阜新某雞場(chǎng)大腸埃希菌四環(huán)素類藥物敏感性試驗(yàn)及耐藥基因檢測(cè)

張雅為，高 鋒，劉耀川，朱江巍，魏 澍，王 軍，趙 培，趙曉彤，顧貴波

(1.遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽 110164；2.遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧營(yíng)口 115009；3.遼寧省重大動(dòng)物疫病應(yīng)急中心，遼寧沈陽 110161)

阜新某雞場(chǎng)大腸埃希菌四環(huán)素類藥物敏感性試驗(yàn)及耐藥基因檢測(cè)

張雅為1，高 鋒2，劉耀川3，朱江巍3，魏 澍1，王 軍1，趙 培1，趙曉彤1，顧貴波1

(1.遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽 110164；2.遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧營(yíng)口 115009；3.遼寧省重大動(dòng)物疫病應(yīng)急中心，遼寧沈陽 110161)

大腸埃希菌能夠引起雞大腸桿菌病，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)危害巨大。檢測(cè)阜新某雞場(chǎng)分離的33株雞源大腸埃希菌對(duì)6種臨床常用的四環(huán)素類藥物的敏感性，并對(duì)四環(huán)素耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，大腸埃希菌分離株對(duì)土霉素和脫氧土霉素高度耐藥；對(duì)四環(huán)素和多西環(huán)素中度耐藥；對(duì)金霉素和強(qiáng)力霉素敏感。在33株大腸埃希菌分離株中檢測(cè)出tetB、tetC、tetM、tetK、tetL 5種四環(huán)素耐藥基因，未檢出tetA基因，tetK檢出率最高。

雞大腸埃希菌；四環(huán)素類；耐藥；基因

大腸埃希菌為雞大腸桿菌病的主要致病菌，該菌在飼料、飲水及飼養(yǎng)環(huán)境中廣泛分布，極易造成集約化養(yǎng)雞場(chǎng)中雞大腸桿菌病大規(guī)模暴發(fā)。病雞主要以大腸埃希菌敗血癥為主[1-2]，其他癥狀包括肉芽腫、輸卵管炎癥、腹膜炎等，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。四環(huán)素類藥物作為臨床常用的廣譜抗生素，常用于治療大腸埃希菌引起的多種疾病。該類藥物主要通過抑制細(xì)菌具體蛋白合成而發(fā)揮抑菌作用。但隨著該類藥物的長(zhǎng)期使用，多種細(xì)菌包括大腸埃希菌已對(duì)其產(chǎn)生不同程度的耐藥性。目前已發(fā)現(xiàn)多種四環(huán)素類藥物的耐藥基因，大致可分為三類，即外排泵類耐藥基因、核糖體保護(hù)基因及滅活酶基因。病原菌在耐藥基因的介導(dǎo)下可對(duì)一種或多種四環(huán)素類藥物產(chǎn)生不同程度的耐受，給疾病治療及預(yù)防帶來困難[5-8]。

本試驗(yàn)對(duì)阜新某雞場(chǎng)分離的大腸埃希菌分離株進(jìn)行四環(huán)素類藥物敏感性試驗(yàn)，分析該場(chǎng)大腸埃希菌對(duì)四環(huán)素類藥物的耐藥情況。并根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)四環(huán)素類藥物耐藥基因特異性引物，篩查大腸埃希菌分離株對(duì)四環(huán)素類藥物產(chǎn)生耐藥性的分子機(jī)制，為該場(chǎng)雞大腸桿菌病治療及耐藥性機(jī)理篩查奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 33株大腸埃希菌分離株于阜新某雞場(chǎng)病死雞的肝臟中分離，大腸埃希菌分離株經(jīng)麥康凱鑒別培養(yǎng)基及腸桿菌科生化常規(guī)鑒定管鑒定，于遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心保存。大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922，遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。

1.1.2 試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)、MH(B)培養(yǎng)基、酵母提取物、麥康凱瓊脂、MH(A)瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；GoldenView染色液，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000、瓊脂糖，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；2×TaqPCR Master Mix、ddH2O，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，博邁德生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 藥物標(biāo)準(zhǔn)品 四環(huán)素(純度86.4%)、土霉素(純度93.3%)、多西環(huán)素(純度76.3%)，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品；金霉素(純度73.3%)、強(qiáng)力霉素(純度82.3%)、脫氧土霉素(純度86.6%)，北京中海生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、立式不銹鋼高壓蒸汽滅菌消毒器、無菌潔凈工作臺(tái)、微量可調(diào)節(jié)加樣器(Eppendorf)、電動(dòng)移液器(Thermo)、梯度PCR擴(kuò)增儀(T100 Thermal Cycler BIO-RAD)、數(shù)碼凝膠成像與分析系統(tǒng)(Gel Dox XR+ Bio-Rad)等，遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。

1.2 方法

1.2.1 藥物最小抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)測(cè)定 根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(Clinical Laboratory Standards Institute， CLSI)2013版推薦的方法，采用微量肉湯稀釋法測(cè)定6種四環(huán)素類藥物對(duì)33株大腸埃希菌分離株的最小抑菌濃度。

1.2.1.1 凍存菌的活化 將保存于-20 ℃的33株雞大腸埃希菌分離株甘油菌，以劃線培養(yǎng)的方式接種于無菌的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中，并于37℃倒置過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，挑取培養(yǎng)基中的典型的有紅色金屬光澤的圓形菌落，接種于無菌的NB肉湯培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD 600 nm=0.6～0.8之間后可用于試驗(yàn)。

