，將其接種于96孔板中（1×10⁵個(gè)/孔），繼續(xù)孵育30 min后，棄去培養(yǎng)液，用37 ℃預(yù)熱的PBS溶液洗滌細(xì)胞3次，加入含有終體積10%MTT溶液（5 mg/mL）的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育4 h后，去掉培養(yǎng)基，加入200 μL DMSO，充分溶解后，檢測(cè)OD值，評(píng)估黏附細(xì)胞的數(shù)量。

1.2.7 劃痕試驗(yàn)。

參照前期報(bào)道的方法^［9］進(jìn)行試驗(yàn)，步驟如下：將細(xì)胞接種于12孔板中（5×10⁴個(gè)/孔），待細(xì)胞完全貼壁后，分別加入終濃度10 mg/mL的有機(jī)溶劑提取物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞匯合率達(dá)到95%左右，用25 μg/mL Mitomycin C處理1 h后，進(jìn)行劃痕處理、拍照，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，再次拍照，利用Image-Pro Plus Version 6.0軟件測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算遷移率。

1.2.8 細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MGC-803細(xì)胞，以5×10⁵個(gè)/孔接種于35 mm直徑的培養(yǎng)皿中，用終濃度均為10 mg/mL的石油醚提取物和乙酸乙酯提取物的DMSO溶液處理48 h后，利用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒處理細(xì)胞后，在流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.9 實(shí)時(shí)定量PCR。

用終濃度均為10 mg/mL的石油醚和乙酸乙酯提取物處理MGC-803細(xì)胞48 h后，利用TRIzol 試劑提取總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。利用表1中所列的引物，利用SYBR^? Premix Ex Taq^TM GC試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用GraphPad Prism 5.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及作圖，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株HDSW形態(tài)特征

將菌株HDSW接種于LB固體平板，在28 ℃恒溫培養(yǎng)，如圖1所示，菌落顏色為不透明的乳白色，形狀不規(guī)則，表面不光滑、有褶皺。

2.2 菌株HDSW的分子生物學(xué)鑒定

將16S rDNA測(cè)序序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)，利用Mega 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），聚類結(jié)果表明菌株HDSW屬于芽孢桿菌屬（Bacillus pumilus）。

2.3 菌株HDSW發(fā)酵上清液對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803的抑制活性

將菌株HDSW接種于LB液體培養(yǎng)基，在28 ℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)5 d后，離心并收集上清液，過濾除菌后，按照體積比10%加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，進(jìn)行MTT試驗(yàn)。結(jié)果如圖3所示，在初始細(xì)胞數(shù)量相同的情況下，經(jīng)HDSW菌株發(fā)酵液處理24 h后，細(xì)胞數(shù)量（OD值）明顯低于對(duì)照細(xì)胞（P<0.01），隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，分別在48、72、96和120 h處檢測(cè)OD值，均存在顯著差異（P<0.01），表明HDSW菌株發(fā)酵液能夠明顯抑制胃癌細(xì)胞MGC-803的生長(zhǎng)。

2.4 菌株HDSW發(fā)酵液有機(jī)溶劑提取物對(duì)MGC-803細(xì)胞的抑制活性

2.4.1 對(duì)MGC-803細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

分別利用石油醚和乙酸乙酯提取菌株HDSW的發(fā)酵液，通過減壓蒸餾及干燥后獲得固體提取物，經(jīng)DMSO溶解后，檢測(cè)終濃度10 mg/mL的提取物對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803的抑制作用。結(jié)果如圖4所示，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，與對(duì)照相比，石油醚提取物不能抑制細(xì)胞的增殖，而乙酸乙酯提取物則在細(xì)胞培養(yǎng)24 h時(shí)即顯示出顯著的抑制活性（P<0.05），在48和72 h時(shí)差異極顯著（P<0.01）。

