激素及pH對大蒜愈傷組織誘導(dǎo)研究

摘要 探討大蒜愈傷組織誘導(dǎo)及增殖分化的影響因素，建立大蒜愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及器官分化的培養(yǎng)體系。結(jié)果表明，適合大蒜愈傷組織誘導(dǎo)及增殖的培養(yǎng)基激素濃度及pH為2 mg/L NAA，2 mg/L 6-BA，1 mg/L 2，4-D和pH 5.8；蒼山蒜愈傷組織出芽分化的最佳培養(yǎng)基激素濃度及pH為1 mg/L NAA，3 mg/L 6-BA，pH 5.8；蘇聯(lián)蒜愈傷組織出芽分化的最佳培養(yǎng)基激素濃度及pH為2 mg/L NAA，2 mg/L 6-BA，pH 6.1；蒼山蒜和蘇聯(lián)蒜愈傷組織生根分化的最佳培養(yǎng)基激素濃度及pH均為1 mg/L NAA，pH 5.8，表明高濃度的2，4-D有利于大蒜愈傷組織的誘導(dǎo)，但并不利于其分化。

關(guān)鍵詞 大蒜；組織培養(yǎng)；愈傷組織；激素；pH

中圖分類號 S633.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）19-0041-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.19.009

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on the Induction of Garlic Callus by Hormones and pH

YU Da-sheng¹， MA Lin²， ZHENG Ze-rong¹ et al

（1.Laiwu Vocational and Technical College， Jinan，Shandong 271100;2.Shandong Agricultural University， Taian， Shandong 271018）

Abstract The factors that affected callus induction， multiplication and organ differentiation of garlic were explored and the high efficient regeneration system was established. The hormone concentration and pH value of the culture medium suitable for garlic callus induction and proliferation were selected： 2 mg/L NAA，2 mg/L 6-BA，1 mg/L 2，4-D and the pH of the medium was 5.8. The hormone concentration and pH value of the culture medium suitable for garlic callus organ differentiation were selected. The optimal medium hormone concentration and pH value for callus differentiation of Cangshan garlic were 1 mg/L NAA，3 mg/L 6-BA and the pH of the medium was 5.8. The optimal medium concentration and pH value for callus differentiation of Soviet garlic were 2 mg/L NAA，2 mg/L 6-BA and the pH of the medium was 6.1. The optimal medium concentration and pH value for callus rooting and differentiation of two varieties are 1 mg/L NAA and pH 5.8. Research has also shown that high concentrations of 2，4-D were beneficial for the induction of garlic callus， but not for its differentiation.

Key words Garlic;Tissue culture;Callus tissue;Hormone;pH

基金項目 山東省農(nóng)業(yè)良種產(chǎn)業(yè)化重點項目“多倍體大蒜新品種培育”；國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（200903018）。

作者簡介 于大勝（1974—），男，遼寧法庫人，副教授，碩士，從事植物育種、植物保護(hù)研究。*通信作者，教授，從事蔬菜生物學(xué)研究。

收稿日期 2023-10-17

大蒜引入我國馴化栽培已有2 000多年的歷史，具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值，尤其是大蒜素（蒜氨酸）經(jīng)蒜氨酸酶作用形成的揮發(fā)性硫化物，使大蒜具有殺菌、抗癌、抗衰老等作用和獨(dú)特的大蒜風(fēng)味。大蒜適應(yīng)能力較強(qiáng)，在我國各地都有栽培，包括山東萊蕪、金鄉(xiāng)、蒼山，江蘇射陽、太倉，安徽亳州、來安等。我國是世界上最大的大蒜生產(chǎn)國和消費(fèi)國，也是出口創(chuàng)匯大國，總栽培面積30萬hm²，干蒜頭總產(chǎn)量500余萬t，約占全世界總產(chǎn)量的2/3。

大蒜植株再生有2條主要途徑，即愈傷組織途徑和不定芽途徑，外植體的取材部位不同，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的能力也不相同，產(chǎn)生的愈傷組織在質(zhì)地、形態(tài)、顏色、細(xì)胞組成及分化能力上也有明顯差異。用于大蒜組織培養(yǎng)的外植體范圍較廣，葉片^［1-2］、鱗莖^［3］、莖盤^［4］、莖尖^［5］、根尖^［6］、總苞及花藥^［7-9］等器官都已獲得了大蒜再生植株。

植物細(xì)胞進(jìn)行脫分化產(chǎn)生愈傷組織及愈傷組織去分化形成器官，都必須依賴植物激素，它們能夠誘導(dǎo)外植體細(xì)胞重新進(jìn)入分裂狀態(tài)。研究表明，同一種激素對不同植物產(chǎn)生的效果不同，因此，培養(yǎng)基必須根據(jù)不同的植物添加適宜種類和濃度的植物激素^{［4，10-14］}，才能獲得最佳的培養(yǎng)效果。筆者在前人工作的基礎(chǔ)上，采用不同來源的愈傷組織，探討激素種類及pH對建立大蒜植株再生體系的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試大蒜品種為“蒼山蒜”“蘇聯(lián)蒜”“二水早”及“金蒜3號”。試驗在萊蕪職業(yè)技術(shù)學(xué)院和山東農(nóng)業(yè)大學(xué)開放實驗室中進(jìn)行。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體選取。

