結(jié)直腸癌組織NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)觀察及其診斷效能分析

馬曉陽(yáng)，江澤友

1自貢市第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川自貢 643000；2成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院；3成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展、人口老齡化、居民生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率及病死率逐年上升，并呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)［1］。研究顯示，晚期結(jié)直腸癌患者的5年生存率不足10%，而早期患者可達(dá)90%以上［2］。隨著基因組學(xué)和表觀遺傳學(xué)的深入發(fā)展，基因啟動(dòng)子甲基化與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系成為研究的熱點(diǎn)［3］。基因啟動(dòng)子甲基化是指DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA上，以CpG二核苷酸中胞嘧啶第5位碳原子上最常見，形成5-甲基胞嘧啶［4］。DNA甲基化在基因表達(dá)調(diào)控中具有關(guān)鍵作用，涉及細(xì)胞中的多個(gè)生理過程，如基因沉默、基因印跡、X染色體失活以及細(xì)胞類型特異性表達(dá)程序的建立和維持［5］。在人類基因組中，大約80%的CpG二核苷酸是甲基化的，而20%未甲基化的CpG二核苷酸常位于基因啟動(dòng)子。甲基化的DNA具有更好的穩(wěn)定性，可以通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和染色體構(gòu)型導(dǎo)致基因低表達(dá)或不表達(dá)［6-7］。DNA啟動(dòng)子異常甲基化在腫瘤中普遍存在，是腫瘤發(fā)生過程中最早的變化之一。N-Myc下游調(diào)節(jié)基因4（NDRG4）可編碼一種細(xì)胞質(zhì)蛋白，廣泛表達(dá)于從線蟲到人類的真核生物細(xì)胞中，其在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯降低，但是目前關(guān)于NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化與結(jié)直腸癌的關(guān)系研究較少。本研究觀察了結(jié)直腸癌組織NDRG4基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，并分析其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，為結(jié)直腸癌的早期診斷提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇2014年1月—2016年12月成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院收集的結(jié)直腸癌石蠟組織43例份，均經(jīng)病理確診，術(shù)前均未行放化療及免疫治療；另選對(duì)應(yīng)的癌旁石蠟組織24例份作為對(duì)照組。43例原發(fā)性結(jié)直腸癌患者中男22例、女21例，年齡≤60歲23例、>60歲20例，腫瘤生長(zhǎng)部位：直腸23例、結(jié)腸20例，分化程度：高分化16例、中分化19例、低分化8例，腫瘤浸潤(rùn)深度：T1期1例、T2期14例、T3期23例、T4期5例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性15例，臨床分期：Ⅰ期15例、Ⅱ期15例、Ⅲ期13例。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，患者均簽署知情同意書。

1.2 NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)采用定量甲基化特異性PCR（qMSP）法。

1.2.1 基因組DNA提取選擇經(jīng)HE染色證實(shí)存在癌組織并占60%以上的蠟塊，切取5～8張10 μm厚組織，裝入1.5 mL離心管。按照石蠟包埋組織DNA快速提取試劑盒說明書提取組織DNA，以50 μL洗脫液洗脫DNA。使用微量紫外—可見光分光光度計(jì)測(cè)定所提取的DNA濃度。

1.2.2 亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化嚴(yán)格按照DNA甲基化轉(zhuǎn)換試劑盒說明書對(duì)樣品DNA進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換及純化，經(jīng)亞硫酸鹽處理后DNA中非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不能發(fā)生該反應(yīng)。最后使用20 μL洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫。

1.2.3 定量甲基化特異性PCR反應(yīng)在UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//genome.ucsc.edu）中下載NDRG4基因啟動(dòng)子序列，應(yīng)用甲基化分析網(wǎng)站MethPrimer（http：//www.urogene.org/methprimer）在 線 分 析NDRG4基因啟動(dòng)子CpG島，并下載亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換后的DNA序列，結(jié)果顯示在NDRG4基因啟動(dòng)子共檢測(cè)到兩個(gè)CpG島。CpG島1位于-461～-351 bp，共111 bp；CpG島2位 于-348～+175 bp，共523 bp。qMSP產(chǎn)物長(zhǎng)度157 bp，正向引物設(shè)計(jì)位于-31～-9 bp，共覆蓋3個(gè)CpG位點(diǎn)；反向引物位于+106～+126 bp，共覆蓋3個(gè)CpG位點(diǎn)；熒光探針位于+4～+29 bp，共覆蓋5個(gè)CpG位點(diǎn)。擴(kuò)增區(qū)域位于CpG島2的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近。針對(duì)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換后的序列設(shè)計(jì)特異性引物探針，引物探針由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，見表1。采用雙重PCR擴(kuò)增技術(shù)，同時(shí)擴(kuò)增NDRG4和內(nèi)參ACTB基因。qMSP反應(yīng)體系：DNA模板（亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換后）2 μL，1×Su?per Real Pre Mix，正反向引物0.2 μmol/L，Taqman探針0.15 μmol/L，ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性15 min，95℃變性3 s，60℃退火/延伸20 s，共45個(gè)循環(huán)。

