矽肺大鼠肺組織差異表達環(huán)狀RNA的篩選及其生物學功能和調(diào)控通路分析

徐安琪，張瑋，張志虎，張放，楊治峰

山東第一醫(yī)科大學（山東省醫(yī)學科學院）山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院檢測評價室，濟南 250000

矽肺是由吸入可呼吸結(jié)晶二氧化硅（SiO2）粉塵而引起的，隨著時間的推移，會導致肺部發(fā)生進行性、不可逆的致命性炎癥和纖維化。矽肺是多種因素相互作用的結(jié)果，涉及多種細胞和生物活性物質(zhì)，但目前臨床上針對矽肺的治療選擇相對有限［1］。因此，臨床亟需尋找新的能減緩矽肺發(fā)展的作用靶點及其相關(guān)藥物。與線性RNA的典型剪接不同，環(huán)狀RNA（circRNA）是通過RNA 5′和3′端直接共價連接的反向剪接而生成的，并且在circRNA中存在一種重要的內(nèi)源性競爭RNA（ceRNA）機制，可以調(diào)控微小RNA（miRNA），從而間接影響靶信使RNA（mRNA）的穩(wěn)定性和翻譯效率［2］。但目前circRNA在矽肺發(fā)生中的作用及其相關(guān)機制尚未明了。2020年3月—2021年5月，本研究應用生物信息學的方法篩選矽肺大鼠肺組織差異表達的circRNA，并進行生物學功能及調(diào)控通路分析，為探索矽肺相關(guān)的發(fā)病機制和治療靶點提供思路?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料實驗動物：SPF級Wistar雄性大鼠20只，體質(zhì)量180～200 g，購自濟南朋悅實驗室動物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SDZFY-ECA-2021-11；房間溫度為（23±2）℃，相對濕度為55%±5%，晝夜交替時間為12 h/12 h，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。主要試劑：SiO2粉塵（粒徑0.5～10.0 μm）購自美國Sigma公司，Masson染液購自武漢賽維爾生物科技有限公司，水合氯醛購自山東辰欣藥業(yè)股份有限公司，多聚甲醛購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 大鼠矽肺模型建立與驗證20只Wistar雄性SPF級大鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d，隨機分成模型組和對照組，每組10只。使用生理鹽水配備濃度為100 mg/mL的SiO2懸濁液，高壓滅菌后充分混合搖勻。將兩組大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后固定在支架上，在冷光源的照射下進行氣管插管。模型組大鼠采用非暴露法氣管內(nèi)一次性灌注SiO2粉塵懸液（100 mg/mL）1 mL，拔出氣管內(nèi)插管后輕輕搖晃大鼠身體，使粉塵在肺內(nèi)均勻分散，建立大鼠矽肺模型。對照組大鼠采用相同方法氣管內(nèi)注入滅菌生理鹽水1 mL。兩組分組處理30 d，經(jīng)10%水合氯醛深度麻醉，在解剖板上對大鼠進行解剖。取出右肺下葉組織，兩組各隨機取出3例份肺組織，常規(guī)進行HE及Masson染色，鏡下觀察肺組織病理改變。HE染色結(jié)果顯示：對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔無增厚，炎癥細胞浸潤不明顯；模型組大鼠肺組織出現(xiàn)部分結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔變窄，組織間隔增厚，并伴有炎癥細胞浸潤。Masson染色結(jié)果顯示：對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯的藍染膠原蛋白沉積；相較于對照組，模型組大鼠肺組織間隙可見部分藍染的膠原蛋白沉積。證實模型組建模成功。見OSID碼圖1、2。

1.3 肺組織差異表達circRNA篩選采用高通量circRNA芯片技術(shù)。收集兩組剩余肺組織各7例份，取每例份肺組織約100 mg，使用TRIzol試劑提取總RNA，NanoDropND-1000分光光度計測定總RNA樣品的純度和濃度，變性瓊脂糖凝膠電泳評估樣本的RNA完整性。獲取熒光circRNA：用RNA核糖核酸酶處理總RNA，以去除線性RNA；利用circRNA labeling將樣本擴增并轉(zhuǎn)錄成熒光標記的circRNA；使用RNeasy迷你試劑盒純化標記的circRNA，使用NanoDropND-1000測量標記的circRNA的濃度和活性。芯片雜交：將雜交溶液分配到墊片載玻片中，將該載玻片與大鼠circRNA陣列載玻片組裝，置于安捷倫雜交烘箱中，65℃條件下培養(yǎng)17 h。對雜交陣列進行清洗、固定，使用安捷倫G2505C掃描儀進行掃描。使用R軟件包進行分位數(shù)歸一化和后續(xù)數(shù)據(jù)處理，以差異倍數(shù)>2、P<0.05為篩選條件，統(tǒng)計兩組差異表達的circRNA。將上述篩選的circRNA使用R軟件包進行層次聚類分析熱圖、火山圖和散點圖的繪制，分析兩組在circRNA表達水平上的一致性。cir?cRNA芯片實驗由上?？党巧镉邢薰緟f(xié)助完成。

