高效液相色譜法測定乳制品中泛酸的測量不確定度評定

摘 要：目的：評定高效液相色譜法測定乳制品中泛酸的測量不確定度。方法：根據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012），采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中泛酸的測定》（GB 5009.210—2023）第一法高效液相色譜法，結(jié)合不確定度評定，對乳制品中泛酸含量進(jìn)行測定后建立數(shù)學(xué)模型，分析并評定不確定度來源。結(jié)果：通過對不確定度各分量進(jìn)行量化和合成，結(jié)果顯示乳制品樣品中泛酸的含量為15.86 mg/100 g，擴(kuò)展不確定度為0.50 mg/100 g（k=2）。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)不確定度主要集中在泛酸加標(biāo)試驗(yàn)回收率、各標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合過程，相比之下，樣品的稱量及其前處理過程引入的不確定度分量相對最小。

關(guān)鍵詞：乳制品；泛酸；高效液相色譜法；不確定度

Evaluation of Measurement Uncertainty for Determination of Pantothenic Acid in Dairy Products with High Performance Liquid Chromatography

LU Yuefen， LIU Yanyun， WANG Ruogu*

（Beihai Public Inspection and Testing Center， Beihai 536000， China）

Abstract： Objective： Evaluation of uncertainty for determination of pantothenic acid in dairy products by high performance liquid chromatography. Method： According to JJF 1059.1—2012， reference to the first method of

GB 5009.210—2023， combining uncertainty assessment， established a mathematical model to determine the content of pantothenic acid in dairy products by liquid chromatography， analyzed and evaluated the sources of the uncertainty. Result： By quantifying and synthesizing the various components of uncertainty， the results showed that the content of pantothenic acid in the dairy product sample was 15.86 mg/100 g， and the extended uncertainty was

0.50 mg/100 g （k=2）. Conclusion： This experiment showed that the preparation of standard solution and curve fitting has a great influence on the accuracy of the results， and the repeatability determination has a smaller influence on the accuracy of the results.

Keywords： dairy products; pantothenic acid; high performance liquid chromatography; uncertainty

乳制品中的泛酸，也稱維生素B5，又名“遍多酸”，是一種水溶性維生素，也是人體生長發(fā)育必需的一種重要營養(yǎng)物質(zhì)，其與人體的免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)[1]，而缺乏泛酸可能會導(dǎo)致阿爾茨海默病[2]。我國預(yù)包裝食品標(biāo)簽20種可選擇營養(yǎng)成分的功能聲稱標(biāo)示情況中，泛酸的聲稱實(shí)際標(biāo)示率為0，處于最低位[3]。2023年9月6日，我國發(fā)布的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中泛酸的測定》（GB 5009.210—2023）[4]中除液相色譜法、微生物法，新增了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。目前泛酸的檢測方法還有定量毛細(xì)管電泳法[5]、膠束電動色譜法[6]等。

乳制品是本實(shí)驗(yàn)室日常抽檢的食品類別，本實(shí)驗(yàn)按照《化學(xué)分析測量不確定度評定》（JJF 1135—2005）[7]和《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[8]的要求，參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中泛酸的測定》（GB 5009.210—2023）中的液相色譜法[4]對乳制品中的泛酸進(jìn)行測定，使本實(shí)驗(yàn)室能更好地滿足《檢驗(yàn)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則》（CNAS-CL01：2018）[9]中日常檢驗(yàn)工作質(zhì)量控制的要求。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)的乳制品樣品由政府抽檢提供；D-泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.5%，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）；磷酸（分析純，成都科隆公司）；鹽酸（分析純，成都科隆）；磷酸二氫鉀（分析純，天津大茂）；七水合硫酸鋅（分析純，成都科?。晃⒖诪V膜（0.45 μm，Anpel公司）。

XS 205DU電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；XH-C旋渦混合器，常州朗越儀器制造有限公司；AS 30T超聲波振蕩器，安萊立思儀器科技（上海）有限公司；ST 40R高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾；S210 pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；1200高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）泛酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制（500 μg·mL-1）。精密稱取純度為98.5%的D-泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品55.10 mg，溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度線，搖勻后-18 ℃及以下避光保存。

（2）泛酸標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的配制（100 μg·mL-1）。精密吸取泛酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液20.0 mL于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度線，臨用現(xiàn)配。

（3）泛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制。分別精密吸取泛酸標(biāo)準(zhǔn)中間液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、8.0 mL、16.0 mL和32.0 mL于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度線，得到濃度分別為1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1、8.0 μg·mL-1、16.0 μg·mL-1和32.0 μg·mL-1的泛酸標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，以供高效液相色譜儀測定。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5 g試樣（精確至0.001 g）于100 mL錐形瓶中，加入約30 mL 40 ℃溫水，超聲提取20 min。用0.1 mol·L-1的鹽酸溶液將樣品pH值調(diào)節(jié)至5.0±0.1，然后加入0.5 mol·L-1的硫酸鋅溶液5 mL，確保充分混合后轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度并充分混勻后轉(zhuǎn)入離心管，8 000 r·min-1離心2 min后收集清液過0.45 μm濾膜，濾液待上機(jī)測定。

1.2.3 高效液相色譜測定條件

色譜柱Agilent Eclipse XDB–C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃；流動相組成：0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液-乙腈（95+5）；流速：0.8 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：200 nm。

