CRISPR/Cas9基因編輯及其在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用

摘要：為提高作物產(chǎn)量及品質(zhì)，基因編輯技術(shù)被廣泛應(yīng)用。成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)及關(guān)聯(lián)蛋白（CRISPR/Cas9）系統(tǒng)是細(xì)菌、古細(xì)菌抵御外源物質(zhì)入侵的獲得性免疫系統(tǒng)，是繼鋅指核酸酶（ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TAL）以后的第三代基因編輯技術(shù)。本文就CRISPR/Cas9系統(tǒng)的歷史起源，以及CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因結(jié)構(gòu)，其中包括CRISPR相關(guān)核酸酶（Cas9）、特異性CRISPR RNA（crRNA）以及反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）進(jìn)行概述；同時(shí)對(duì)該系統(tǒng)的作用原理，從間隔序列的獲取階段、表達(dá)階段及免疫干擾階段進(jìn)行綜述；另外對(duì)該系統(tǒng)在功能基因研究、基因組學(xué)篩選等領(lǐng)域，以及農(nóng)業(yè)等相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用方面也展開了討論，并對(duì)其將會(huì)產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)（脫靶效應(yīng)）及解決方法進(jìn)行總結(jié)，以期為農(nóng)作物品種選育及功能基因的挖掘奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas9系統(tǒng)；基因編輯；農(nóng)業(yè)；脫靶效應(yīng)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR Associated Protein 9）是來源于釀膿鏈球菌的Ⅱ型適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，主要存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中，是它們抵御外來物質(zhì)入侵的獨(dú)特機(jī)制[1]。當(dāng)外源物質(zhì)入侵時(shí)，宿主細(xì)胞對(duì)外源物質(zhì)的保守間隔相鄰基序（PAM）進(jìn)行識(shí)別，把外源物質(zhì)的DNA序列整合到自己的序列中；然后，轉(zhuǎn)錄成前體crRNA（pre-crRNA），通過tracrRNA的激發(fā)作用，在Cas9的加工下，得到成熟的crRNA，crRNA和tracrRNA組成向?qū)gRNA來錨定DNA，Cas9在sgRNA指導(dǎo)下對(duì)靶向DNA進(jìn)行切割，使基因組DNA雙鏈斷裂（Double-Strand Breaks，DSBs），從而進(jìn)行DNA修復(fù)，CRISPR/Cas9主要通過非同源末端連接（NHEJ）和同源重組（HR）進(jìn)行修復(fù)[2-4]，也可通過微同源末端連接（MMEJ，Microhomology-Mediatedend Joining）和單鏈退火（Single-Strand Annealing，SSA）等非同源重組途徑進(jìn)行修復(fù)。與傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)相比，此修復(fù)能力賦予該系統(tǒng)效率高、方便快捷、周期短等優(yōu)點(diǎn)。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生命科學(xué)研究等各個(gè)領(lǐng)域[5]。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)精確控制基因以提高作物產(chǎn)量、品質(zhì)及對(duì)各種環(huán)境脅迫的耐受性是育種家長期追求的目標(biāo)[6]。有研究發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9編輯的AGROS8基因提高了玉米的抗旱性[7]。另有研究通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)番茄SiJaz2基因進(jìn)行敲除，使番茄對(duì)細(xì)菌斑點(diǎn)病有較強(qiáng)抗性[8]。另外，基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，通過突變的方式形成dCas9蛋白，dCas9蛋白通過與轉(zhuǎn)錄激活與抑制因子結(jié)合來調(diào)控基因表達(dá)，即CRISPR干擾與激活技術(shù)（CRISPRi/CRISPRa）。有研究應(yīng)用CRISPR干擾與激活技術(shù)成功構(gòu)建了發(fā)酵效率更高的纈氨酸生產(chǎn)菌[9]，這種新型、特異性強(qiáng)的基因編輯技術(shù)，對(duì)功能缺失與獲得研究方面意義深遠(yuǎn)。兩種技術(shù)相互補(bǔ)充，不僅能分析基因功能，獲得全面的結(jié)果分析，也能使篩選結(jié)果更加準(zhǔn)確，為研制相應(yīng)藥物進(jìn)行基因治療打下基礎(chǔ)[10]。同時(shí)，基于高通量CRISPR篩選技術(shù)，也能更好地研究植物基因工程育種，進(jìn)而造福于人類[11]。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因敲入、敲除構(gòu)建突變體并在作物育種改良中應(yīng)用廣泛，CRISPR/Cas9系統(tǒng)中Cas9與sgRNA復(fù)合體識(shí)別特異序列，并實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)的切割后，通過同源重組（HR）和非同源末端連接（NHEJ）兩種修復(fù)機(jī)制，在連接重組過程中實(shí)現(xiàn)基因敲入與敲除[12]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯高效、快速且應(yīng)用廣泛的同時(shí)，也存在的脫靶效應(yīng)，給研究者造成巨大的困擾，本文就CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用原理、應(yīng)用、脫靶效應(yīng)及其改進(jìn)方法進(jìn)行綜述。

