布魯菌鐵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子rirA基因突變株的構(gòu)建與鑒定

王 震，王 勇，張 倩，陳創(chuàng)夫*，郭 飛，李天森，張 輝，王遠(yuǎn)志，劉志強(qiáng)，3*

(1.石河子大學(xué)兵團(tuán)動(dòng)物疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832000；2.石河子大學(xué)新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000；3.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000)

研究論文

布魯菌鐵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子rirA基因突變株的構(gòu)建與鑒定

王 震1△，王 勇1△，張 倩1，2，陳創(chuàng)夫1，2*，郭 飛2，李天森1，張 輝1，王遠(yuǎn)志2，劉志強(qiáng)1，3*

(1.石河子大學(xué)兵團(tuán)動(dòng)物疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832000；2.石河子大學(xué)新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000；3.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000)

為了構(gòu)建牛布魯菌S2308(簡稱S2308)的鐵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子rirA基因突變株(S2308ΔrirA)，探討該基因?qū)ψ陨砩L的影響以及其對不同類型細(xì)胞黏附侵襲和胞內(nèi)繁殖的作用。利用同源重組和抗性替換的方法，以卡那抗性基因替換rirA基因，獲得突變株S2308ΔrirA。將親本株S2308、疫苗株RB51和突變株S2308ΔrirA在相同營養(yǎng)條件下培養(yǎng)，觀察其振蕩培養(yǎng)時(shí)的生長變化趨勢和靜置培養(yǎng)時(shí)的聚集狀態(tài)。將各菌株侵染人胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞(HPT-8)和小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)，分別檢測其黏附侵襲能力和胞內(nèi)生存能力。結(jié)果顯示，成功獲得了布魯菌rirA基因突變株且10代內(nèi)未發(fā)生回復(fù)性突變；與親本株相比，S2308ΔrirA在相同體外培養(yǎng)條件下其生長趨勢未發(fā)生明顯改變，且其凝集狀態(tài)與親本株類似；黏附侵襲試驗(yàn)顯示，S2308ΔrirA對HPT-8細(xì)胞的黏附侵襲能力顯著強(qiáng)于親本株，而其對RAW264.7的黏附侵襲能力在一定程度上弱于親本株；布魯菌胞內(nèi)生存試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，布魯菌侵染HPT-8細(xì)胞24 h后，其胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量顯著升高，而侵染巨噬細(xì)胞24 h后，S2308ΔrirA的繁殖能力明顯低于親本株。這些結(jié)果表明，鐵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子rirA基因參與了布魯菌胞內(nèi)寄生的過程，并與菌株的毒力強(qiáng)弱存在密切聯(lián)系。

布魯菌；鐵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子；人胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞；小鼠巨噬細(xì)胞

布魯菌病(Brucellosis)簡稱布病，是由布魯菌(Brucella)引起的世界范圍內(nèi)的人獸共患傳染病[1]。自20世紀(jì)80年代末，全球就有170多個(gè)國家和地區(qū)存在人獸布魯菌病。該病可引起人的波浪熱、慢性感染以及動(dòng)物的流產(chǎn)和睪丸炎等，至今尚無根治方法。布魯菌病每年在我國引起的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)億元；嚴(yán)重威脅著我國經(jīng)濟(jì)建設(shè)、人民生活健康和國家安全。

布魯菌作為一種胞內(nèi)寄生菌，其沒有經(jīng)典的毒力因子[2-3]，如莢膜、外毒素、菌毛和質(zhì)粒等。布魯菌的毒力因子是一個(gè)復(fù)雜的病原體分子網(wǎng)絡(luò)，其毒力因子的篩選主要取決于其在不同宿主細(xì)胞內(nèi)的生存和繁殖能力[4-5]。目前通過細(xì)胞模型或小鼠動(dòng)物模型成功篩選到200多個(gè)布魯菌毒力基因，功能上可劃分為12類；金屬離子攝取系統(tǒng)作為布魯菌的重要毒力因子，不僅指導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)特定的位點(diǎn)，也是各種酶所必需的共同因子。