表1 NDRG4和內(nèi)參ACTB基因的引物及探針序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.2.4 甲基化判定標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)基因相對(duì)位點(diǎn)CpG發(fā)生甲基化則可檢測(cè)到熒光信號(hào)的增加，且熒光信號(hào)產(chǎn)生的閾值循環(huán)數(shù)（Ct）與甲基化基因的數(shù)量相關(guān)。根據(jù)臨床對(duì)于檢測(cè)敏感性和特異性的需求分析，判定NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化的Ct值截?cái)嘀禐?0，且只有當(dāng)內(nèi)參基因的Ct值≤36，結(jié)果才有效［8-9］。甲基化判定標(biāo)準(zhǔn)：①ACTB基因的Ct值≤36，甲基化NDRG4基因Ct值≤40時(shí)判定為發(fā)生甲基化；②ACTB基因Ct值≤36，甲基化NDRG4基因Ct值>40時(shí)判定為未發(fā)生甲基化；③ACTB基因Ct值>36或者無Ct值時(shí)，判定為無效，不納入統(tǒng)計(jì)。以發(fā)生甲基化的標(biāo)本數(shù)占總標(biāo)本數(shù)的百分比計(jì)算NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化率，并比較不同臨床病理參數(shù)結(jié)直腸癌患者的NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，結(jié)果比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。繪制NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化診斷結(jié)直腸癌的受試者工作特征（ROC）曲線，計(jì)算曲線下面積（AUC）及敏感性、特異性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織和癌旁組織NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化率比較結(jié)直腸癌組織和癌旁組織NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化率分別為65.12%（28/43）和4.17%（1/24），P<0.01。

2.2 不同臨床病理參數(shù)的結(jié)直腸癌患者癌組織NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化率比較不同性別、年齡、腫瘤生長(zhǎng)部位、組織分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期的結(jié)直腸癌患者癌組織NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化率比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均>0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理參數(shù)的結(jié)直腸癌患者癌組織NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化率比較［例（%）］

2.3 NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效能ROC曲線結(jié)果顯示，NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化診斷結(jié)直腸癌的AUC為0.823 2（95%CI：0.725 5～0.920 8，P<0.01），敏感度為65.12%（95%CI：49.01～78.54），特異度為95.83%（95%CI：76.88～99.78）。見圖1。

圖1 NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線

3 討論

既往研究多認(rèn)為惡性腫瘤是由于細(xì)胞內(nèi)遺傳學(xué)改變所導(dǎo)致的，近年來越來越多的證據(jù)表明表觀遺傳學(xué)改變與細(xì)胞內(nèi)遺傳學(xué)改變共同作用是細(xì)胞發(fā)生癌變的重要原因［5］。常見的表觀遺傳學(xué)改變包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑以及非編碼RNA調(diào)控，其中DNA甲基化是哺乳動(dòng)物中研究最廣泛和最常見的表觀遺傳學(xué)改變［10］。研究表明，正常細(xì)胞中抑癌基因啟動(dòng)子CpG島通常處于未甲基化狀態(tài)，而腫瘤細(xì)胞中則處于高度甲基化狀態(tài)［11］。NDRG4基因位于染色體16q21，有24個(gè)外顯子，其編碼的蛋白在星形膠質(zhì)細(xì)胞的生存和細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也參與調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的有絲分裂。本研究對(duì)NDRG4基因進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因啟動(dòng)子富含大量的CpG位點(diǎn)，并檢索到兩個(gè)CpG島，CpG島1位于-461～-351 bp，共111 bp；CpG島2位于-348～+175 bp，共523 bp。目前，多項(xiàng)研究顯示NDRG4基因啟動(dòng)子CpG島在胰腺導(dǎo)管癌、乳腺癌、胃癌和食管癌等多種腫瘤中處于高度甲基化狀態(tài)，且高甲基化是NDRG4基因失活的主要機(jī)制［12-15］。