1CRISPR/Cas系統(tǒng)的起源與基因結(jié)構(gòu)

1.1CRISPR/Cas系統(tǒng)的起源

1987年，日本科研小組在大腸桿菌K12的iap基因側(cè)翼序列中，發(fā)現(xiàn)CRISPR的重復(fù)結(jié)構(gòu)[13]。經(jīng)過不斷研究和探索，在2002年，科學(xué)家為了反映這類重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，將其正式命名為CRISPR[14]。2007年有研究發(fā)現(xiàn)CRISPR的間隔序列是來自質(zhì)?；蚴删w等染色體外的序列，并通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)CRISPR系統(tǒng)能使細(xì)菌等宿主具備獨(dú)特的抵御外來DNA入侵的免疫能力[15]。2008年經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)能阻止外源基因轉(zhuǎn)移，首次用試驗(yàn)證實(shí)CRISPR系統(tǒng)功能[16]。2013年，科研人員發(fā)現(xiàn)CRISPR系統(tǒng)crRNA對(duì)目標(biāo)序列的特異性識(shí)別，引導(dǎo)Cas核酸酶準(zhǔn)確定位目標(biāo)基因并進(jìn)行精確切割這一特性，使CRISPR/Cas系統(tǒng)更廣泛地為人們所熟知[17]。

1.2CRISPR/Cas9的基因結(jié)構(gòu)

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)及關(guān)聯(lián)蛋白（CRISPR/Cas9）系統(tǒng)存在于大約40%的細(xì)菌和90%古生菌基因組中，該系統(tǒng)賦予它們抵御外來DNA入侵的能力。由于CRISPR/Cas基因保守性及位點(diǎn)構(gòu)成不同，目前該系統(tǒng)分為3種類型，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型（表1）[18]，Ⅰ型系統(tǒng)特有的蛋白是Cas3，在系統(tǒng)中負(fù)責(zé)在干擾階段對(duì)外源核酸序列剪切；Ⅱ型系統(tǒng)的Cas9蛋白負(fù)責(zé)剪切外源核酸序列，也參與crRNA的生成；Ⅲ型系統(tǒng)的特有蛋白是Cas10，具體功能有待進(jìn)一步研究。CRISPR/Cas9源于釀膿鏈球菌體內(nèi)，屬于Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)，該系統(tǒng)較簡(jiǎn)單，是由RNA指導(dǎo)的Cas9基因，它主要由特異性CRISPR RNA（crRNA）、CRISPR相關(guān)核酸酶（Cas9）以及反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）3個(gè)基本結(jié)構(gòu)構(gòu)成。

CRISPR序列是由1個(gè)前導(dǎo)序列（Leader）、多個(gè)重復(fù)序列（Repeats）和間隔序列（Spacers）組成。前導(dǎo)序列是具有物種特異性，且位于上游的序列，長度為300～500 bp，其作用類似于啟動(dòng)子。多個(gè)重復(fù)序列被間隔序列隔開呈半回文結(jié)構(gòu)，重復(fù)序列長度為21～48 bp。而間隔序列是外源物質(zhì)入侵后，使細(xì)胞獲得免疫能力，并且能通過這些間隔序列，對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控的作用。

Cas9基因區(qū)位于CRISPR序列區(qū)附近，通常由4～10個(gè)保守基因組成，既可以切割雙鏈DNA，起到DNA核酸酶的作用，也可以加工前體crRNA，使其成為成熟crRNA，它的功能類似于folk酶，但不需要形成二聚體才有活性。Cas9蛋白有兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域，其一是HNH結(jié)構(gòu)域，可以對(duì)DNA序列剪切，該序列與crRNA互補(bǔ)；另一個(gè)是Ruvc結(jié)構(gòu)域，可以對(duì)與crRNA非互補(bǔ)的DNA序列進(jìn)行剪切，經(jīng)過它們的共同作用，使DNA雙鏈產(chǎn)生切口，可能正是因?yàn)镽uvc和HNH這樣的單鏈切割作用機(jī)制，才容易導(dǎo)致突變的發(fā)生[19]。