鐵載體基因是維持布魯菌鐵代謝動(dòng)態(tài)平衡必不可少的毒力因子。布魯菌比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示，強(qiáng)弱毒株間的鐵離子攝取相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)生顯著改變[6]。然而，布魯菌鐵離子的新陳代謝是如何被調(diào)控并影響細(xì)菌毒力的機(jī)制尚不清楚。因此，本研究構(gòu)建布魯菌鐵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子rirA基因缺失株，并對其自身生長特性及其在不同細(xì)胞內(nèi)的黏附侵襲和胞內(nèi)生存能力進(jìn)行評估，為進(jìn)一步揭示布魯菌鐵代謝調(diào)控機(jī)制及其胞內(nèi)寄生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞和載體 pMD19-T(sample)載體，TaKaRa公司產(chǎn)品；大腸埃希菌(Escherichiacoli)DH5α、牛布魯菌(Brucellaabortus2308)標(biāo)準(zhǔn)株、牛布魯菌疫苗株RB51、人胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞(HPT-8)和小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)，兵團(tuán)動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；pUC19K載體，北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 布魯菌液體培養(yǎng)基(BrucellaBroth)、布魯菌固體培養(yǎng)基(BrucellaAgar)，美國BD公司產(chǎn)品；氨芐青霉素、卡那青霉素，Sigma公司產(chǎn)品，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，GIBCO公司產(chǎn)品；0.22 μm濾器，美國Milipore公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)板，COSTAR公司產(chǎn)品；TaqDNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、DNA Marker，TaKaRa公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提取試劑盒、dNTP、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物 參照GenBank上公布的卡那抗性基因Kan序列和牛布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株2308的rirA基因(BAB2-0678)序列，使用Primer 5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物(表1)，引物由北京華大基因公司合成。

表1 引物和序列Table 1 Primers and sequences

1.2 方法

1.2.1 目的基因的高保真擴(kuò)增 以牛布魯菌2308的基因組為模板，分別用rirA-N-F、rirA-N-R和rirA-C-F、rirA-C-R引物高保真擴(kuò)增rirA基因的上、下游同源臂。同時(shí)用含有卡那抗性的PUC19K質(zhì)粒為模板，以Kan-F、Kan-R為引物擴(kuò)增Kan基因。擴(kuò)增后的產(chǎn)物于15 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，特異性目的條帶用康為世紀(jì)的普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收?；厥债a(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 布魯菌rirA基因突變株自殺載體的構(gòu)建 以膠回收的rirA基因上游同源臂、卡那抗性基因和rirA下游同源臂按含量1∶1∶1混合作為模板進(jìn)行融合擴(kuò)增；以第一輪PCR的反應(yīng)產(chǎn)物為模板，以rirA-N- F和rirA-C-R為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠回收。將回收的DNA片段與pMD19-T載體連接后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,并涂布氨芐抗性LB固體平板，過夜培養(yǎng)后挑取單菌落，進(jìn)行菌液PCR鑒定，將PCR鑒定正確的菌液和質(zhì)粒送華大基因有限公司進(jìn)行測序分析。

1.2.3 布魯菌rirA基因突變株的構(gòu)建與初步鑒定 取重組自殺質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化布魯菌2308感受態(tài)細(xì)胞中，活化后涂布含氨芐和卡那霉素抗性的布魯菌固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h～72 h，篩選單克隆。以rirA-N-F和Kan-R為引物進(jìn)行PCR初步鑒定。

1.2.4 布魯菌rirA基因突變株的遺傳穩(wěn)定性檢測 將篩選的陽性布魯菌突變株經(jīng)過10次反復(fù)傳代培養(yǎng)后，分別用外部檢測引物(rirA-外檢-F/rirA-外檢-R)和內(nèi)部檢測引物(rirA-內(nèi)檢-F/rirA-內(nèi)檢-R)對布魯菌進(jìn)行PCR鑒定和遺傳穩(wěn)定性分析。檢測該缺失株有沒有發(fā)生回復(fù)性突變現(xiàn)象，并對其進(jìn)行常規(guī)的生態(tài)學(xué)觀察。

