益生菌聯(lián)合左卡尼汀口服改善肥胖男性精子DNA碎片化率異常的臨床觀察

劉春輝，朱晨，陜文生，王志強(qiáng)，王海，周于娜，金莉婭

1甘肅省婦幼保健院男科，蘭州 730050；2甘肅省婦幼保健院健康管理中心

肥胖是造成精子質(zhì)量異常的重要影響因素，無(wú)論女方是否進(jìn)行體質(zhì)量控制，肥胖男性參與的體外受精（IVF）最終活產(chǎn)率明顯低于非肥胖男性參與的IVF［1］。肥胖男性更容易出現(xiàn)精子DNA碎片化率（DFI）過(guò)高的問(wèn)題，且更容易導(dǎo)致女性發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，這可能與肥胖人群相關(guān)的代謝性內(nèi)毒素血癥有關(guān)［2-3］。降低精子DFI的傳統(tǒng)治療方法是服用抗氧化劑，如左卡尼汀、維生素E等，通過(guò)將脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中進(jìn)行β-氧化，以產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP）對(duì)精子供能，同時(shí)催化脂氫過(guò)氧化物（Loo-H）產(chǎn)生無(wú)害化的羥化物，以降低過(guò)氧化脂質(zhì)的氧化效果，實(shí)現(xiàn)保護(hù)精子細(xì)胞核及精子DNA完整性的目的［4］。此外，使用益生菌可降低肥胖人群的腸道通透性，減少腸道細(xì)菌易位，是對(duì)抗代謝性內(nèi)毒素血癥與氧化應(yīng)激的有效方法［5-6］。但在改善肥胖男性精子DFI方面，益生菌聯(lián)合抗氧化劑較單獨(dú)使用抗氧化劑治療是否更具優(yōu)勢(shì)尚未可知，為此我們進(jìn)行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料納入標(biāo)準(zhǔn)：①DFI≥15%；②BMI≥30 kg/m2；③年齡20～40歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并原發(fā)性性腺功能減退相關(guān)疾病，如Klinefelter綜合征、隱睪癥或睪丸損傷；②近期服用免疫抑制劑，如非甾體類抗炎藥、皮質(zhì)類固醇或魚(yú)油等；③近期服用可能改變腸道功能的藥物，如益生菌、抗生素等；④近期服用激素類藥物或抗激素藥物，如芳香化酶抑制劑、克羅米芬、枸櫞酸他莫昔芬、人絨毛膜促性腺激素或睪酮等；⑤近3個(gè)月內(nèi)曾接受過(guò)電離輻射檢查，如X線、CT等；⑥合并亞臨床生殖道感染［7］。選取2021年1月—12月在我院男科就診時(shí)發(fā)現(xiàn)的符合上述標(biāo)準(zhǔn)的精子DFI異常肥胖男性179例，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為觀察組89例與對(duì)照組90例。觀察組年齡（27.21±4.31）歲，體質(zhì)量（92.51±5.01）kg，BMI（32.56±1.92）kg/m2，精子DFI 23.63%±6.84%；對(duì)照組年齡（26.53±4.30）歲，體質(zhì)量（94.31±6.31）kg，BMI（31.56±2.62）kg/m2，精 子DFI 22.14%±7.51%。兩組上述資料均具有可比性（P均>0.05）。本研究通過(guò)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核［（2021）GSFY倫審04號(hào)］，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 治療方法對(duì)照組僅口服抗氧化劑左卡尼汀口服液（東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H19990372，規(guī)格1 g），每次1 g，3次/天。觀察組在對(duì)照組治療的基礎(chǔ)上口服益生菌地衣芽孢桿菌活菌膠囊（東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字S10950019，規(guī)格0.25 g），每次0.5 g，3次/天。兩組均治療3個(gè)月。

1.3 指標(biāo)觀察方法

1.3.1 療效兩組治療后根據(jù)2002版《世界衛(wèi)生組織男性不育標(biāo)準(zhǔn)化檢查與診療手冊(cè)》及2007版《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》評(píng)價(jià)療效：治療后DFI降至正常范圍為顯效；治療后DFI雖不正常，但有明顯降低，降低幅度≥10%為有效；治療后DFI無(wú)明顯變化，或降低幅度<10%，或升高為無(wú)效。以顯效和有效占總例數(shù)的百分比計(jì)算總有效率。