2.4.2 對(duì)MGC-803細(xì)胞集落形成的影響。

通過平板集落形成試驗(yàn)，分別檢測(cè)了菌株HDSW發(fā)酵液的石油醚和乙酸乙酯提取物對(duì)MGC-803細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照細(xì)胞相比，石油醚提取物不能明顯抑制細(xì)胞集落的形成，乙酸乙酯提取物處理組則未見細(xì)胞集落，表明菌株HDSW發(fā)酵液中抑制MGC-803細(xì)胞生長(zhǎng)的活性物質(zhì)可被乙酸乙酯提取，卻不能被石油醚提取。

2.4.3 對(duì)細(xì)胞黏附的影響。

以終濃度均為10 mg/mL的石油醚和乙酸乙酯提取物處理MGC-803細(xì)胞72 h，黏附試驗(yàn)結(jié)果（圖6）顯示，石油醚提取物不影響細(xì)胞的黏附，乙酸乙酯提取物則顯著減少了黏附細(xì)胞的數(shù)量（P<0.01），表明在乙酸乙酯提取物中存在抑制MGC-803細(xì)胞黏附能力的化合物。

2.4.4 對(duì)細(xì)胞遷移的影響。

通過細(xì)胞劃痕試驗(yàn)，檢測(cè)菌株HDSW發(fā)酵液的石油醚和乙酸乙酯提取物對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803遷移的影響，結(jié)果如圖7所示。從圖7可以看出，在細(xì)胞劃痕12 h后，與對(duì)照組相比較，石油醚提取物能夠顯著抑制細(xì)胞的遷移（P<0.01），而乙酸乙酯提取物的抑制能力強(qiáng)于石油醚提取物（P<0.01），表明菌株HDSW發(fā)酵液中存在能夠抑制胃癌細(xì)胞MGC-803遷移運(yùn)動(dòng)能力的有效成分，石油醚和乙酸乙酯均能夠提取出上述活性物質(zhì)，而且乙酸乙酯的提取效果明顯強(qiáng)于石油醚。

2.4.5 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。

通過annexin V-FITC/PI雙染法，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)菌株HDSW發(fā)酵液不同提取物處理的MGC-803細(xì)胞，分析菌株HDSW發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果如圖8所示。對(duì)照組、石油醚組和乙酸乙酯組的凋亡率分別為6.12%、6.48%、22.21%。與對(duì)照組相比，石油醚提取物不能導(dǎo)致MGC-803細(xì)胞凋亡（P>0.05），而乙酸乙酯提取物則可顯著提高該細(xì)胞的凋亡率（P<0.01）。上述結(jié)果表明，菌株HDSW產(chǎn)生了能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞MGC-803凋亡的次級(jí)代謝產(chǎn)物，且可被乙酸乙酯提取，但不能被石油醚提取。

2.4.6 對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。

通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況，探討菌株HDSW代謝產(chǎn)物抑制胃癌細(xì)胞MGC-803的分子機(jī)制。結(jié)果如圖9所示，與對(duì)照相比，乙酸乙酯提取物能夠顯著提高抑癌基因p53（P<0.01）、凋亡促進(jìn)基因Bax（P<0.01）和凋亡相關(guān)基因Caspase 3（P<0.01）的表達(dá)水平，卻顯著降低凋亡拮抗基因Bcl-2（P<0.01）的表達(dá)。因此，菌株HDSW發(fā)酵液中存在的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)化合物能夠影響凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。3 討論與結(jié)論

