二甲雙胍對非酒精性脂肪性肝炎小鼠脂肪酸β氧化和炎癥的影響

摘要：為探究二甲雙胍對非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝臟組織脂肪酸β氧化和炎癥的影響。本試驗(yàn)將24只健康雄性C57BL/6N小鼠，隨機(jī)分為正常組、模型組和二甲雙胍組，每組8只。正常組小鼠給予維持飼料，其余2組則給予高脂飼料。第10周時模型組和二甲雙胍組小鼠皮下注射CCl4（0.1 mL/kg，2次/周），持續(xù)6周。第10周時二甲雙胍組以二甲雙胍（250 mg/kg·d）灌胃，持續(xù)6周，第16周時安樂死各組小鼠并取樣。酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組小鼠血清中甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）以及谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平。實(shí)時熒光PCR方法測定PGC-1α、CPT-1α、ACOX-1、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，與模型組相比，二甲雙胍組小鼠空腹血糖、血清TG、TC、AST和ALT水平均有明顯降低（P<0.05），而肝組織中PGC-1α、CPT-1α、ACOX-1 mRNA的表達(dá)顯著提高（P<0.05），IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)顯著下降（P<0.05）。結(jié)果表明，二甲雙胍通過促進(jìn)脂肪酸β氧化以及減輕炎癥反應(yīng)，能有效改善由高脂飲食和CCl4誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎小鼠癥狀。

關(guān)鍵詞：二甲雙胍；非酒精性脂肪性肝炎；脂肪酸β氧化；炎癥；小鼠

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是一種被廣泛關(guān)注的肝臟疾病，它與許多代謝綜合征如肥胖、高血壓、糖尿病和高膽固醇等有著密切的關(guān)聯(lián)。非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等惡性疾病往往是NAFLD的延續(xù)，它們的發(fā)展會給患者帶來更重的生活壓力和健康危機(jī)[1]。當(dāng)前，非酒精性脂肪性肝炎的治療仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)，尚未找到可以推薦作為特效藥物的治療方式。二甲雙胍是口服胰島素增敏藥，一直以來都是治療高血糖和2型糖尿病的常見藥物。有研究報(bào)道，二甲雙胍可有效降低肝臟脂質(zhì)的積累[2]，但其具體機(jī)制不明。為此，本試驗(yàn)擬通過高脂飲食聯(lián)合CCl4誘導(dǎo)建立非酒精性脂肪肝動物模型，從肝細(xì)胞脂肪酸β氧化以及炎癥相關(guān)因子角度，探討二甲雙胍對NASH的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級C57BL/6N小鼠，雄性，體重20～22 g，購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（浙）2019-0001]飼養(yǎng)于蘇州系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究所SPF級動物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)[實(shí)驗(yàn)動物使用許可證編號：SYXK（蘇）2019-0029]，室溫24℃，12 h光照晝夜循環(huán)，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)期間自由飲食飲水。試驗(yàn)過程中遵循動物福利相關(guān)規(guī)定，經(jīng)蘇州系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究所動物倫理委員會批準(zhǔn)，批號為ISM-IACUC-0073-R。

1.1.2 藥物與試劑

鹽酸二甲雙胍、CCl4、橄欖油（阿拉丁生化科技股份有限公司）；高脂飼料、維持飼料（江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司）；AST、ALT、TG、TC ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）；引物設(shè)計(jì)與合成（安升達(dá)生命科學(xué)技術(shù)公司）；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑（湖南艾科瑞生物工程有限公司）。

1.1.3 主要儀器

血糖儀（蘇州爾達(dá)醫(yī)療設(shè)備有限公司）；基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技股份有限公司）；熒光定量PCR儀、紫外分光光度計(jì)、全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher公司）；全自動核酸提取儀（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠分組及干預(yù)方法

將24只小鼠采用隨機(jī)數(shù)表法分為正常組、模型組、二甲雙胍組，每組8只。正常組喂食維持飼料，模型組和二甲雙胍組小鼠參照文獻(xiàn)采用高脂飲食聯(lián)合CCl4誘導(dǎo)建立非酒精性脂肪性肝炎模型[3]，喂食高脂飼料。所有小鼠均自由進(jìn)食和飲水，持續(xù)16周，在第10周時模型組和二甲雙胍組小鼠開始皮下注射CCl4（0.1 mL/kg，每周2次），持續(xù)6周。當(dāng)小鼠血清中的TG、TC、AST和ALT含量較正常組顯著升高表示NASH模型復(fù)制成功。在造模第10周開始，二甲雙胍組以二甲雙胍（250 mg/kg·d）灌胃，正常組和模型組灌胃等體積的滅菌水，持續(xù)6周。

1.2.2 樣本收集

試驗(yàn)16周結(jié)束后，各組小鼠禁食不禁水12 h，采用眼眶取血測量血糖水平，剩余血液室溫靜置4 h后離心（4℃，3500 r/min，10 min）取上清，-80℃凍存?zhèn)溆?。將小鼠CO2安樂處死后，打開腹腔摘取肝臟并使用PBS沖洗血跡后-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測肝臟組織中PGC-1α、CPT-1α、ACOX-1、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平