TracrRNA位于Cas操縱子上游，與CRISPR重復(fù)序列互補(bǔ)，它可以激發(fā)Cas9和相應(yīng)核酸酶對(duì)pre-crRNA進(jìn)行加工，使它成為成熟crRNA[20]。另有研究發(fā)現(xiàn)，只有在tracRNA和crRNA共同存在時(shí)，才能引導(dǎo)Cas9對(duì)外源核酸進(jìn)行剪切，即向?qū)NA（sgRNA）。

2CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用原理及其脫靶效應(yīng)

2.1CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用原理

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌用于抵抗噬菌體和其他病毒侵染的一套免疫系統(tǒng)，當(dāng)細(xì)菌受到病毒攻擊時(shí)，

會(huì)作出以切割破壞外源DNA為目標(biāo)的防御反應(yīng)。CRISPR/Cas系統(tǒng)作為一種可以抵御外來入侵的獨(dú)特機(jī)制，其作用原理主要分為：間隔序列的獲取階段、表達(dá)階段和免疫干擾階段。

2.1.1間隔序列的獲取

宿主細(xì)胞對(duì)外源核酸的識(shí)別和選擇是通過PAM序列識(shí)別的，PAM位于外源核酸間隔序列前體側(cè)翼處，是一段保守短序列，一般長為2～5 bp，釀膿鏈球菌中PAM為NGG序列。當(dāng)外源病毒、質(zhì)?；蚴删w侵染細(xì)菌時(shí)，宿主細(xì)胞通過外源核酸的PAM序列，來對(duì)入侵物質(zhì)進(jìn)行識(shí)別，從而確定其具體位置。然后外源DNA的部分DNA序列，通過非同源重組的方式，被整合到前導(dǎo)序列和重復(fù)序列之間，并隨著重復(fù)序列而復(fù)制，為了保證形成R-S結(jié)構(gòu)，重復(fù)序列的復(fù)制是隨著間隔序列的加入而進(jìn)行的。但該結(jié)構(gòu)并不會(huì)無限制的延伸下去，可通過刪除機(jī)制進(jìn)行調(diào)控[21]。

2.1.2CRISPR/Cas系統(tǒng)的表達(dá)階段

表達(dá)階段包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的加工兩個(gè)過程。首先，在前導(dǎo)序列的調(diào)控下，CRISPR轉(zhuǎn)錄生成pre-crRNA，同時(shí)tracrRNA也被轉(zhuǎn)錄生成，形成pre-crRNA與tracrRNA的復(fù)合物，即雙鏈RNA。然后Cas9和雙鏈RNA特異性內(nèi)切酶RNaseⅢ對(duì)pre-crRNA進(jìn)行切割，該切割是在tracrRNA的激發(fā)作用下加工產(chǎn)生成熟的crRNA[21-22]。

2.1.3免疫干擾階段

經(jīng)加工成熟的crRNA與tracrRNA形成雙鏈的向?qū)NA，并與Cas蛋白結(jié)合成復(fù)合體，當(dāng)相同的外源病毒、質(zhì)粒等再次侵入細(xì)菌時(shí)，Cas9在向?qū)NA（sgRNA）指引下，識(shí)別并結(jié)合靶DNA序列，使其雙鏈解開形成R-loop，并通過Cas9的HNH核酸酶區(qū)和Ruvc核酸區(qū)切割靶基因，使得靶基因PAM位點(diǎn)上游3～8個(gè)堿基處雙鏈斷裂（DSB），從而起到對(duì)宿主菌的保護(hù)作用[23-24]。

雙鏈斷裂后，可引起高度精確的堿基切除修復(fù)機(jī)制對(duì)靶DNA進(jìn)行修復(fù)，主要有以下兩種機(jī)制，一種是非同源末端連接修復(fù)（NHEJ），其引入插入/缺失突變，從而達(dá)到基因敲除的效果。另一種是同源性定向修復(fù)（HDR），主要是將外源基因轉(zhuǎn)入基因同源的序列中，起到基因敲入的效果[25]，這兩種修復(fù)機(jī)制同時(shí)也為遺傳性基因疾病的治療帶來希望。