近年來，從藥用植物中篩選能夠產(chǎn)生藥理活性成分的內(nèi)生菌逐漸受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，而且一些最初被認(rèn)為是藥用植物所產(chǎn)生的有效成分實(shí)際上是由其內(nèi)生菌所產(chǎn)生，或者與內(nèi)生菌的代謝活動(dòng)密切相關(guān)^［10］。因此，植物內(nèi)生菌可能是獲得有價(jià)值的藥用化合物的重要資源，從其次級(jí)代謝物中分離新的活性成分或先導(dǎo)化合物是新藥研發(fā)的重要途徑^［11］。紅豆杉屬因其能夠產(chǎn)生高效抗癌藥物紫杉醇備受關(guān)注，但是存在產(chǎn)量極低且資源嚴(yán)重不足的局限，其內(nèi)生微生物成為人們尋找新的抗癌藥物的重要目標(biāo)。目前，針對(duì)紅豆杉內(nèi)生真菌的研究較多，但是關(guān)于其內(nèi)生細(xì)菌卻未受到相應(yīng)的重視，相關(guān)研究鮮見報(bào)道。該研究從生長(zhǎng)于山西省東南部的南方紅豆杉中分離得到了一株內(nèi)生細(xì)菌HSDW，經(jīng)16S rDNA序列比對(duì)鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus pumilus），以胃癌細(xì)胞MGC-803為測(cè)試對(duì)象，證實(shí)該菌株發(fā)酵液具有良好的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的活性。因此，南方紅豆杉內(nèi)生細(xì)菌也可能是另一個(gè)篩選抗癌藥物的潛在資源。

增殖失控和遷移運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)是惡性腫瘤細(xì)胞的主要特征，也是其發(fā)展和擴(kuò)散的直接原因。抑制細(xì)胞分裂、阻滯細(xì)胞周期、降低細(xì)胞侵襲能力、觸發(fā)細(xì)胞凋亡、干擾增殖相關(guān)基因表達(dá)等是抗癌藥物控制腫瘤生長(zhǎng)的主要方面。腫瘤擴(kuò)散的直接原因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，涉及細(xì)胞脫落、遷移、侵襲、黏附等步驟，是一個(gè)由多基因調(diào)控的多階段過程^［12］，因此可能存在多個(gè)潛在的藥物靶點(diǎn)。因此，抑制細(xì)胞增殖和遷移能力，控制腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲，是藥物抗腫瘤的重要機(jī)制。Kusari等^［13］研究表明，美登木根部?jī)?nèi)生菌通過將安薩米托素P3轉(zhuǎn)化為美登素，成為美登素的主要生產(chǎn)源，美登素被宿主植物獲取進(jìn)而發(fā)揮抵御病原體的作用。Zhang等^［14］從藥用植物的種子分離出了大量?jī)?nèi)生菌，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)它們能夠產(chǎn)生抑制腺苷脫氨酶（ADA）活性的次級(jí)代謝物，具有抑制淋巴組織增生紊亂和癌癥的潛在作用；例如，產(chǎn)自旋孢腔菌（Cochliobolus sp.）的5-hydroxy-2-hydroxymethyl-4H-pyran-4-one可能非特異性結(jié)合ADA的活性部位，進(jìn)而發(fā)揮抑制作用。麥克歐文文殊蘭的內(nèi)生不動(dòng)桿菌（Guillouiae）的粗提物在12.5、6.25、3.13 μg/mL 的濃度下均可抑制50％惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG的生長(zhǎng)^［15］。該研究證實(shí)，南方紅豆杉內(nèi)生菌株HDSW的乙酸乙酯提取物能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞MGC-803的增殖和集落形成能力，既抑制了該細(xì)胞的生長(zhǎng)和黏附，又干擾了該細(xì)胞的遷移能力，因此，菌株HDSW的乙酸乙酯提取物抑制了胃癌細(xì)胞MGC-803的生長(zhǎng)和遷移。

p53是經(jīng)典的抑癌基因，在惡性腫瘤細(xì)胞中常出現(xiàn)表達(dá)異常降低，參與了細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡等生理過程^［16］。BCL-2家族蛋白主要通過影響線粒體膜通透性參與調(diào)控細(xì)胞程序性死亡^［17］。Bax的激活是線粒體依賴的凋亡途徑不可缺失的步驟，促進(jìn)線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，激活caspase 3等凋亡相關(guān)蛋白，觸發(fā)細(xì)胞凋亡信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大^［18］。該研究證實(shí)菌株HDSW發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物可顯著增強(qiáng)p53、Bax和Caspase 3的表達(dá)，抑制Bcl-2的表達(dá)，從而促進(jìn)MGC-803細(xì)胞的凋亡過程。

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