1.3.2 精子密度、形態(tài)及DFI兩組治療前后采集禁欲2～7 d的精液樣本2 mL，經(jīng)37℃恒溫箱孵育液化精液，使用采樣器吸取精液樣本10 μL，滴加于精子計(jì)數(shù)池表面，經(jīng)SSA-ⅡPLUS精子自動(dòng)檢測(cè)分析系統(tǒng)計(jì)算精子密度。取50 μL精液在載玻片上進(jìn)行涂片，自然干燥后使用WHO推薦的DIFF-QUICK快速染色試劑盒進(jìn)行染色，采用全自動(dòng)精子形態(tài)分析軟件計(jì)算精子正常形態(tài)率。采用Attune CytPix成像型流式細(xì)胞儀測(cè)定DFI。所有操作由同一名檢測(cè)人員進(jìn)行，以確保數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)性。

1.3.3 血清人連蛋白（Zonulin）、脂多糖結(jié)合蛋白（LBP）采用ELISA法。取兩組治療前后的空腹靜脈血5 mL，3 500 r/min離心10 min，分離血清。采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清腸道通透性標(biāo)志物Zonulin、內(nèi)毒素標(biāo)志物L(fēng)BP水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.4 精液8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8OHdG）采用ELISA法。取兩組治療前后的精液，經(jīng)3 500 r/min離心10 min，采用ELISA試劑盒檢測(cè)精液氧化應(yīng)激標(biāo)志物8OHdG水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用S-W正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組療效比較觀察組顯效31例、有效35例、無(wú)效23例，總有效率74.16%（66/89），對(duì)照組分別為15、28、47例及47.78%（43/90）；觀察組總有效率明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。

2.2 治療前后兩組精子密度、正常形態(tài)率及DFI比較治療前后兩組精子密度、正常形態(tài)率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。與治療前比較，治療后兩組DFI均降低，且觀察組降低更明顯（P均<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 治療前后兩組精子密度、正常形態(tài)率及DFI比較［xˉ±s/M（P25，P75）］

2.3 治療前后兩組血清Zonulin、LBP及精液8OHdG水平比較治療后觀察組血清Zonulin、LBP及精液8OHdG水平均低于同組治療前及對(duì)照組治療后（P均<0.05）。治療前后對(duì)照組上述指標(biāo)無(wú)明顯變化（P均>0.05）。見(jiàn)表2。

表2 治療前后兩組血清Zonulin、LBP及精液8OHdG水平比較［ng/mL，M（P25，P75）］

3 討論

肥胖是21世紀(jì)人類面臨的重大社會(huì)問(wèn)題，在過(guò)去40年中，全球肥胖患病率大幅上升，從1975年的不足1%到2016年的6%～8%［8］。肥胖可誘發(fā)多系統(tǒng)疾病，例如高血壓、冠心病、胰島素抵抗、代謝綜合征、不孕癥等［9-12］。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖會(huì)改變腸上皮通透性，導(dǎo)致腸道細(xì)菌易位［13］。過(guò)多攝入脂肪可造成腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）等多種炎癥因子過(guò)度表達(dá)，從而使Zonulin大量釋放。Zonulin是一種由腸上皮和肝臟產(chǎn)生的蛋白，其C端tau樣結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞間緊密連接的細(xì)胞骨架重排相關(guān)，作用主要是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞間緊密連接，從而控制液體、大分子和白細(xì)胞在腸腔與循環(huán)系統(tǒng)之間的流動(dòng)，通常被認(rèn)為是腸通透性標(biāo)志物［14-15］。研究顯示，過(guò)度表達(dá)的Zonulin可使腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生寬松的細(xì)胞間通道，腸道內(nèi)細(xì)菌則通過(guò)此通道易位于腸腔之外［16］。這些腸道內(nèi)的革蘭陰性菌細(xì)胞壁上含有大量的免疫刺激物內(nèi)毒素黏多糖（LPS），當(dāng)LBP發(fā)現(xiàn)循環(huán)系統(tǒng)出現(xiàn)了LPS，則迅速與LPS結(jié)合形成血清脂多糖結(jié)合蛋白—內(nèi)毒素黏多糖復(fù)合物（LBP-LPS），從而激活全身炎癥反應(yīng)［17］。LBP是肝臟合成的糖蛋白，在正常狀態(tài)下LBP濃度極低，當(dāng)形成LBP-LPS復(fù)合物時(shí)，血清LBP迅速升高，可反映代謝性內(nèi)毒素血癥的嚴(yán)重程度［18］。隨著全身炎癥反應(yīng)的加劇以及內(nèi)毒素水平的升高，氧化應(yīng)激隨即發(fā)生。白細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧（ROS）是一種強(qiáng)氧化劑，在攻擊侵入循環(huán)系統(tǒng)的細(xì)菌時(shí)，可同時(shí)無(wú)差別化攻擊睪丸間質(zhì)細(xì)胞、精子細(xì)胞，可能進(jìn)一步造成精子發(fā)生核自凝、細(xì)胞核三級(jí)結(jié)構(gòu)受損、精子DNA碎片化改變、精子線粒體膜電位異常等［19］。8OHdG是鳥(niǎo)嘌呤堿基受到氧化攻擊而生成的一種氧化加合物，是國(guó)際上公認(rèn)的評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激嚴(yán)重程度的新型生物指標(biāo)，精液8OHdG水平升高反映了精液ROS的堆積，提示精子受到了氧自由基的攻擊［20］。