1.2.5 布魯菌生長曲線分析 從布魯菌固體培養(yǎng)基上挑取牛布魯菌S2308、RB51以及S2308ΔrirA基因突變株的單菌落，接種于布魯菌液體培養(yǎng)基中，37℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)至OD 600 nm≈0.6，然后分別將菌液稀釋到OD 600 nm≈0.1，置于37℃、170 r/min恒溫?fù)u床進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每2 h取樣1次，每次取樣20 μL菌液，用終濃度為40 g/L的甲醛滅活10 min，檢測OD 600 nm的變化，直至細(xì)菌進(jìn)入平臺(tái)期，繪制S2308、RB51以及S2308ΔrirA的生長曲線。

1.2.6 布魯菌聚集現(xiàn)象的觀察 從布魯菌固體培養(yǎng)基上挑取牛布魯菌S2308、RB51以及S2308ΔrirA基因突變株的單菌落，接種于布魯菌液體培養(yǎng)基中，37℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)至OD 600 nm≈0.6，接種至含有5 mL布魯菌液體培養(yǎng)基的透明玻璃試管中培養(yǎng)至靜止期，觀察細(xì)菌生長的聚集現(xiàn)象。

1.2.7 布魯菌黏附侵襲試驗(yàn) 將HPT-8和RAW264.7細(xì)胞分別傳代至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)單層細(xì)胞生長至80%覆蓋度時(shí)(約1×106個(gè))；分別用牛布魯菌S2308、RB51以及S2308ΔrirA基因突變株以感染復(fù)數(shù)為200∶1侵染上述兩種細(xì)胞，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、37℃環(huán)境中共孵育10、20、40、60、90、120 min后，PBS漂洗3遍，洗去培養(yǎng)液中未黏附的細(xì)菌，在含有50 μg/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基中再孵育60 min殺死胞外菌，PBS漂洗3遍后，用2 mL/L的Tritonx-100裂解細(xì)胞釋放胞內(nèi)菌，倍比稀釋后涂布布魯菌固體平板。記錄各組細(xì)菌的數(shù)量，比較S2308、RB51以及S2308ΔrirA基因突變株黏附入侵胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞的能力。

1.2.8 布魯菌胞內(nèi)生存試驗(yàn) HPT-8和RAW264.7細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)形成單層細(xì)胞(約1×106個(gè))，將牛布魯菌S2308、RB51以及S2308ΔrirA 基因突變株以200∶1的感染復(fù)數(shù)侵染細(xì)胞。37℃共孵育90 min。PBS緩沖液漂洗細(xì)胞3次，去除未感染的胞外細(xì)菌，添加含有50 μg/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基，再孵育60 min殺死胞外菌，PBS漂洗3次，更換不含有抗生素的胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，于侵染結(jié)束后的不同時(shí)間點(diǎn)(0、4、8、12、24 h)去除培養(yǎng)基，PBS漂洗3次。用2 mL/L的Tritonx-100裂解細(xì)胞，室溫放置10 min，釋放胞內(nèi)菌，將裂解液倍比稀釋以后涂布魯菌固體平板，計(jì)算CFU；比較布魯菌S2308、RB51以及S2308ΔrirA基因突變株在胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制繁殖能力。

2 結(jié)果

2.1 布魯菌rirA基因突變株的構(gòu)建

2.1.1 目的基因的高保真擴(kuò)增 以布魯菌S2308基因組為模板，對rirA 基因的上、下游同源臂序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示,獲得了大小分別約為470 bp和437 bp的特異性片段，與布魯菌 rirA基因上、下游同源臂的理論值相符；同時(shí)以pUC19K為模板擴(kuò)增卡那抗性基因Kan ，獲得的基因片段約為1 093 bp(圖1)。

