宏基因組二代測序?qū)Ψ尾扛腥痉种U菌的診斷價值

［摘要］目的探討肺泡灌洗液（BALF）行宏基因組二代測序技術（mNGS）檢測在肺部感染病人分枝桿菌診斷中的應用價值。

方法回顧性分析2021年10月—2023年4月在青島大學附屬醫(yī)院呼吸科因肺部感染住院的281例病人臨床資料和BALF病原體檢出情況。

結果281例BALF樣本的檢測陽性率為95.02%。共檢測出105種微生物，其中副流感嗜血桿菌（45.20%）是最常見的檢出菌種，其次為肺炎鏈球菌（44.48%）和假肺炎鏈球菌（32.38%）；檢測出分枝桿菌63例，總陽性率為22.42%，其中結核分枝桿菌復合群（MTBC）38例，鳥-胞分枝桿菌復合群（MAC）22例，堪薩斯分枝桿菌、慢生黃分枝桿菌和膿腫分枝桿菌各1例。MTBC的檢測結果因年齡而異（χ2=10.992，P＜0.05）；在MAC的檢測中，性別差異明顯（χ2=9.483，P＜0.01）。在MTBC和MAC分枝桿菌復合群陽性病人中，檢測到的合并感染類型存在差異（χ2=9.222，P＜0.05）。

結論mNGS可以提供快速的病原學診斷，在分枝桿菌的診斷方面具有潛力，有助于精準治療。

［關鍵詞］呼吸道感染；病原；分枝桿菌感染；全基因組測序；支氣管肺泡灌洗液

［中圖分類號］R517.9;R446.5

［文獻標志碼］A

［文章編號］2096-5532（2024）04-0591-04doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.85922818b6314448eb8e58cbc22a54e8124

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網(wǎng)絡出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240829.1446.005;2024-08-3017：30：58

Value of metagenomic next-generation sequencing in the diagnosis of pulmonary mycobacterial infections

QI Yan， LI Chuan， CAO Yiwei， CUI Shichao， XIAO Baohong， LIN Cunzhi

（Department of Tuberculosis Medicine， Qingdao Chest Hospital， Qingdao 266043， China）

; ［Abstract］ObjectiveTo investigate the application value of metagenomic next-generation sequencing （mNGS） of bronchoalveolar lavage fluid （BALF） in the diagnosis of mycobacteria in patients with pulmonary infections.

MethodsA retrospective analysis was performed for the clinical data and BALF pathogen detection results of 281 patients with pulmonary infection who were admitted to Department of Respiratory Medicine， The Affiliated Hospital of Qingdao University， from October 2021 to April 2023.

ResultsThe positive detection rate was 95.02% for the 281 BALF specimens. A total of 105 microorganisms were detected， among which Haemophilus influenzae （45.20%） was the most common bacterial pathogen， followed by Streptococcus pneumoniae （44.48%） and Streptococcus pseudopneumoniae （32.38%）. Mycobacteria was detected in 63 specimens， with a total positive rate of 22.42%， among which there were 38 specimens of Mycobacterium tuberculosis complex （MTBC）， 22 specimens of Mycobacterium avium complex （MAC）， and one specimen each of Mycobacterium kansasii，Mycobacterium lentiflavum， and Mycobacterium abscessus. The results of MTBC detection varied across ages （χ2=10.992，P<0.05）， and a significant gender difference was observed in MAC detection （χ2=9.483，P<0.01）. A significant difference in the type of co-infection was observed between the patients with positive MTBC and those with positive MAC （χ2=9.222，P <0.05）.

ConclusionThe mNGS technique can provide rapid pathogenic diagnosis and facilitate the diagnosis of mycobacteria and precise treatment.