1.3 數(shù)學(xué)模型的建立

試樣中泛酸含量的計(jì)算公式為

（1）

式中：X為試樣中泛酸含量，mg/100 g；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣溶液中泛酸的質(zhì)量濃度，μg·mL-1；m為試樣的取樣量，g；V為試樣測定液總體積，mL；f為加標(biāo)試驗(yàn)的回收率，%；為換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度分量的來源分析

本實(shí)驗(yàn)不確定度來源主要由標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合、乳制品的稱量及其前處理過程、測量重復(fù)性和加標(biāo)試驗(yàn)回收率組成。

2.2 泛酸各標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（c）

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（c1）

（1）標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（B）。泛酸證書顯示純度為98.5%，k=2，擴(kuò)展不確定度為0.5%，則泛酸標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）泛酸稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（m）。稱取55.10 mg泛酸標(biāo)準(zhǔn)品，感量為0.01 mg的天平檢定證書中示值誤差為±0.05 mg，按矩形分布計(jì)算，泛酸稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（3）使用100 mL容量瓶配制泛酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（V）。依據(jù)《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）[10]，100 mL A級容量瓶20 ℃時(shí)，容量允差為±0.10 mL，按照均勻分布計(jì)算，則體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為實(shí)驗(yàn)室溫度（20±5）℃，溶劑水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4 ℃-1，按照均勻分布計(jì)算，由環(huán)境溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為使用100 mL容量瓶配制泛酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為綜上，標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（c2）

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制過程中使用到100 mL A級容量瓶、1 mL、2 mL、3 mL、5 mL、15 mL、20 mL和25 mL單標(biāo)線吸量管[10]。溶劑水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4 ℃-1，不確定度來源主要由各量器本身和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度（20±5）℃組成，詳見表1。故該配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（c3）

根據(jù)表2數(shù)據(jù)，以泛酸濃度為橫坐標(biāo)，泛酸色譜峰面積平均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=16.391C-2.439 4，r2=0.999 9。

對乳制品樣品連續(xù)測定6次，經(jīng)校準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)得到平均質(zhì)量濃度C0=15.86 μg·mL-1，擬合過程引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式為

（2）

（3）

式中：S為泛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差；C0為乳制品樣品中泛酸含量，15.86 μg·mL-1；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，b=16.391；a為標(biāo)準(zhǔn)曲線截距，a=2.439 4；p為乳制品樣品測定次數(shù)，p=6；n為泛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液總測定次數(shù)，n=12；Ci為泛酸各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，μg·mL-1；為泛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液平均濃度，10.49 μg·mL-1。

經(jīng)計(jì)算得S=1.474 0，u（c3）=0.048 52 μg·mL-1，則泛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

綜上，泛酸各標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度為

2.3 樣品的稱量及其前處理過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（S）

2.3.1 乳制品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（S1）

稱取乳制品樣品5 g，天平檢定證書中示值誤差為±0.5 mg，按照均勻分布計(jì)算，乳制品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3.2 乳制品制備過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（S2）

樣品制備過程中用到50 mL的容量瓶。50 mL容量瓶（A級）的容量允差為±0.05 mL，按照均勻分布計(jì)算，乳制品制備過程中容量瓶引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為實(shí)驗(yàn)室溫度在（20±5）℃波動，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4 ℃-1，按照均勻分布計(jì)算，樣品制備過程中溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為則乳制品制備過程中由50 mL容量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為則樣品的稱量及其前處理過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.4 測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（P）

按照1.2.3步驟對乳制品樣品重復(fù)測定6次，測定值分別為15.57 mg/100 g、16.04 mg/100 g、15.76 mg/100 g、16.00 mg/100 g、15.84 mg/100 g和15.93 mg/100 g，測量平均值為15.86 mg/100 g。通常按A類不確定度評定測量重復(fù)性引入的不確定度，則測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.5 加標(biāo)試驗(yàn)的回收率引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（f）

稱取6份空白乳制品樣品，分別添加500 μg·mL-1泛酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.50 mL，按照1.2.2步驟進(jìn)行處理，每份樣品各進(jìn)樣2次后，計(jì)算回收率為98.0%、103.1%，則泛酸加標(biāo)試驗(yàn)的回收率引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.6 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度

乳制品中泛酸含量測定的相對合成不確定度為依據(jù)《化學(xué)分析測量不確定度評定》（JJF 1135—2005）[7]，當(dāng)置信概率P=95%時(shí)，取擴(kuò)展因子k=2，則乳制品中泛酸含量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為乳制品中泛酸含量的擴(kuò)展不確定度為乳制品樣品中泛酸含量的檢測結(jié)果為（15.86±0.50）mg/100 g，k=2。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中泛酸的測定》（GB 5009.210—2023）[4]對乳制品中泛酸含量進(jìn)行測定，經(jīng)對各過程中分量的評定，結(jié)果顯示泛酸加標(biāo)試驗(yàn)回收率引入的不確定度分量＞標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合引入的不確定度分量＞測量重復(fù)性引入的不確定度分量＞樣品的稱量及其前處理過程引入的不確定度分量。在日常開展檢驗(yàn)活動時(shí)要注意，優(yōu)先使用純度更高的標(biāo)準(zhǔn)品，選用合適的經(jīng)定期檢定校準(zhǔn)的玻璃量器，同時(shí)須嚴(yán)格要求實(shí)驗(yàn)人員按實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程操作設(shè)備和執(zhí)行實(shí)驗(yàn)步驟，不斷提高實(shí)驗(yàn)人員對方法、技術(shù)、設(shè)備的操作熟練水平，降低由實(shí)驗(yàn)條件變化造成的不確定性，可有效地減少實(shí)驗(yàn)過程中的不確定度，從而提高檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

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