A：M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1.陰性對照;2～4.rirA-N PCR產(chǎn)物;B：M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1.陰性對照;2～4.rirA-C PCR產(chǎn)物；C：M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 200;1.陰性對照;2～4.卡那抗性基因Kan PCR產(chǎn)物
A：M.DNA Marker DL 1 000;1.Negative control;2-4.PCR products of N-terminal of rirA gene;B：M.DNA Marker DL 1 000;1.Negative control;2-4.PCR products of C-terminal of rirA gene;C:M.DNA Marker of DL 1 200;1.Negative control;2-4.Kanamycin resistance gene
圖1 rirA基因同源臂和卡那抗性基因Kan的PCR擴(kuò)增
Fig.1 PCR amplification of rirA gene homologous arms and Kanamycin resistance gene

2.1.2 布魯菌rirA基因突變株自殺載體的構(gòu)建 使用融合PCR對獲得的rirA基因上游同源臂、Kan抗性基因和rirA基因下游同源臂三段目的基因進(jìn)行融合擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，顯示獲得了大小約2 000 bp的特異性條帶(圖2)。將回收后的融合片段與pMD19-T載體連接轉(zhuǎn)化，獲得的同源重組載體pMD19-T-ΔrirA-Kan經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證，顯示其與rirA上、下游同源臂和卡那抗性基因序列疊加的理論值一致(圖3)。經(jīng)華大基因測序顯示，其同源性為100%。

2.1.3 布魯菌S2308ΔrirA基因突變株的篩選鑒定 將同源重組質(zhì)粒pMD19-T-ΔrirA-Kan電轉(zhuǎn)化至布魯菌S2308中，通過rirA上、下游同源序列的交換，置換出染色體上的待缺失區(qū)域，獲得的卡那抗性克隆菌命名為S2308ΔrirA，用鑒定引物rirA-N-F和Kan-R對S2308ΔrirA行擴(kuò)增，結(jié)果S2308ΔrirA突變株可以擴(kuò)增出預(yù)期大小1 563 bp的特異片段，而對照組S2308的擴(kuò)增結(jié)果為陰性，表明抗性基因正確替換了rirA基因(圖4)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～3.rirA-N-K-C融合PCR產(chǎn)物M.DNA Marker DL 2 000;1-3.rirA-N-K-C fusion PCR products圖2 rirA同源臂與卡那抗性基因Kan的融合PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of fusion rirA gene homolofous arms and kanamycin resistance gene

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1.陰性對照；2～4.PMD19-T-ΔrirA-Kan重組質(zhì)粒M.DNA Marker DL 5 000;1.Negative control;2-4.PMD19-T-ΔrirA-Kan plasmid圖3 同源重組載體PMD19-T-ΔrirA-Kan的菌液PCR鑒定Fig.3 PCR verification of PMD19-T-ΔrirA-Kan plasmid

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 10 000;1.陰性對照;2.S2308;3～5.S2308ΔrirAM.DNA Marker DL 10 000;1.Negative control;2.S2308;3-5.S2308ΔrirA圖4 S2308ΔrirA突變株的篩選鑒定Fig.4 The identification of S2308ΔrirA

2.2 布魯菌rirA基因突變株的遺傳穩(wěn)定性檢測

將鑒定正確的基因突變株S2308ΔrirA傳代至第10代，突變菌株在傳代培養(yǎng)過程中與親本菌株比較，未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的變化，如突變株生長速度，菌落顏色和形態(tài)等特征。分別用內(nèi)部檢測引物和外部檢測引物對傳代菌進(jìn)行PCR驗(yàn)證，內(nèi)部引物和外部檢測引物檢測缺失前后目的片度的變化如表2。

結(jié)果顯示，構(gòu)建的基因突變株缺失前后，所擴(kuò)增的基因片段與理論值一致，說明成功獲得了相應(yīng)的突變株，并且基因突變株經(jīng)過10代連續(xù)培養(yǎng)后未發(fā)生回復(fù)突變現(xiàn)象，表明S2308ΔrirA突變株可進(jìn)行穩(wěn)定遺傳(圖5)。