2.2CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)已成為最有效的基因編輯工具，其應(yīng)用非常廣泛，但是該系統(tǒng)使用時(shí)存在的脫靶效應(yīng)，會(huì)造成假表型現(xiàn)象，從而導(dǎo)致錯(cuò)誤的解釋。研究影響CRISPR/Cas9脫靶因素，并對(duì)其進(jìn)行改造，將為以后的研究做出巨大貢獻(xiàn)[26-28]。

2.2.1影響CRISPR/Cas9脫靶因素

首先，PAM序列是被Cas9識(shí)別的特殊序列，位于外源物質(zhì)3′端，當(dāng)外源物質(zhì)侵入時(shí)，宿主細(xì)胞可以識(shí)別外源物質(zhì)PAM序列，如果PAM序列前17～20個(gè)核苷酸與sgRNA序列相同，那么sgRNA/Cas9復(fù)合物可以結(jié)合在外源序列上，Cas9在外源序列前3個(gè)堿基處，將其斷裂成雙鏈DNA，它的典型序列是NGG，N可以被任何核苷酸替換。另外，PAM近端1～12位堿基被定義為種子區(qū)域，Cas9切割效率由該區(qū)域所決定，故PAM序列的堿基組成、序列長短和種子區(qū)域等都是影響CRISPR/Cas9脫靶因素之一[29]。

其次，sgRNA的結(jié)構(gòu)和其引導(dǎo)序列的長度也是影響脫靶效應(yīng)的因素之一。改變sgRNA本身的結(jié)構(gòu)，可以影響sgRNA的轉(zhuǎn)錄效率，從而對(duì)sgRNA表達(dá)水平和Cas9與sgRNA組合效率產(chǎn)生影響。另外，sgRNA與外源物質(zhì)的PAM序列前17～20個(gè)核苷酸序列互補(bǔ)結(jié)合成雜交鏈，這些核苷酸是sgRNA引導(dǎo)的序列長度，能夠影響sgRNA的穩(wěn)定性，從而對(duì)靶位點(diǎn)的專一性產(chǎn)生影響[30]。

再次，Cas9/sgRNA的豐度是影響脫靶效應(yīng)的重要因素之一。研究表明，過多的Cas9/sgRNA組合物，會(huì)增加sgRNA的錯(cuò)配程度。Cas9與種子區(qū)域序列的親和性或改變sgRNA和Cas9的表達(dá)水平，都會(huì)影響靶位點(diǎn)的專一性[31]。若脫靶造成的突變，恰好得到目的基因表型，則會(huì)造成假陽性和錯(cuò)誤的解釋，從而導(dǎo)致一系列連鎖效應(yīng)，影響結(jié)果分析和實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

綜上所述，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因編輯中也面臨著風(fēng)險(xiǎn)和問題。其一，主要是 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)，脫靶可能會(huì)影響染色體的穩(wěn)定性，使基因功能喪失，各信號(hào)通路被中斷；其二，是突變基因的傳代問題，基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得的突變體一般發(fā)生在體細(xì)胞，其突變位點(diǎn)很難遺傳下去，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的不穩(wěn)定性；其三，是靶點(diǎn)效率問題，不同靶點(diǎn)被CRISPR/Cas9系統(tǒng)切割的效率差異較大，有些靶點(diǎn)會(huì)檢測(cè)不到突變位點(diǎn)。

2.2.2降低脫靶效應(yīng)的改進(jìn)方法

如上所述，PAM序列結(jié)構(gòu)與附近的種子區(qū)域都會(huì)影響脫靶效應(yīng)，PAM典型序列是NGG，若N只是固定的某一種核苷酸，那么就會(huì)相應(yīng)提高Cas9識(shí)別的專一性；另外，若PAM序列比原來序列長，也會(huì)使靶位點(diǎn)更加準(zhǔn)確，但同時(shí)也會(huì)降低目的序列可設(shè)計(jì)的位點(diǎn)數(shù)，所以要根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求來具體分析[32]。