qMSP法是在甲基化特異性PCR（MSP）的基礎(chǔ)建立起的一種基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，具有高敏感性和高特異性，能夠檢測(cè)出非甲基化等位基因超過甲基化等位基因10 000倍的樣品，且與Sanger測(cè)序結(jié)果高度一致［16-17］。qMSP法根據(jù)PCR循環(huán)過程中有無擴(kuò)增曲線及擴(kuò)增曲線的Ct值來判斷檢測(cè)樣品是否發(fā)生甲基化及甲基化程度；該方法操作更簡(jiǎn)便，DNA擴(kuò)增完成后不需要再進(jìn)行電泳，大大增加了臨床體外診斷應(yīng)用的可能性，適用于臨床高通量樣本的檢測(cè)。本研究利用qMSP法對(duì)NDRG4基因啟動(dòng)子CpG島甲基化進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明結(jié)直腸癌組織NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化率明顯高于癌旁組織；這提示在結(jié)直腸癌組織中NDRG4基因啟動(dòng)子多處于甲基化狀態(tài)，而在正常組織中很少甲基化，NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化是腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)的。此外本研究結(jié)果顯示，NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化與結(jié)直腸癌患者年齡、性別、腫瘤生長(zhǎng)部位、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均無關(guān)，這提示NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化在結(jié)直腸癌發(fā)展過程中并非起主要作用，而是結(jié)直腸癌發(fā)生的早期事件，其發(fā)生早于組織病理學(xué)的改變。結(jié)合既往研究顯示結(jié)直腸癌組織NDRG4表達(dá)顯著低于正常結(jié)直腸上皮組織［18］，而結(jié)直腸癌NDRG4基因啟動(dòng)子處于高甲基化狀態(tài)；推測(cè)NDRG4在結(jié)直腸癌的發(fā)生過程中是一種腫瘤抑制相關(guān)基因，啟動(dòng)子甲基化可能是導(dǎo)致其表達(dá)降低的相關(guān)機(jī)制之一。

大便潛血試驗(yàn)（FOBT）檢查和腸鏡檢查是我國(guó)篩查結(jié)直腸癌最常見的方法，其中腸鏡檢查是診斷結(jié)直腸癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但腸鏡檢查需進(jìn)行腸道準(zhǔn)備且為有創(chuàng)性，患者的依從性差［19］。此外，腸鏡檢查漏診近端結(jié)腸腫瘤的比例很高［20］。FOBT是無創(chuàng)性的，但影響因素較多，準(zhǔn)確性較低。隨著基因檢測(cè)技術(shù)的迅速發(fā)展，分子標(biāo)志物被廣泛應(yīng)用于腫瘤的臨床診斷、精準(zhǔn)治療和預(yù)后評(píng)估。在結(jié)直腸癌相關(guān)研究中，研究者們認(rèn)識(shí)到DNA甲基化具有組織特異性，穩(wěn)定存在于患者的組織、血液、糞便和體液中，且DNA甲基化在結(jié)直腸癌的發(fā)生中具有早期性和普遍性［21］。因此，DNA甲基化具有準(zhǔn)確、無創(chuàng)和價(jià)格低廉的結(jié)直腸癌篩查潛能，有望成為一種新型的結(jié)直腸癌早期篩查分子標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化診斷結(jié)直腸癌的AUC為0.823 2、敏感度為65.12%、特異度為95.83%；提示NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化可作為潛在的結(jié)直腸癌篩查標(biāo)志物，對(duì)結(jié)直腸癌具有一定程度的預(yù)測(cè)價(jià)值，但尚不足以成為獨(dú)立的結(jié)直腸癌篩查分子指標(biāo)。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化率升高，與患者的臨床病理參數(shù)關(guān)系不大，但有助于結(jié)直腸癌的診斷，可作為結(jié)直腸癌篩查的潛在分子標(biāo)志物。在后續(xù)研究中，我們會(huì)將NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)應(yīng)用到結(jié)直腸癌患者的血清及糞便等無創(chuàng)樣本中，并聯(lián)合其他蛋白或分子指標(biāo)，進(jìn)一步探索NDRG4基因啟動(dòng)子甲基化在結(jié)直腸癌中的診斷價(jià)值。