表2 檢測引物及片段長度Table 2 Detection primer and fragment length

2.3 生長曲線

布魯菌S2308、RB51以及S2308ΔrirA基因突變株在相同初始濃度(OD 600 nm≈0.1)下進(jìn)行培養(yǎng)，每2 h測定一次菌液濃度(OD 600 nm)，直至細(xì)菌生長進(jìn)入平臺(tái)期。從體外培養(yǎng)的生長曲線中可以看出，S2308ΔrirA突變株在初始濃度(OD 600 nm≈0.1) 下培養(yǎng)約32 h 后，細(xì)菌進(jìn)入對數(shù)生長期；約40 h后，細(xì)菌生長進(jìn)入平臺(tái)期。雖然S2308ΔrirA、RB51和S2308菌株整體生長趨勢類似，但同一時(shí)間點(diǎn)菌株濃度存在微小差異。而且布魯菌S2308ΔrirA和RB51的生長速度明顯快于親本株2308(圖6)。

2.4 布魯菌聚集現(xiàn)象

對布魯菌親本株S2308、疫苗株RB51和S2308ΔrirA基因突變株進(jìn)行靜置培養(yǎng)，當(dāng)布魯菌生長至靜止期時(shí)，發(fā)現(xiàn)布魯菌S2308ΔΔrirA基因突變株與布魯菌親本株S2308相比，未發(fā)生明顯變化，均處于渾濁生長狀態(tài)；而布魯菌RB51株培養(yǎng)液中形成生物膜樣的聚集現(xiàn)象(圖7)。

2.5 布魯菌的黏附侵襲能力

布魯菌侵染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7過程中，隨著侵染時(shí)間的延長，布魯菌親本株S2308、疫苗株RB51和S2308ΔrirA基因突變株黏附入侵的數(shù)量逐漸增加，至40 min各菌株進(jìn)入RAW264.7的數(shù)量達(dá)到飽和。布魯菌與小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7共孵育40 min和60 min時(shí)，S2308ΔrirA基因突變株黏附侵襲能力顯著低于親本株S2308和疫苗株RB51(P<0.05)(圖8)。由此可見，rirA基因在一定程度上調(diào)控了布魯菌對巨噬細(xì)胞的入侵過程。

在胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞中，隨著細(xì)菌與胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞共孵育時(shí)間的延長，進(jìn)入胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)量逐漸增加；大約90 min各株布魯菌進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)量不再增加，胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)接近飽和；各時(shí)間段布魯菌S2308ΔrirA和RB51菌株黏附侵襲能力極顯著高于S2308(P<0.01)(圖9)。表明rirA基因可通過某些機(jī)制抑制布魯菌入侵胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞。

A：外部引物PCR檢測;M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 7 000;1.陰性對照;2.S2308;3.pMD19-T-ΔrirA-Kan質(zhì)粒;4～13.S2308ΔrirA基因突變株B：內(nèi)部引物PCR檢測;M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 4 500;1.陰性對照;2.S2308;3.pMD19-T-ΔrirA-Kan質(zhì)粒;4～13.S2308ΔrirA基因突變株A：Identification of S2308ΔrirA by outer primers;M.DNA Marker DL 7 000;1.Negative control;2.S2308;3.PMD19-T-ΔrirA-Kan positive control;4-13.S2308ΔrirA mutant strainB：Identification of S2308ΔrirA by inner primers;M.DNA Marker DL 4 500;1.Negative control;2.S2308;3.PMD19-T-ΔrirA-Kan positive control;4-13.S2308ΔrirA mutant strain

圖5布魯菌S2308ΔrirA遺傳穩(wěn)定性檢測
Fig.5 The genetic stability test ofBrucellaS2308ΔrirA

圖6 布魯菌生長曲線Fig.6 The gowth curve of Brucella strains

1.空白對照;2.S2308親本株;3.S2308ΔrirA基因突變株;4.RB51疫苗株
1.Blank control;2.S2308 strain; 3.S2308ΔrirA strain;4.RB51 strain
圖7布魯菌的聚集現(xiàn)象
Fig.7 Aggregates formed duringBrucellagrowth