設(shè)計(jì)并改變sgRNA序列也是有效降低脫靶效應(yīng)的因素之一。為了提高sgRNA的特異性，應(yīng)設(shè)計(jì)sgRNA與種子區(qū)域至少有2個(gè)錯(cuò)配堿基，也可以在sgRNA的3′端、5′端加長或縮短修飾，應(yīng)盡可能降低脫靶效應(yīng)與sgRNA配對(duì)堿基數(shù)，同時(shí)，將sgRNA引導(dǎo)序列長度由標(biāo)準(zhǔn)的20個(gè)核苷酸，截短到17～18個(gè)核苷酸，能夠在一定程度上降低脫靶效應(yīng)[33]。

控制Cas9/sgRNA豐度或用突變體dCas9，也會(huì)有效降低脫靶效應(yīng)。若增加Cas9/sgRNA的豐度，會(huì)使其他正確靶點(diǎn)結(jié)合率增加，但隨之也增加了脫靶效應(yīng)，故相應(yīng)地降低Cas9/sgRNA豐度，會(huì)有效降低脫靶效應(yīng)[34]。另外，若只切割一條DNA鏈或不切割DNA鏈的突變dCas9配合sgRNA，分別切割單鏈DNA，若產(chǎn)生錯(cuò)配，一個(gè)切口也很快會(huì)被細(xì)胞修復(fù)，若沒有錯(cuò)配，用2個(gè)dCas9和sgRNA產(chǎn)生2個(gè)切口，也會(huì)得到雙鏈斷裂的DNA，從而大大降低了脫靶效應(yīng)。經(jīng)過仔細(xì)的靶標(biāo)選擇，脫靶突變?cè)?CRISPR/Cas9介導(dǎo)的水稻基因編輯中是罕見的，在利用 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的T代中，將來有希望產(chǎn)生可遺傳的靶向基因組修飾水稻[35]。

隨著CRISPR/Cas9系統(tǒng)的不斷改進(jìn)，通過設(shè)計(jì)并改變sgRNA序列以及控制Cas9/sgRNA豐度等降低脫靶效應(yīng)；另有研究通過生殖細(xì)胞特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cas9來實(shí)現(xiàn)突變基因的向下傳代[36]；另有通過優(yōu)化對(duì)靶點(diǎn)的篩選來提高靶點(diǎn)突變的效率等問題。相信在研究者們的共同努力下，CRISPR/Cas9系統(tǒng)會(huì)更加完善，完善后的基因編輯系統(tǒng)必將為遺傳育種改良帶來更大的貢獻(xiàn)。

3基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的衍生技術(shù)

基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，進(jìn)一步加工改造成一種新型、特異性強(qiáng)的基因編輯技術(shù)，即CRISPR干擾技術(shù)，該技術(shù)能抑制基因表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)類似RNAi的作用。CRISPRi通過突變Cas9的2個(gè)活性位點(diǎn)，形成缺陷的Cas9（dCas9），使它沒有切割DNA雙鏈的功能，在sgRNA識(shí)別靶序列時(shí)，由于dCas9與靶DNA啟動(dòng)子的結(jié)合，從而使得RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合被阻止，使轉(zhuǎn)錄終止，抑制基因的表達(dá)[37]。CRISPRi技術(shù)不切割自己的序列，并且抑制基因表達(dá)過程，具有高度特異性、可逆性、可誘導(dǎo)性等特點(diǎn)，對(duì)功能缺失研究方面意義重大。與此同時(shí)，CRISPR激活技術(shù)，也是通過失活Cas9，從而引入轉(zhuǎn)錄激活子，精確激活靶基因表達(dá)，對(duì)功能獲得研究方面意義深遠(yuǎn)。兩種技術(shù)相互補(bǔ)充，不僅能分析基因功能，獲得全面的結(jié)果分析，也能使篩選結(jié)果更加準(zhǔn)確[38]。有研究利用CRISPRi技術(shù)抑制人Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（CD71）和C-X-C趨化因子受體（CXCR4）基因表達(dá)[39]。