傳統(tǒng)的改善精子DNA完整性的治療方法是使用抗氧化劑，如左卡尼汀、天然型維生素E、維生素C等，以及多食用富含超氧化物歧化酶（SOD）的食品。左卡尼汀為水溶性抗氧化劑，是左旋肉堿的通用商品名，通常由食物中攝取或自身合成產(chǎn)生，通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)長(zhǎng)鏈脂肪酸至線粒體內(nèi)進(jìn)行β氧化，為細(xì)胞提供能量；絕大多數(shù)的內(nèi)源性左卡尼汀通常以游離形式供應(yīng)附睪組織，附睪中左卡尼汀濃度約為血漿中的2 000倍，在促使精子成熟的同時(shí)，也為精子供能，并促進(jìn)乙?；D(zhuǎn)運(yùn)出線粒體，以避免乙酰毒素對(duì)精子的損害［4］。近年來(lái)，益生菌逐漸被應(yīng)用于肥胖人群這一特殊群體，用以改善腸上皮屏障功能，減少腸道細(xì)菌易位，從而減輕炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)［20］。研究顯示，益生菌可以提高精子質(zhì)量和睪丸激素水平［19］。但益生菌聯(lián)合左卡尼汀對(duì)于DFI過(guò)高是否同樣具有治療效果，目前鮮見(jiàn)報(bào)道。

抗氧化劑治療能夠有效改善精子DNA完整性，但對(duì)于肥胖人群這一特殊群體，腸道上皮通透性升高而造成的腸道細(xì)菌易位是精子DNA完整性受損的重要致病因素，應(yīng)當(dāng)在抗氧化劑治療基礎(chǔ)上加用益生菌，從而減少腸道細(xì)菌易位，最大程度避免代謝性內(nèi)毒素血癥的出現(xiàn)，以及循環(huán)系統(tǒng)來(lái)源的ROS對(duì)精子細(xì)胞核的損傷，這可能是更適合肥胖人群的干預(yù)措施。本研究結(jié)果顯示，與治療前比較，治療后兩組DFI均降低，且觀察組降低更明顯，觀察組總有效率明顯高于對(duì)照組，提示在益生菌的基礎(chǔ)上加用左卡尼汀可更有效地改善肥胖人群的精子DNA完整性；本研究治療后觀察組血清Zonulin、LBP及精液8OHdG水平均低于同組治療前及對(duì)照組治療后，提示益生菌對(duì)代謝性內(nèi)毒素血癥、氧化應(yīng)激具有抑制作用，這種優(yōu)勢(shì)可能得益于益生菌獨(dú)特的對(duì)腸道細(xì)菌易位的抑制作用。高溫、精索靜脈反流、附睪內(nèi)血液回流障礙、生殖道感染等多種因素可使睪丸、附睪產(chǎn)生腺體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，左卡尼汀在阻止腺體內(nèi)源性氧化應(yīng)激損害方面發(fā)揮了重要作用［4］。而對(duì)于循環(huán)系統(tǒng)代謝性內(nèi)毒素血癥產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，左卡尼汀作用則相對(duì)較弱，而使用益生菌來(lái)預(yù)防腸道細(xì)菌易位，可減少循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，則可能是更適合肥胖男性這一群體的抗氧化治療方案。本研究治療前后對(duì)照組血清Zonulin、LBP及精液8OHdG水平無(wú)明顯變化，但對(duì)DFI仍有較好的改善效果，可能與部分肥胖人群左卡尼汀自身產(chǎn)生不足有關(guān)，因此外源性補(bǔ)充左卡尼汀仍可取得較好的DFI改善效果。

綜上所述，肥胖可造成腸上皮通透性增加而誘發(fā)代謝性內(nèi)毒素血癥，內(nèi)毒素水平升高可造成全身炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，由氧化應(yīng)激引發(fā)循環(huán)系統(tǒng)來(lái)源的ROS釋放會(huì)造成精子細(xì)胞核損傷、DFI升高。在傳統(tǒng)抗氧化治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合益生菌可以增強(qiáng)肥胖人群的腸道屏障功能，減少腸道細(xì)菌易位，降低或消除全身炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷，從而改善精子DNA完整性。本研究中檢測(cè)到的精液參數(shù)無(wú)法完全代表廣泛人群，此外還應(yīng)考慮不同種族人群的遺傳背景和表觀遺傳學(xué)差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，未來(lái)需進(jìn)一步完善設(shè)計(jì)進(jìn)行深入探討。