［Key words］respiratory tract infections; noxae; mycobacterium infections; whole genome sequencing; bronchoalveolar la-

vage fluid

呼吸道感染因其高發(fā)病率、高病死率和高負擔[1-2]，仍是臨床醫(yī)生亟需解決的難題之一。雖然大多數(shù)地區(qū)的年齡標準化發(fā)病率、病死率和殘疾調(diào)整生命年率都有所下降[3]，但肺部感染仍是第四大死亡原因[4]。不同年齡組病人的主要致病菌各不相同，通常還伴有病毒和（或）真菌感染[5]。盡早明確病原體，為病人爭取更及時、更準確的治療至關重要。目前，臨床一般將痰或肺泡灌洗液（BALF）培養(yǎng)作為診斷肺部感染病原體的“金標準”，其他常規(guī)診斷方法包括涂片鏡檢、血清學和PCR等[6-7]，其缺點是培養(yǎng)周期長、覆蓋種類有限，尤其是分枝桿菌培養(yǎng)，不能滿足臨床快速、精準診斷的需要。宏基因組二代測序技術（mNGS）在明確肺部感染性疾病病原體方面具有較高的快速性和靈敏度，可以幫助臨床醫(yī)生及早準確識別病原體，明確臨床診斷，并進行及時而準確的治療[8-9]。本研究回顧性分析281例住院肺部感染病人的臨床資料，并對病人的BALF進行mNGS檢測，探討 mNGS 在肺部感染病原體（尤其是分枝桿菌）診斷中的應用價值。

1資料與方法

1.1研究對象

以2021年10月—2023年4月在青島大學附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科住院治療的281例肺部感染病人為研究對象，其中男性165例（58.72%），女性116例（41.28%），平均年齡（58.15±13.86）歲。

1.2BALF的采集與mNGS檢測

對需要明確病原體的肺部感染病人進行電子支氣管鏡檢查。在局部麻醉或舒適鎮(zhèn)靜的情況下，將電子支氣管鏡送入病變所在的支氣管肺段或肺亞段，采用防污染灌洗管在室溫下用無菌生理鹽水多次灌洗，灌洗液總量為80～100 mL，充分吸出，留取BALF約50 mL放入無菌采樣管中送檢，由南京迪飛醫(yī)學科技有限公司完成mNGS檢測。

1.3檢測方法

將按照標準采集的BALF進行mNGS檢測，經(jīng)DNA核酸提取、文庫構建和上機測序后，對所得到的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，與人類基因組序列比對；保留未匹配到的序列，與數(shù)據(jù)庫中的微生物特異性序列進行進一步比對。最終報告結合病人的臨床表現(xiàn)，確定肺部感染的病原體。

1.4統(tǒng)計學分析

采用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)和百分數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1微生物總檢出情況

從281例BALF標本中共檢出微生物105種，總陽性率為95.02%（267/281）。共檢出細菌63種，占檢出總數(shù)的60.0%，檢出前3位的分別為副流感嗜血桿菌（127例，45.20%）、肺炎鏈球菌（125例，44.48%）和假肺炎鏈球菌（91例，32.38%），其他依次為流感嗜血桿菌（47例）、銅綠假單胞菌（41例）、結核分枝桿菌復合群（MTBC，38例）、金黃色葡萄球菌（34例）、大芬戈爾德菌（30例）、肺炎克雷伯菌（24例）、紋帶棒狀桿菌（19例）、鮑曼不動桿菌復合群（19例）和其他（171例）。共檢出19種病毒，占檢出總數(shù)的18.10%，檢出前3位的分別為EB病毒（59例，21.00%）、人巨細胞病毒（40例，14.23%）和人皰疹病毒7（30例，10.68%），其他依次為人皰疹病毒1（18例）、人皰疹病毒6B（14例）和其他（28例）。共檢出真菌17種，占檢出總數(shù)的16.19%，包括曲霉菌（38例，13.52%）、白色念珠菌（29例，10.32%）、耶氏肺孢子菌（9例）、近平滑念珠菌（7例）、黑曲霉菌（5例）、黃曲霉菌（4例）和其他（18例）?？偣矙z出6種非典型病原體，占檢出總數(shù)的5.71%，包括惠普爾養(yǎng)障體11例（3.91%）、肺炎支原體8例（2.85%）、解脲脲原體2例、唾液支原體2例、微小脲原體和鸚鵡熱衣原體各1例。

2.2分枝桿菌檢出情況

在全部281例BALF樣本中，檢出MTBC 38例，鳥-胞分枝桿菌復合群（MAC）22例，堪薩斯分枝桿菌、慢生黃分枝桿菌和膿腫分枝桿菌各1例。男性和女性病人的結核分枝桿菌檢出率分別為8.90%和4.63%，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；女性病人MAC檢出率（6.05%）明顯高于男性病人（1.78%），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=9.483，P＜0.01）。63例分枝桿菌陽性病人中，痰或BALF抗酸染色陽性8例。見表1。

