基于代謝組學(xué)探究蝦青素調(diào)節(jié)對乙酰氨基酚所致小鼠肝損傷的機制

摘要：為了探究蝦青素調(diào)節(jié)對乙酰氨基酚所致小鼠肝損傷，本研究采用非靶向代謝組學(xué)方法，從代謝層面揭示蝦青素在調(diào)節(jié)對乙酰氨基酚所致小鼠肝損傷中的途徑和機制。通過多種統(tǒng)計分析方法，發(fā)現(xiàn)154種代謝物發(fā)生了顯著的回調(diào)現(xiàn)象，鑒定出其中的35種物質(zhì)在代謝過程中扮演了關(guān)鍵角色。通過對這些代謝物的分析，谷胱甘肽代謝、三羧酸循環(huán)、谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、D-谷氨酸和D-谷氨酰胺代謝、嘌呤代謝以及甘油磷脂代謝可能是蝦青素調(diào)節(jié)對乙酰氨基酚所致小鼠肝損傷的主要代謝通路。本研究將有助于解讀蝦青素調(diào)節(jié)對小鼠肝損傷的影響機制，后續(xù)也為蝦青素的深度研究和開發(fā)利用提供了一定的理

論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蝦青素；營養(yǎng)強化劑；代謝組學(xué)；生物標(biāo)志物；代謝輪廓分析

蝦青素（ASTA）是一種天然存在的類胡蘿卜素，主要出現(xiàn)在海洋微生物和動物中[1]。蝦青素具有使活性氧化劑失效、消除單線態(tài)氧分子、清除活性氧以及阻斷氧化連鎖反應(yīng)的重要功能[2]。有研究表明蝦青素在減少脂質(zhì)過氧化、平衡凋亡蛋白表達、抑制促炎細胞因子以及維護肝臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)方面有著顯著效果[3]。藥物性肝損傷（DILI）是一種由藥物本身或其代謝產(chǎn)物引發(fā)的嚴重肝部損害[4]。在現(xiàn)有的3萬多種針對各類疾病的藥物中，高達1100種藥物都有可能對肝臟造成損傷[5]。盡管乙酰氨基酚（APAP）在治療劑量下使用是安全的，但在西方國家過量使用APAP導(dǎo)致的急性肝衰竭病例仍然非常普遍[6]。

代謝組學(xué)作為一種全面而系統(tǒng)的研究手段，專注于探究生物體內(nèi)代謝物的動態(tài)變化[7]。通過對代謝物開展詳盡的定性和定量分析，能夠深入揭示代謝網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)、代謝通路的走向以及代謝調(diào)控的機制，從而進一步理解生物體的生理功能和可能出現(xiàn)的病理狀態(tài)[8]。為了更深入地理解DILI的發(fā)生、發(fā)展及其后續(xù)的調(diào)節(jié)機制，需要尋找那些合適的生物標(biāo)志物[9]。本研究將采用非靶向代謝組學(xué)的策略，揭示蝦青素在調(diào)節(jié)對乙酰氨基酚導(dǎo)致的小鼠肝損傷中的具體途徑和機制。

1 試驗材料

1.1 儀器

Dionex Ultimate 3000 UHPLC Plus（美國Thermo Fisher公司）；LTQ Orbitrap XL質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher公司）；ACQUITYTM超高效液相色譜（美國waters 公司）；AL104電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；TGL-16臺式高速冷凍離心機（廣州吉迪儀器有限公司）；NV-15G氮吹濃縮儀（天津津騰實驗設(shè)備有限公司）；FSH-2高速勻漿機（上海達洛科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

對乙酰氨基酚（純度99.0%，北京華邁科生物科技有限公司）；ASTA對照品（純度98.0%，Sigma-Aldrich）；ASTA原料藥（純度96.0%，北京華邁科生物科技有限公司）；甲醇（色譜純，美國Sigma公司）；乙腈（色譜純，美國Sigma公司）；甲基叔丁基醚（分析純，天津津東天正）；乙酸乙酯（分析純，天津津東天正）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

1.3 試驗動物

4周齡Kunming種（KM）小鼠300只，雌性和雄性各150只，體重為（21±1）g，由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（遼）2023-0002。

2 試驗方法

2.1 LC-MS參數(shù)

色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm），流動相乙腈-水，流動相梯度（0～3 min，5%～30%；3～8 min，30%～85%；8～10 min，85%～95%），流速0.2 mL/min，柱溫30℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式、負離子模式，干燥氣流11 L/min，氣體溫度350℃，毛細管電壓35 V，高分辨（30000）全掃描模式。

2.2 動物試驗及生物樣品采集

將KM小鼠隨機分為4組（n=75），即空白對照組（control，G0）、空白+給予ASTA組（ASTA組，G1）、模型組（APAP組，G2）以及模型+給予ASTA組（APAP + ASTA組，G3），每組中雌、雄個體數(shù)相等。G2組及G3組每天通過腹腔注射的方式給予小鼠150 mg/kg·d的APAP溶液，并持續(xù)至試驗最終階段。G1組及G3組小鼠分別按100 mg/kg·d灌胃給予ASTA混懸液。G0組腹腔注射、灌胃和G2組灌胃使用等體積生理鹽水替代。

分別取第0、1、2、3、4周給藥后2 h各組小鼠肝組織勻漿離心液進行分析。取小鼠組織勻漿液250 μL，加入0.25 mL ZnSO4—乙腈混合溶液750 μL（40∶60，v/v），

渦旋混合1 min，離心（16 000 r/min）10 min，轉(zhuǎn)移上清液置另一離心管中，35℃氮氣流下?lián)]干，殘渣加乙腈200 μL復(fù)溶，超聲2 min，渦旋振蕩30 s，轉(zhuǎn)移至另一離心管中，離心（16 000 r/min）10 min，取上清液進樣分析。