圖8 布魯菌對小鼠巨噬細(xì)胞的黏附侵襲能力Fig.8 Invasive ability of Brucella to RAW264.7

2.6 布魯菌的胞內(nèi)生存能力

布魯菌侵染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7后，4 h各布魯菌菌株胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量顯著降低。與親本株S2308相比，S2308ΔrirA 基因突變株在侵染后24 h，胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量顯著性下降(P<0.01)。而RB51菌株侵染小鼠巨噬細(xì)胞后隨著時(shí)間的延長，胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量持續(xù)降低(圖10)。

在胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞中，布魯菌親本株S2308、疫苗株RB51和S2308ΔrirA基因突變株以200∶1的比例侵襲胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞90 min，在侵染后的不同時(shí)間通過胞內(nèi)布魯菌CFU的變化，比較它們在胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制繁殖能力。結(jié)果顯示，S2308、RB51和S2308ΔrirA基因突變株在侵染后12 h內(nèi)，同一菌株在不同時(shí)間點(diǎn)其胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量無顯著變化(P>0.05)；但侵染24 h后,同一菌株胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量極顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.01)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，S2308ΔrirA 基因突變株和RB51疫苗株侵染HPT-8細(xì)胞后的各個(gè)時(shí)間段,其胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量極顯著高于S2308株(P<0.01)(圖11)。

圖9 布魯菌對胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的黏附侵襲能力Fig.9 Invasive ability of Brucella to HPT-8

圖10 布魯菌在小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力Fig.10 The intracellular survival ability of Brucella in RAW264.7

圖11 布魯菌在胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)存活能力Fig.11 The intracellular survival ability of Brucella in HPT-8

由此可以發(fā)現(xiàn)，不僅布魯菌在不同細(xì)胞中的存活能力存在一定差異，而且rirA基因的缺失在一定程度上改變了其在不同細(xì)胞中的復(fù)制能力。表明rirA基因調(diào)控布魯菌的生存繁殖。

3 討論

布魯菌病是一種自然疫源性人獸共患病，可通過呼吸道、消化道、皮膚和生殖道感染宿主，以流產(chǎn)和發(fā)熱為主要特征，易引起多器官的損傷；布魯菌是布魯菌病的致病菌，其對營養(yǎng)要求嚴(yán)格，在營養(yǎng)條件較高的培養(yǎng)基中才能生長，因此細(xì)菌的生長和增殖需要大量的能量代謝以及生物大分子的合成物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，相同培養(yǎng)條件下的S2308ΔrirA基因突變株較親本株提前4 h～6 h進(jìn)入平臺(tái)期。說明rirA基因可能參與了布魯菌能量代謝和生物大分子合成等生長相關(guān)基因的調(diào)控，這也與間接論證了Martin R等提出的rirA基因參與布魯菌對鐵代謝的調(diào)控研究[7]。

本研究同時(shí)還發(fā)現(xiàn),布魯菌S2308ΔrirA基因突變株的聚集類似于布魯菌親本株2308，而布魯菌疫苗株RB51出現(xiàn)明顯的聚集現(xiàn)象，這與某些粗糙型布魯菌也會(huì)發(fā)生聚集現(xiàn)象的報(bào)道一致。聚集現(xiàn)象似乎與細(xì)菌的毒力沒有直接的關(guān)系，因?yàn)橐恍┚哂胁煌玖Φ木甓伎赡馨l(fā)生聚集現(xiàn)象[8]。細(xì)菌的聚集是生物膜形成的第一步，細(xì)菌生物膜的形成有利于其應(yīng)對惡劣環(huán)境，從而有利于細(xì)菌的生存。