用總RNA提取試劑盒提取肝組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用實(shí)時熒光定量PCR檢測目的基因。將樣本放入實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增儀中，設(shè)置反應(yīng)條件：步驟一，95℃預(yù)變性30 s，步驟二，95℃變性5 s、60℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。使用PGC-1α、CPT-1α、ACOX-1、IL-6、TNF-α基因引物和GAPDH內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增。同時在60～95℃進(jìn)行溶解曲線分析利用PCR儀繪出擴(kuò)增曲線，進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測小鼠血清中TG、TC、AST和ALT水平

取適量血清，按照ELISA檢測試劑盒的操作指南進(jìn)行操作。使用全波長酶標(biāo)儀來測量每組小鼠血清樣品在450 nm波長處的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算各組小鼠血清中的TG、TC、AST和ALT水平。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對NASH小鼠血糖、血脂及肝功能指標(biāo)的影響

與正常組相比，模型組血糖、TG、TC、AST、ALT均顯著上升（P<0.05）。與模型組相比，二甲雙胍組血糖、TG、TC、AST、ALT均顯著下降（P<0.05）（表1）。

2.2 二甲雙胍對NASH小鼠肝臟中脂肪酸β相關(guān)基因PGC-1α、CPT-1α、ACOX-1 mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠PGC-1α、CPT-1α、ACOX-1 mRNA表達(dá)均顯著下降（P<0.05）。與模型組比較，二甲雙胍組小鼠PGC-1α、CPT-1α、ACOX-1 mRNA表達(dá)均顯著上升（P<0.05）（表2）。

2.3 二甲雙胍對NASH小鼠肝臟中炎癥相關(guān)基因IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠IL-6、TNF-α mRNA水平顯著上升（P<0.05）。與模型組比較，二甲雙胍組小鼠IL-6、TNF-α mRNA水平顯著下降（P<0.05）（表2）。

3 討論

非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)病機(jī)制常被認(rèn)為與“二次打擊”理論有關(guān)[4]。在這一理論中，線粒體和過氧化物酶體功能異常導(dǎo)致脂質(zhì)過度氧化和損傷，引發(fā)肝細(xì)胞死亡和星狀細(xì)胞激化，最終誘發(fā)NAFLD。人體脂肪代謝是一個受多種生理因素和機(jī)制影響的復(fù)雜系統(tǒng)，包括脂肪生成、分解以及脂蛋白合成和分泌等關(guān)鍵過程。這些過程通過協(xié)同作用維持脂肪平衡，微小的變化都可能導(dǎo)致脂肪代謝失調(diào)，如肥胖或代謝綜合征。脂聯(lián)素調(diào)節(jié)通路在脂肪代謝中扮演重要角色，通過激活A(yù)MPK-ACC信號通路，增加PGC-1α表達(dá)，PGC-1α

是線粒體生物合成的關(guān)鍵因素，脂聯(lián)素對其表達(dá)程度的影響，實(shí)際上間接影響到了線粒體的生物合成，這種效應(yīng)對恢復(fù)線粒體的正常功能有著重要意義。CPT-1α是由位于線粒體外膜的完全蛋白質(zhì)組成的酶，它是使脂肪酸進(jìn)入線粒體的重要調(diào)控酶。該酶的主要功能是參與線粒體中脂肪酸β氧化的限速反應(yīng)，并促進(jìn)長鏈脂肪酸由?；o酶A轉(zhuǎn)移到肉毒堿，從而促使它們從胞漿內(nèi)移動到線粒體，并在線粒體的內(nèi)膜上進(jìn)行進(jìn)一步的β氧化[5]。ACOX-1則是過氧化物酶體β氧化系統(tǒng)中引發(fā)第一反應(yīng)的酶，并且是該反應(yīng)的限速酶。ACOX-1的任務(wù)是將極長鏈脂肪酸降解為中鏈或長鏈脂肪酸，然后運(yùn)輸至線粒體進(jìn)行更進(jìn)一步的氧化分解[6]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)二甲雙胍組PGC-1α、CPT-1α、ACOX-1的表達(dá)較模型組有顯著升高，說明二甲雙胍能夠激活A(yù)MPKrzhiYHMUNW7woI9ys8RH4kABve9pGTm8ADRFyOP7lw0=-ACC信號通道，上調(diào)PCT-1α、CPT-1α、ACOX-1的生成，增強(qiáng)線粒體和過氧化物酶體進(jìn)行的脂肪酸β氧化過程。非酒精性脂肪性肝病的主要病理特征在于肝細(xì)胞中游離脂肪酸積存量的大幅增加，超過了肝臟自身的氧化代謝能力。這種積累引發(fā)了線粒體脂肪酸β氧化的增加，從而導(dǎo)致活性氧化物（ROS）的大量生產(chǎn)。這一過量的ROS催生了強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，該反應(yīng)再進(jìn)一步激發(fā)肝細(xì)胞或Kupffer細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥因子如IL-6、TNF-α的產(chǎn)生，導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷。本研究顯示二甲雙胍可降低炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)，改善炎癥反應(yīng)。綜上所述，二甲雙胍可以通過降低血糖、調(diào)節(jié)脂肪代謝、改善氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，對NASH具有一定的治療作用，為未來臨床治療提供了新的思路。

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