2.3 數(shù)據(jù)處理

利用Analyst TF 1.6軟件收集原始數(shù)據(jù)后，通過python scikit-learn機器學(xué)習(xí)庫對數(shù)據(jù)進行峰對齊和去噪處理，導(dǎo)出數(shù)據(jù)矩陣。對數(shù)據(jù)進行列歸一化，不同組別的樣本，運用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA）進行差異分析。篩選化合物，通過比對在線數(shù)據(jù)庫METLIN和HMDB中的質(zhì)譜信息來鑒定潛在的生物標(biāo)志物。使用MetaboAnalyst 4.0在線數(shù)據(jù)庫對檢測到的潛在生物標(biāo)志物進行代謝途徑分析以探究相關(guān)的生物學(xué)機制。

3 結(jié)果與分析

3.1 代謝輪廓分析

選取第2周的數(shù)據(jù)進行非靶向代謝組學(xué)實驗。對4種實驗數(shù)據(jù)進行PCA分析，在圖1中顯示各組樣本在PC1和PC2維度上表現(xiàn)出較好的分離趨勢。值得注意的是，G0組與G1組小鼠得分也出現(xiàn)明顯的分離，這可能是因為更換環(huán)境飼養(yǎng)、給藥及實驗環(huán)境干擾，使小鼠在一定程度上產(chǎn)生應(yīng)激，造成一定程度的肝損傷，而因為ASTA的存在使G1組小鼠肝損傷程度較低。

為了使不同組別間的數(shù)據(jù)實現(xiàn)進一步分離，本試驗采用Permutation test和5-fold交叉驗證得到模型評價參數(shù)R2Y和Q2，結(jié)果如圖2顯示：2條擬合直線的斜率為正，R2Y和Q2的終值分別為0.9989和0.9430，截距分別為-0.58和0.97，說明模型的可解釋性和可預(yù)測性均良好，模型不存在過擬合現(xiàn)象，可以對未知樣品進行預(yù)測。

3.2 差異代謝物篩選

通過t檢驗和VIP火山圖分析2種單變量分析方法對G0與G2，G2與G3組間差異進行分析。P＜0.05和VIP＞1的代謝物被認為是對分類有顯著貢獻的成分，其交集在本實驗中被認為是有顯著性差異的代謝物，見圖3。

結(jié)果顯示，與G0組相比，在G2組中共發(fā)現(xiàn)354個符合上述標(biāo)準(zhǔn)的代謝物，將其整理為數(shù)據(jù)集D1，其中201種物質(zhì)上調(diào)，153種下調(diào)。同樣方法分析G2與G3組樣品，共發(fā)現(xiàn)符合標(biāo)準(zhǔn)的代謝物有326種，將其整理為數(shù)據(jù)集D2，其中上調(diào)的物質(zhì)有202種，下調(diào)的物質(zhì)有124種。將D1與D2取交集，共得到154種差異代謝物，其中95種上調(diào)，59種下調(diào)。這說明經(jīng)過ASTA干預(yù)后，其中的154種代謝物發(fā)生了回調(diào)，表明這些物質(zhì)與ASTA調(diào)節(jié)APAP肝損傷作用有關(guān)。通過匹配數(shù)據(jù)庫，鑒定出其中的35種物質(zhì)。通過層次聚類算法對篩選得到的潛在生物標(biāo)志物進行分析，如圖4所示，G0與G2組，G2與G3組能夠明顯分為2組，說明篩選的顯著性差異物質(zhì)是正確的。

利用MetaboAnalyst 4.0在線網(wǎng)站的pathway analysis模塊，基于拓撲分析（x）和富集分析（y）的評分，對篩選出的顯著性差異物質(zhì)進行通路分析。每個圓的顏色和大小分別表示P值和通路影響因子，結(jié)果表明，ASTA調(diào)節(jié)肝損傷作用的主要途徑包括谷胱甘肽代謝、三羧酸循環(huán)、谷氨酸、丙氨酸、天門冬氨酸、D-谷氨酸和D-谷氨酰胺代謝、嘌呤代謝和甘油磷脂代謝。

4 討論與結(jié)論

蝦青素作為功能性營養(yǎng)強化劑在調(diào)節(jié)健康方面具有巨大的潛力，但其活性的作用機制尚不明確，阻礙了蝦青素相關(guān)產(chǎn)品的進一步開發(fā)應(yīng)用。近年來，研究人員證實蝦青素在預(yù)防急性肝損傷和肝纖維化方面發(fā)揮著重要作用。有研究表明蝦青素可以通過激活主要影響氧化應(yīng)激、自噬和鐵死亡過程的Nrf2/HO-1途徑預(yù)防肝損傷，用ASTA治療后，細胞自噬增強，并抑制了鐵死亡，對藥物誘導(dǎo)的肝損傷起到緩解和改善的作用[10]。

通過開展小鼠肝組織勻漿液的代謝組學(xué)研究，運用多種統(tǒng)計分析方法，發(fā)現(xiàn)154種代謝物發(fā)生了顯著的回調(diào)現(xiàn)象。成功鑒定了其中的35種物質(zhì)，通過對這些代謝物的分析，發(fā)現(xiàn)它們主要涉及以下幾個主要的代謝通路：谷胱甘肽代謝、三羧酸循環(huán)、谷氨酸、丙氨酸、天門冬氨酸、D-谷氨酸和D-谷氨酰胺代謝、嘌呤代謝以及甘油磷脂代謝。這些代謝通路在維持肝臟正常功能和應(yīng)對損傷過程中起著至關(guān)重要的作用。

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