很多證據(jù)已經(jīng)表明,病原致病能力與其攝取鐵的能力直接相關(guān)[9-10]。Almirón M等[11]對鐵螯合蛋白酶hemH基因的研究發(fā)現(xiàn)，缺失hemH基因的布魯菌其毒力明顯降低。布魯菌沒有典型的外毒素，因此，其毒力主要表現(xiàn)為侵襲力和繁殖力。本研究發(fā)現(xiàn)，布魯菌侵染非專業(yè)吞噬細(xì)胞時(shí)間大約90 min才可飽和進(jìn)入胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞，且S2308ΔrirA基因突變株黏附侵襲能力高于親本株S2308；同時(shí)其在滋養(yǎng)層細(xì)胞中的生存能力檢測發(fā)現(xiàn)，該突變株與親本株或疫苗株其胞內(nèi)細(xì)菌變化趨勢基本一致；而在侵染巨噬細(xì)胞試驗(yàn)中，布魯菌黏附入侵40 min細(xì)菌量達(dá)到最高水平；之前王玉飛[12]在布魯菌侵染巨噬細(xì)胞的研究中也發(fā)現(xiàn)，布魯菌45 min可飽和進(jìn)入巨噬細(xì)胞。本研究中也發(fā)現(xiàn)S2308ΔrirA在巨噬細(xì)胞內(nèi)的繁殖能力介于親本S2308和疫苗株RB51之間；這些結(jié)果說明，布魯菌對專業(yè)和非專業(yè)吞噬細(xì)胞的侵染方式存在明顯不同。已有研究表明，布魯菌進(jìn)入巨噬細(xì)胞時(shí)，或者是通過細(xì)菌同巨噬細(xì)胞表面直接接觸，或者是通過細(xì)菌表面同血清調(diào)理素間接地相互作用[13]。然而，布魯菌感染非專業(yè)吞噬細(xì)胞的早期運(yùn)輸和復(fù)制機(jī)制尚不明確[14]。因此，解析布魯菌在細(xì)胞內(nèi)的生存繁殖及其分子機(jī)制是了解布魯菌致病性的關(guān)鍵。

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ConstructionandIdentificationofIronTranscriptionFactorrirAGeneMutantofBrucella

WANG Zhen1,WANG Yong1,ZHANG Qian1，2,CHEN Chuang-fu1，2,GUO Fei2,LI Tian-sen1,ZHANG Hui1,WANG Yuan-zhi2,LIU Zhi-qiang1，3

(1.KeyLaboratoryofPreventionandControlofAnimalDisease,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang,832000,China;2.EducationKeyLaboratoryofXinjiangEndemicandEthnicDisease,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang,832000,China;3.VeterinaryResearchInstituteofXinjiangAcademyofAnimalSciences,Urumqi,Xinjiang,830000,China)

To construct the iron transcription factor rirA gene mutant (S2308ΔrirA) ofB.abortusS2308 (S2308),and explore the impact of this gene on its growth and the function of cell invasion or intracellular survival in various cells,the methods of homologous recombination and replacement were applied,and the kanamycin gene was used to replace rirA gene obtaining mutant S2308ΔrirA.The parent strain S2308,vaccine strain RB51 and mutant S2308ΔrirA were cultured in the same nutrient condition.The growth and aggregation status were recorded.Then human trophoblast cells (HPT-8) and macrophages (RAW264.7) were infected with these strains.The invasive and survival abilities were detected.The results showed that the S2308ΔrirA mutant strain was successfully obtained,and was genetically stable within 10 passages.Compared with the parent strain,the growing trends and aggregation of mutant and parent strains were coincidentinvitro.The adhesion ability of S2308 rirA was significantly stronger than that of the parent strain to HPT-8 cells,but slightly weaker to RAW264.7 cells.After 24 h post-infection,the numbers ofBrucellain HPT-8 cells were significantly increased,while the bacterial counts in RAW264.7 cells infected with S2308ΔrirA were significantly lower than that of the parent strain.All of these results indicated that the iron transcription factor rirA gene is involved in the process of intracellular parasitism ofBrucella,and closely related with the virulence.

Brucella;iron transcription factor;HPT-8;RAW264.7

2017-01-03

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)動(dòng)物疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題 (BTDJ06)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31572491，31660705)

王 震(1987-)，男，山東濰坊人，博士研究生，主要從事免疫遺傳與抗病機(jī)理研究。王 勇(1981-)，男，新疆石河子人，講師，博士，主要從事病原微生物致病機(jī)制研究。△同等貢獻(xiàn)作者。*

S852.614；Q789

A

1007-5038(2017)10-0001-07