基于以上幾種技術(shù)原理，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已用于高通量篩選全基因組，高通量篩選平臺(tái)構(gòu)建方式如下，首先是建立sgRNA慢病毒篩選文庫，慢病毒載體選擇有兩種類型，一種是Cas9和sgRNA序列構(gòu)建在1個(gè)慢病毒載體上，即單質(zhì)粒系統(tǒng)；另一種是Cas9和sgRNA分別構(gòu)建在2個(gè)不同的慢病毒載體上，即雙質(zhì)粒系統(tǒng)，構(gòu)建好合適的載體后，插入不同的sgRNA，建立文庫[40]。接下來是目的細(xì)胞的感染與功能性篩選和富集，對(duì)已建好的文庫進(jìn)行慢病毒包裝，并進(jìn)行目的細(xì)胞的感染后，根據(jù)研究需要進(jìn)行功能篩選。有以下兩種篩選方式，其一是陽性篩選，是指在一定篩選壓力作用下，少數(shù)能存活的細(xì)胞是研究者所需要的，可以進(jìn)一步獲得存活細(xì)胞富集的sgRNA。其二是陰性篩選，是指通過篩選可鑒定出某些特殊基因，如引起細(xì)胞功能異常或缺失的基因，通過比較篩選起始時(shí)間和篩選終止時(shí)間的sgRNA豐度差，從而鑒定出所對(duì)應(yīng)的基因[41]。此項(xiàng)技術(shù)，可以廣泛應(yīng)用于基因組篩選相關(guān)領(lǐng)域的研究，有助于研究功能基因并挖掘新基因。

4CRISPR/Cas9系統(tǒng)在農(nóng)業(yè)相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，主要分為體內(nèi)和體外兩種應(yīng)用，體外對(duì)基因組片段進(jìn)行靶向切割以替代傳統(tǒng)的限制性內(nèi)切酶或PCR克隆，體內(nèi)應(yīng)用主要在細(xì)胞或個(gè)體水平上實(shí)現(xiàn)基因的敲除和插入的基因編輯。相比早期基因編輯技術(shù)，不僅載體構(gòu)建簡(jiǎn)單，只需要根據(jù)靶基因位點(diǎn)，對(duì)sgRNA進(jìn)行設(shè)計(jì)使得突變效率顯著提高，而且可以同時(shí)高效快速地編輯多基因位點(diǎn)，是一種新型的基因編輯技術(shù)[42]。

4.1在農(nóng)作物遺傳育種改良中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種自然產(chǎn)生的基因編輯工具，它的發(fā)現(xiàn)和修飾為研究基因功能和精確作物育種開辟了新的時(shí)代。目前，CRISPR/Cas9基因組編輯已經(jīng)用于改良作物的許多不同性狀，有研究通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)替換乙酰乳酸合成酶（ALS）的兩個(gè)氨基酸殘基，成功獲得了多個(gè)抗除草劑水稻品系，不僅可以通過 NHEJ 產(chǎn)生多個(gè)水稻和小麥突變體植株用于功能分析和遺傳改良，而且還可以通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的堿基編輯精確替代蛋白質(zhì)中的單個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基，定向誘變氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因改良稻米品質(zhì)，大大擴(kuò)展了修飾水稻和小麥重要性狀的基因，為作物品種選育提供了一種新的策略[43-44]。另外在大豆育種方面，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)大豆AMS同源基因進(jìn)行靶向編輯，從而獲得穩(wěn)定的雄性不育系，為大豆雜交育種提供新的不育系材料[45]。另有研究通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，對(duì)番茄 SlCLV3 啟動(dòng)子序列的不同靶位點(diǎn)進(jìn)行編輯，篩選獲得高產(chǎn)突變株系，為作物產(chǎn)量數(shù)量性狀遺傳育種提供了新途徑[46]。CRISPR/Cas9的基因組編輯系統(tǒng)已經(jīng)被建立在幾乎所有的主要作物上，它可以影響農(nóng)作物對(duì)病原體的抗性和非生物耐性、植物發(fā)育和形態(tài)，甚至次級(jí)代謝和纖維發(fā)育等方面，CRISPR/Cas基因編輯已經(jīng)成為一種成熟的生物技術(shù)工具[47]。