2.3分枝桿菌合并病毒和真菌檢出情況

在MTBC陽性病人中，36.84%（14/38）的病人僅檢出病毒，5.26%（2/38）的病人僅檢出真菌；而在MAC陽性病人中，9.09%（2/22）的病人僅檢出病毒，27.26%（6/22）的病人僅檢出真菌。兩組合并病毒和真菌檢出情況差異有統(tǒng)計學意義（χ2=9.222，P＜0.05）。見表2。

2.4不同年齡組分枝桿菌檢出情況

在MTBC檢測中，65歲以上人群的陽性率最高（4.98%），36～50歲組最低（1.78%），不同年齡組MTBC的檢出率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=10.992，P＜0.05）。在MAC檢測中，隨著病人年齡的增加，陽性率基本呈上升趨勢，其中51～65歲組陽性率最高（3.56%），但總體差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

3討論

隨著對病原體檢測技術的進步，mNGS在各種感染性疾病中的應用目前受到了廣泛的關注和認可[10-11]。mNGS檢測具有較高的靈敏度，可以幫助臨床醫(yī)生早期準確識別病原體，并為疾病精準治療提供依據(jù)[12-14]。本研究納入的281例肺部感染病人的BALF樣本中，共檢測到105種微生物，陽性率為95.02%，細菌檢出率最高的是副流感嗜血桿菌，其次為肺炎鏈球菌、假肺炎鏈球菌。這些細菌可以有條件地定植在呼吸道或鼻咽部[15]，需要結合病人的病史、臨床癥狀等檢查綜合判斷是否為致病性細菌[16]。除這些細菌外，檢出率前5位的細菌分別為銅綠假單胞菌、MTBC、金黃色葡萄球菌、大芬戈爾德菌和肺炎克雷伯菌，與LIU等[5]的研究結果基本一致。在病毒檢測中，EB病毒、人巨細胞病毒和人類皰疹病毒7的檢出率超過10%，感染這些病毒后的癥狀通常因病人的年齡和免疫狀態(tài)而異[17-18]，這些病毒在健康人群中定植，當免疫力低下時重新激活，導致呼吸道疾病。真菌中主要檢出曲霉菌、念珠菌和日本肺孢子菌，這些真菌是肺部侵襲性真菌感染的主要病原體[19-22]。

本研究所有樣本分枝桿菌檢測中，MTBC的檢出率最高，其次是MAC。不同性別間MAC的檢出率差異有統(tǒng)計學意義，但在MTBC中差異無統(tǒng)計學意義。推測檢出率的差異可能與男性病人的吸煙習慣有關，吸煙會損害人體對結核分枝桿菌的肺部免疫[23-24]。然而，女性病人的MAC檢出率明顯高于男性病人，與文獻報道相一致[25]。本研究通過分析發(fā)現(xiàn)，MTBC和MAC陽性病人在合并病毒和真菌感染方面存在統(tǒng)計學差異，MAC更有可能合并真菌感染，而MTBC更有可能合并病毒感染。不同年齡組的分枝桿菌檢出率也不盡相同，其中MTBC的檢出率不同年齡組差異有統(tǒng)計學意義，約70%的感染者年齡在50歲以上，與FERNANDES等[26]的研究結果相一致。

mNGS在判斷罕見或難以培養(yǎng)的病原菌感染方面具有突出優(yōu)勢。XIE等[27]研究表明，mNGS是肺炎診斷的重要工具，有助于指導個體化治療，減少早期未明確病原體時經(jīng)驗性用藥所致的耐藥性。此外，對于分枝桿菌、病毒和支原體等，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)條件苛刻且耗時長[28]，陽性率低；PCR或病毒抗體檢測等方法則需要預測病人的病情[29]；而mNGS可以提取和比對病變樣本中所有微生物的遺傳信息，不僅可以盡早區(qū)分結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌，還可以提高檢測時效性和靈敏度[30-33]。然而，mNGS也有其局限性，檢測結果復雜，目前仍缺乏公認的解釋標準，仍需結合傳統(tǒng)檢測結果分析。

綜上所述，mNGS檢測可以提高肺部感染病人BALF樣本的病原學陽性率，與常規(guī)方法相結合，可為臨床病例分枝桿菌、病毒和真菌的精準診斷提供指導。

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（本文編輯牛兆山）