葉片獲取：生長健壯大蒜植株，經(jīng)洗滌、沖洗、乙醇和升汞消毒處理后，于無菌操作臺剔除葉脈，切取0.5 cm² 的葉片接種于培養(yǎng)基。

鱗莖獲?。鹤匀恍菝叩拇笏猓x取無病無霉變無傷疤的蒜瓣，去除外層保護(hù)葉，切除蒜瓣基部褐色蒜踵，流水沖洗30～50 min后，用體積比70％的乙醇消毒30 s，然后用 0.1％的升汞消毒15 min，無菌水沖洗5～6次。切取蒜瓣中部厚度為0.3～0.4 cm，先劃十字后再切割成 0.5 cm² 的外植體于無菌操作臺接種。

莖尖獲取：蒜瓣剝?nèi)ネ饷骥[葉，經(jīng)洗滌、沖洗、乙醇和升汞消毒處理后于無菌操作臺切取0.5 cm的莖尖末端接種于培養(yǎng)基。

根尖獲?。簾o霉無傷疤大蒜鱗莖嚴(yán)格消毒后，接種于由瓊脂制成的培養(yǎng)基，待根長至1 cm左右時，無菌條件下切取根尖接種于培養(yǎng)基。

1.2.2 培養(yǎng)條件。

基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、1/2MS培養(yǎng)基及B培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基均附加30 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂，所有培養(yǎng)基均調(diào)節(jié)pH 5.8～6.2，121 ℃高壓滅菌20 min。按既定方案，各培養(yǎng)基均添加不同濃度和比例的植物激素NAA、6-BA及2，4-D，用于篩選適合大蒜愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、出芽培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。各處理均在溫度（25±1）℃培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光照時間為16 h/d。

1.2.3 大蒜愈傷組織誘導(dǎo)、增殖、出芽和生根培養(yǎng)基的篩選。

選取的植物生長激素分別為NAA、6-BA和2，4-D，pH設(shè)定為5.5、5.8和6.1，采用正交設(shè)計L（3⁴）方案。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體類型對大蒜愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以蒼山蒜的葉片、鱗莖、莖尖和根尖為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，30 d后統(tǒng)計誘導(dǎo)率，結(jié)果見表1。由表1可知，培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件相同時，各外植體的出愈時間及誘導(dǎo)率差異較大。其中鱗莖的出愈時間最短，平均出愈時間為 11 d，且誘導(dǎo)率最高。莖尖的誘導(dǎo)率因其細(xì)胞分裂活動旺盛也較高，4種外植體材料中葉片與根尖的誘導(dǎo)率則較低。經(jīng)方差分析可知，4種外植體的誘導(dǎo)率均差異極顯著，因此外植體類型對大蒜誘導(dǎo)率影響效果顯著。

盡管鱗莖和莖尖的誘導(dǎo)率都較高，且出愈時間短，愈傷組織含水量也低，但莖尖的剝離及消毒較為復(fù)雜，而大蒜鱗莖的取材方便，因此認(rèn)為大蒜鱗莖是愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體。

2.2 培養(yǎng)基類型對大蒜愈傷組織誘導(dǎo)的影響

選取MS、1/2MS、B 3種培養(yǎng)基，通過分析其成分對大蒜愈傷組織誘導(dǎo)的影響，尋求大蒜愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間為30 d，每種培養(yǎng)基中均添2 mg/L NAA、2 mg/L 6-BA和1 mg/L 2，4-D，pH設(shè)定為5.8。

由表2可知，MS培養(yǎng)基出愈時間最短，為12 d，且誘導(dǎo)率最高，達(dá)74.45%，與B和1/2MS培養(yǎng)基差異極顯著，這說明培養(yǎng)基成分對大蒜鱗莖愈傷組織誘導(dǎo)影響較大。B培養(yǎng)基雖誘導(dǎo)率較高，但出愈時間較晚，因此選定MS培養(yǎng)基為后續(xù)試驗的培養(yǎng)基類型。

2.3 激素種類及pH對大蒜愈傷組織誘導(dǎo)的影響

選取蒼山蒜和蘇聯(lián)蒜鱗莖為試驗材料，MS為基本培養(yǎng)基，按試驗設(shè)計分別添加不同濃度的NAA、6-BA和2，4-D，調(diào)節(jié)pH為5.5、5.8和6.1，采用L（3⁴）正交試驗設(shè)計9個處理，培養(yǎng)時間為25 d，結(jié)果見表3。