4.2在農(nóng)作物病原菌及植物抗病中的應(yīng)用

植物病害的發(fā)生不僅會(huì)影響植物的生長發(fā)育，還會(huì)降低作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。CRISPR/Cas9被用作基因編輯工具以來，它已經(jīng)被迅速用于創(chuàng)建具有植物抗性的基因組編輯突變體，這些突變體可以使植物抵抗由真菌、病毒和細(xì)菌引起的各種疾病。有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)抑制小麥及大麥MLO基因，可減少其白粉病的發(fā)生[48-49]。另有研究通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)沉默ERF 轉(zhuǎn)錄因子基因OsERF922，能使水稻植株在其幼苗期及分蘗期的抗稻瘟病能力都顯著提高[50]。同時(shí)CRISPR/Cas9技術(shù)在植物抗病性的應(yīng)用可能與植物水楊酸（SA）水平的增加和免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)，通過CRISPR-Cas9介導(dǎo)DMR6同源基因的功能缺失可以使番茄對(duì)幾種病原體產(chǎn)生抗性[51]。CRISPR/Cas9技術(shù)不僅廣泛應(yīng)用于水稻、小麥等主要作物，同時(shí)在擬南芥、煙草上也開展了大量的基因組定點(diǎn)編輯研究，為構(gòu)建植物突變體模型，從而為深入進(jìn)行植物遺傳改良奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[52]。

5結(jié)語與展望

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌防御外來入侵的特殊機(jī)制，是高效、快捷的第三代基因編輯技術(shù)。隨著這幾年研究的不斷深入，以CRISPR/Cas9系統(tǒng)為基礎(chǔ)所建立的高通量篩選平臺(tái)，可以廣泛應(yīng)用于作物遺傳育種研究，CRISPR/Cas9系統(tǒng)除了能對(duì)植物進(jìn)行定點(diǎn)突變，還能切割整段雙鏈DNA，另外也能通過同源重組機(jī)制突變特殊類型的基因，從而精確控制基因，在農(nóng)作物病原菌及植物抗病中廣泛應(yīng)用，給農(nóng)業(yè)領(lǐng)域帶來了巨大的創(chuàng)新和突破。相比傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單、成本低、周期短等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)衍生的CRISPRi/CRISPRa技術(shù)已經(jīng)被整合到難以進(jìn)行遺傳操作的細(xì)菌染色體上，相信經(jīng)對(duì)可誘導(dǎo)表達(dá)CRISPRi 和CRISPRa工具的不斷開發(fā)，將會(huì)使其應(yīng)用領(lǐng)域更加廣泛。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在的脫靶效應(yīng)，是研究者們面臨的重大挑戰(zhàn)。最近，科學(xué)家通過改變sgRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在一定程度上降低了脫靶效應(yīng)。另外基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)多數(shù)集中在室內(nèi)研究，未來應(yīng)加強(qiáng)在田間的應(yīng)用研究。相信CRISPR/Cas9系統(tǒng)的不斷改進(jìn)和完善，能夠?yàn)檗r(nóng)作物遺傳育種改良和抗病品種的選育帶來巨大貢獻(xiàn)。

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CRISPR/Cas9 Gene Editing and Its Application in Agriculture

LIU Yue， LAN Ying， LI Qingchao， ZHAO Xiumei， LIU Yang， WANG Lida， WANG Junqiang， HAN Yehui

（Qiqihar Branch，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Qiqihar 161006，China）

Abstract：Gene editing techniques are widely used to improve crop yield and quality.Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and associated protein （CRISPR/Cas9） system is the acquired immune system of bacteria， archaea resist exogenous substances invasion， the zinc finger nuclease （ZFN）， transcription activator like effector nuclease （TAL） after the third generation of gene editing technology. This article discussed the historical origins of the CRISPR/Cas9 system; An overview of the gene structure of the CRISPR/Cas9 system， including CRISPR related nucleases （Cas9）， specific CRISPR RNA （crRNA）， and trans activated CRISPR RNA （tracrRNA）. At the same time， the working principle of the system was summarized from three stages， as the acquisition stage of interval sequences， the expression stage， and the immune interference stage. In addition， discussions have been conducted on the application of the system in functional gene research， genomic screening， and related fields such as agriculture. And it summarized the risks （off target effects） and solutions that will arise， to lay the foundation for crop variety selection and the exploration of functional genes.

Keywords：CRISPR/Cas9 system; gene editing; agriculture; miss effect

基金項(xiàng)目：黑龍江省省屬科研院所科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（CZKYF2023-1-B012，CZKYF2024-1-C008）；齊齊哈爾市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（ZDGG-202207）；齊齊哈爾市科技計(jì)劃聯(lián)合引導(dǎo)項(xiàng)目（LNYGG-2024003）；齊齊哈爾市科技計(jì)劃創(chuàng)新激勵(lì)項(xiàng)目（CNYGG-2023027）。

第一作者：劉悅（1995-），女，碩士，助理研究員，從事基因工程研究。E-mail：2563522180@qq.com。