1.4生物學功能及通路富集分析使用基因本體論（GO）功能與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析差異表達circRNA的生物功能及相關(guān)通路。GO功能富集分析主要包括生物學過程、細胞成分和分子功能三個方面。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠肺組織差異表達circRNA篩選結(jié)果共篩選出兩組大鼠肺組織差異表達circRNA 1 129個，其中表達上調(diào)的circRNA 293個，表達下調(diào)的circRNA 836個。差異表達circRNA的層次聚類分析熱圖、火山圖和散點圖見OSID碼圖3～5。

2.2 差異表達circRNA的GO功能和KEGG通路分析結(jié)果GO功能分析結(jié)果顯示：①分子功能層面，差異表達的circRNA主要影響蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白、離子結(jié)合、蛋白質(zhì)的催化活性、蛋白激酶活性；②細胞組成層面，差異表達的circRNA主要影響細胞連接、突觸、細胞內(nèi)膜結(jié)合、細胞器、細胞內(nèi)細胞器；③生物學過程層面，差異表達的circRNA主要影響陰離子結(jié)合、ATP結(jié)合、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、蛋白激酶活性。KEGG通路分析結(jié)果顯示，矽肺大鼠肺組織差異表達的circRNA主要與癌癥、環(huán)磷酸鳥苷—蛋白激酶G（cGMP）—蛋白激酶G（PKG）信號通路、酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、血管平滑肌收縮、表皮生長因子受體信號通路（EGFR）、鈣離子信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、甲狀旁腺激素的合成與分泌、谷氨酸能突觸等通路相關(guān)。差異表達circRNA的GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果見OSID碼圖6。

3 討論

矽肺的發(fā)病機制是多種因素綜合作用的結(jié)果，SiO2引發(fā)矽肺的主要機制包括：①產(chǎn)生直接細胞毒性，可以引發(fā)肺泡巨噬細胞自由基反應，產(chǎn)生過氧化脂質(zhì)；②產(chǎn)生高活性分子，如氧自由基、氮自由基，引發(fā)氧化損傷；③產(chǎn)生細胞因子和趨化因子，如氧化應激激活核因子κB（NF-κB）、活化蛋白1等，從而激活炎癥、纖維化過程；④引發(fā)纖維化：肺組織中的免疫細胞群如中性粒細胞、巨噬細胞與粉塵顆粒長期作用，最終可導致肺間質(zhì)纖維化；⑤細胞凋亡：SiO2引起的肺纖維化可導致肺泡巨噬細胞凋亡，是形成肺泡炎癥、導致肺纖維化的病理基礎(chǔ)。因此，早期發(fā)現(xiàn)并診斷矽肺、及早進行干預可以降低矽肺病死率。目前，針對矽肺有藥物和干細胞兩種治療方法，可以延緩肺纖維化的藥物有粉防已堿、檸檬酸鋁等，但臨床療效較差，不能有效延緩肺纖維化的發(fā)展［3］。因此，有效且穩(wěn)定的矽肺治療手段顯得尤為重要。

目前，高通量測序技術(shù)日趨成熟，在臨床樣本的病原體鑒定、腫瘤檢測、疾病診斷、遺傳病檢測等領(lǐng)域，為精準醫(yī)療、疾病研究等提供了一個高效的分析檢測工具［4］。circRNA是一種自身3′與5′末端相結(jié)合的特殊閉環(huán)結(jié)構(gòu)RNA，具有高穩(wěn)定性，且特殊的閉環(huán)結(jié)構(gòu)可保護這些分子免受核酸外切酶介導的降解。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA中存在特殊的ceRNA機制，這使得circRNA可以競爭性結(jié)合miRNA，從而調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄，這種機制有利于大規(guī)模效應，在各種疾病的生理病理過程中也起到關(guān)鍵作用［5］。目前已有大量實驗證明，在博來霉素致肺纖維化模型、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）致心臟細胞纖維化模型、小鼠單側(cè)輸尿管梗阻模型、大鼠肝纖維化模型、大鼠腎纖維化模型、瘢痕疙瘩皮膚成纖維細胞模型以及人特發(fā)性肺纖維患者中，差異表達的circRNA主要分布在無翅型MMTV整合位點家族成員1（Wnt）、TGFβ、NF-κB、MAPK、單 磷 酸 腺 苷 活 化 蛋 白 激 酶（AMPK）、磷脂酰肌醇3激酶—蛋白激酶B（PI3KAKT）、細胞自噬、血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）、RAS相關(guān)蛋白1（Rap1）、p53、細胞凋亡、細胞生長等信號通路中；表明大量的circRNA參與了心、肝、腎等不同器官、不同疾病的纖維化過程，且這些差異性circRNA與MAPK、AMPK、PI3K-AKT和Rap1等信號通路有關(guān)［6-12］。上述研究為治療矽肺以及矽肺所致的纖維化提供了可能的代謝通路信息和治療靶點。