由表3可知，在不添加任何植物激素情況下，愈傷組織誘導(dǎo)率都極低；對2個大蒜品種正交極差分析表明各因素對2個大蒜品種鱗莖愈傷組織誘導(dǎo)率的影響作用相同，均為pH＞6-BA＞2，4-D＞NAA。在添加植物激素的處理中，以MS+2 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA+1 mg/L 2，4-D這一組合愈傷組織誘導(dǎo)率最高，且各激素配比及pH對2個品種大蒜的影響結(jié)果一致。相同條件下，雖然蒼山蒜的誘導(dǎo)率普遍高于蘇聯(lián)蒜，但差異不顯著。這說明大蒜愈傷組織的誘導(dǎo)需要植物激素的參與。由此認(rèn)為，蒼山蒜和蘇聯(lián)蒜的最佳培養(yǎng)基激素配比及pH為2 mg/L NAA，2 mg/L 6-BA，1 mg/L 2，4-D和pH為5.8。

2.4 激素種類及pH對大蒜愈傷組織增殖的影響

將試驗誘導(dǎo)出的愈傷組織在不同植物激素配比及不同pH的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計愈傷組織的生長狀況，以生長量及增殖倍數(shù)表示，通過正交試驗進(jìn)行極差分析，結(jié)果見表4。由表4可知，雖然蒼山蒜愈傷組織的增殖橫向比較總體優(yōu)于蘇聯(lián)蒜，但差異不大；縱向比較結(jié)果顯示，2，4-D不僅不促進(jìn)愈傷組織的增殖，反而明顯抑制愈傷組織的增殖，說明2，4-D雖然有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，但不利于愈傷組織的增殖。與NAA相比，6-BA對愈傷組織繼代增殖的效果更好。與大蒜愈傷組織誘導(dǎo)獲得的結(jié)果不同，2個品種大蒜愈傷組織增殖的最佳培養(yǎng)基配方稍有差異，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能與種屬特性有關(guān)，需進(jìn)一步探討。

2.5 激素種類及pH對大蒜愈傷組織芽分化的影響

將繼代2～3次的黃色致密的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，設(shè)計正交試驗并于30 d后統(tǒng)計，結(jié)果見表5。由表5可知，愈傷組織的分化受培養(yǎng)基中激素種類和濃度的影響很大，雖然2個品種的最大出芽率出現(xiàn)在2個不同的處理中，但它們有一個共同特征，即2個處理均含有較高濃度的6-BA，這說明6-BA是影響愈傷組織芽分化的重要促進(jìn)因素。3種植物激素中NAA對愈傷組織芽分化的影響較小，不占主導(dǎo)地位；比較2個處理的pH，發(fā)現(xiàn)蒼山蒜最適合于芽分化的pH為5.8，而蘇聯(lián)蒜最適宜pH則為6.1。

2.6 激素種類及pH對大蒜愈傷組織根分化的影響

將分化出芽的愈傷組織轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，設(shè)計正交試驗，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計，結(jié)果見表6。

由表6可知，大蒜愈傷組織根分化率總體不高，這可能與大蒜的種屬特異性有關(guān)，因為大蒜屬于較難再生植物，愈傷組織脫分化再生為完整植株的能力不強(qiáng)。比較各處理發(fā)現(xiàn)，2，4-D濃度較高時，蒼山蒜和蘇聯(lián)蒜的根分化率均很低，因此可以判定2，4-D對愈傷組織的根分化有抑制作用，且抑制效果顯著。

3 結(jié)論與討論

建立大蒜組織培養(yǎng)再生體系，需要考慮大蒜品種、外植體類型、培養(yǎng)基配方及激素種類、濃度及配比等因素。該研究結(jié)果顯示，蒼山蒜是大蒜組織培養(yǎng)理想品種。大蒜鱗莖是理想的外植體取材。MS培養(yǎng)基是理想的培養(yǎng)基類型。

激素在大蒜愈傷組織誘導(dǎo)及增殖過程中不可缺少，其中2，4-D在大蒜愈傷組織誘導(dǎo)中起關(guān)鍵作用；6-BA在愈傷組織分化階段起重要的誘導(dǎo)作用；NAA在愈傷組織誘導(dǎo)階段與2，4-D的疊加作用不可忽視，其在組織分化階段的作用不顯著。

不同植物來源形成的愈傷組織，在質(zhì)地、形態(tài)、顏色等物理性狀方面均有明顯差異。由于遺傳類型、生長發(fā)育對光溫要求不同，建立大蒜再生體系的難易程度因不同大蒜品種而存在一定的差異。

植物激素是影響植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵因素，其影響植物離體器官發(fā)生，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中激素的種類和濃度，可獲得各種器官的離體發(fā)生，已成為提高愈傷組織誘導(dǎo)與分化頻率的有效手段。對多數(shù)植物材料的培養(yǎng)而言，2，4-D是誘導(dǎo)愈傷組織最有效的植物激素，一般用于愈傷組織誘導(dǎo)階段^{［4，15-16］}。在具體試驗中，激素的種類、濃度和組合十分錯綜復(fù)雜，形成器官的類型被培養(yǎng)基中不同激素的相對濃度控制，而不是這些物質(zhì)的絕對濃度決定的，不同植物愈傷組織的內(nèi)源激素水平引起的^［17］，即愈傷組織莖芽的分化，除在培養(yǎng)基中添加外源激素外，與愈傷組織內(nèi)源激素的含量有一定的關(guān)系，因此以不同植物或同種植物不同發(fā)育時期的材料為外植體，適宜的植物激素種類與濃度不同。

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