本研究采用芯片技術(shù)檢測到矽肺大鼠肺組織中存在1 129個差異性表達circRNA，其中293個circRNA表達上調(diào)，836個circRNA表達下調(diào)，采用GO功能和KEGG通路富集分析得出差異表達的cricRNA主要影響蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白、離子結(jié)合等分子功能，細胞連接、突觸等細胞組成，陰離子結(jié)合、ATP結(jié)合等生物學過程，差異表達的circRNA主要與癌癥、cGMP-PKG、EGFR、Rap1、鈣離子信號通路、MAPK等代謝通路有關(guān)。HE染色結(jié)果提示，矽肺大鼠肺組織中伴有炎癥細胞浸潤、肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞，預測可能與GO分析中細胞連接、細胞內(nèi)膜結(jié)合等circRNA表達異常有關(guān)。Masson染色提示矽肺大鼠肺組織出現(xiàn)纖維化等病理改變，結(jié)合其他研究對于不同器官纖維化的差異性circRNA通路篩選結(jié)果，提示與纖維化相關(guān)的差異性circRNA可能存在于Rap1、MAPK、Wnt等信號通路。盡管測序技術(shù)可以篩選出多個差異性表達circRNA，不過BACHMAYRHEYDA等［13］的實驗證明，同一疾病利用組織和細胞系兩種不同實驗材料進行基因芯片篩選后的circRNA結(jié)果并不相同；與正常結(jié)腸樣本相比，腫瘤組織中circRNA與線性RNA亞型的比例始終較低，在結(jié)直腸癌細胞系中甚至更低；這提示選取不同實驗材料進行circRNA的篩選可能會出現(xiàn)不同的circRNA表達結(jié)果，產(chǎn)生的生物信息分析結(jié)果也不同，這為后期驗證circRNA的表達豐度、代謝通路等選擇合適實驗材料提供了方向和依據(jù)。另一方面有研究證實，通過circRNA的敲除、過表達等方式可以探究其在誘導巨噬細胞激活、介導炎癥反應、參與細胞纖維化等代謝通路方面的作用，并且circRNA的穩(wěn)定性、不宜被核酸外切酶剪切等特點，以及circRNA的ceRNA機制方便了實驗設(shè)計以及驗證基因的互作關(guān)系［14］。研究表明，蛋白磷酸酶2A催化亞基Cα（PP2Acα）可激活Rap1和腫瘤壞死因子α（TNF-α），促使巨噬細胞集聚和激活后加速腎小管細胞死亡和腎纖維化，提示Rap1的活化與加速細胞纖維化有關(guān)［15］。由此可以根據(jù)ceRNA機制和circRNA穩(wěn)定表達的特點，設(shè)計動物、細胞以及臨床實驗來敲除Rap1相關(guān)的circRNA，從而使PP2Acα蛋白表達降低，從而起到穩(wěn)定減緩纖維化發(fā)展的目的。相關(guān)研究證實，circ?MAPK4、circMAPK1和circCDR1as等circRNA分 子分 別 對miR-7/GDF5/SMAD、miR-195-5p和miR-125a-3p等miRNA進行調(diào)控后，介導了MAPK通路改變，參與抑制胃癌發(fā)展、促進膠質(zhì)瘤細胞凋亡和甲狀腺乳頭狀癌發(fā)展等過程［16-17］。本研究中差異性表達的circRNA對MAPK信號通路的影響同樣較為顯著，這提示后續(xù)設(shè)計相關(guān)實驗驗證以上差異性circRNA與Rap1、MAPK等相關(guān)通路的調(diào)控對于矽肺及其相關(guān)肺纖維化的治療方面至關(guān)重要。

綜上所述，本研究通過建立大鼠矽肺模型，篩選出1 129個矽肺大鼠肺組織差異表達circRNA，這些差異表達circRNA通過影響癌癥、cGMP-PKG信號通路、酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、血管平滑肌收縮、EG?FR、鈣離子信號通路、MAPK信號通路、甲狀旁腺激素的合成與分泌、谷氨酸能突觸等通路而參與矽肺的發(fā)生發(fā)展。本研究不足之處在于樣本數(shù)量較少，circRNA篩選結(jié)果有一定局限性，后期需要加大樣本量進行差異性circRNA的PCR定量驗證，以及構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)來探討circRNA相關(guān)通路對矽肺的調(diào)控作用，為后續(xù)矽肺的治療提供依據(jù)。