1.2.1.2 四環(huán)素類藥物的配制 根據(jù)CLSI推薦方法及藥物標(biāo)準(zhǔn)品的有效成分含量，用相應(yīng)的溶劑對(duì)藥物進(jìn)行配置。將藥物配制成終濃度為1 280 μg/mL的原藥液，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 MIC測(cè)定 測(cè)定藥物MIC時(shí)，將培養(yǎng)的菌液用M-H肉湯進(jìn)行1 000倍稀釋，將菌液稀釋成濃度為1×105CFU/mL的工作菌液。同時(shí)采用倍比稀釋法將抗菌藥物進(jìn)行稀釋，使藥液的濃度范圍在0.25 μg/mL～128 μg/mL之間。將100 μL菌液及100 μL藥液加入96孔U型底細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃過夜培養(yǎng)。以能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最小濃度為該藥物的MIC，每個(gè)分離株重復(fù)3個(gè)平行，以大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922為質(zhì)控菌。

1.2.2 四環(huán)素類耐藥基因篩查

1.2.2.1 大腸埃希菌分離株基因組DNA提取 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書操作步驟，對(duì)大腸埃希菌分離株基因組DNA進(jìn)行提取。大腸埃希菌分離株活化、培養(yǎng)方法參考步驟1.2.1.1。提取的基因組DNA經(jīng)15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取效果。

1.2.2.2 四環(huán)素類耐藥基因引物合成 根據(jù)NCBI中GenBank已公布的四環(huán)素耐藥基因序列，使用Primer軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行合成。具體的基因名稱、引物序列等信息見表1。

1.2.2.3 耐藥基因PCR擴(kuò)增 耐藥基因PCR反應(yīng)體系見表2。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 30 s，47 ℃～56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35個(gè)循環(huán)；最終72℃ 7 min后于4℃保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用15 g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

表1 四環(huán)素耐藥基因引物序列Table 1 The primer sequences of tetracycline resistance genes

表2 四環(huán)素耐藥基因PCR反應(yīng)體系Table 2 PCR reaction system of tetracycline resistance genes

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希菌分離株藥物敏感性試驗(yàn)

33株雞大腸埃希菌分離株對(duì)受試的6種四環(huán)素類藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，33株雞大腸埃希菌分離株對(duì)受試的6種四環(huán)素類藥物已產(chǎn)生不同程度的耐藥性，其中對(duì)土霉素及脫氧土霉素耐藥率最高，分別為90.9%及84.8%；對(duì)四環(huán)素和多西環(huán)素耐藥率相對(duì)較高，分別為63.6%和30.3%；對(duì)金霉素和強(qiáng)力霉素較為敏感，耐藥率分別為18.2%和12.1%。

2.2 大腸埃希菌分離株基因組DNA提取結(jié)果

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，提取33株雞大腸埃希菌分離株的基因組DNA，提取的基因組DNA經(jīng)15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，部分提取結(jié)果見圖1。

2.3 四環(huán)素耐藥基因篩查結(jié)果

以大腸埃希菌分離株基因組DNA為模板，6種四環(huán)素類耐藥基因引物對(duì)分離株耐藥基因攜帶情況進(jìn)行篩查，檢測(cè)出攜帶tetB、tetC、tetL、tetK、tetM基因，未檢出tetA基因(圖2)。

表3 大腸埃希菌分離株藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Drug sensitivity test results of E.coli isolates

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1～8.部分大腸埃希菌分離株基因組DNAM.DNA Marker DL 5 000;1-8.Genomic DNA of E.coli isolates圖1 部分大腸埃希菌基因組DNA電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of genomic DNA of E.coli isolates

四環(huán)素類耐藥基因篩查結(jié)果表明，在33株大腸埃希菌分離株中，共檢出6株tetB陽性菌株、5株tetC陽性菌株、5株tetM陽性菌株、11株tetK陽性菌株、9株tetL陽性菌株，未檢出tetA陽性株。tetA、tetB、tetC、tetM、tetK、tetL的檢出率分別為0(0/36)、16.7%(6/36)、13.9%(5/36)、13.9%(5/36)、30.6%(11/36)、25%(9/36)。tetK為該場(chǎng)雞大腸埃希菌主要四環(huán)素耐藥基因。

33株大腸埃希菌分離株中最多攜帶3種篩查的耐藥基因，攜帶0～3種耐藥基因的菌株分別占21.2%(7/33)、54.5%(18/33)、18.2%(6/33)、6.1%(2/33)，攜帶1種耐藥基因的菌株占比最多，其次為未攜帶耐藥基因的菌株，同時(shí)攜帶3種耐藥基因的分離株占比最少。

3 討論

雞大腸桿菌病給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。四環(huán)素類藥物作為其治療藥物之一，已廣泛使用于臨床疾病治療。由于藥物的長(zhǎng)期使用，多種病原菌在選擇壓力的作用下已對(duì)其逐漸產(chǎn)生耐藥性，給疾病治療及預(yù)防帶來困難。本試驗(yàn)結(jié)果表明，受試場(chǎng)雞大腸埃希菌分離株對(duì)臨床常用的四環(huán)素類抗菌藥物已產(chǎn)生不同程度的耐藥性。其中對(duì)土霉素及脫氧土霉素高度耐藥，對(duì)四環(huán)素及多西環(huán)素耐藥率相對(duì)較高，對(duì)金霉素和強(qiáng)力霉素較為敏感。與其他地區(qū)報(bào)道的耐藥情況不盡相同，如張揚(yáng)等[9]報(bào)道江西地區(qū)雞源大腸埃希菌分離株對(duì)四環(huán)素及多西環(huán)素耐藥率較高，分別為84%和75%,劉香敏等[2]報(bào)道山東地區(qū)雞源大腸埃希菌對(duì)四環(huán)素較為敏感，李海花等[10]報(bào)道天津地區(qū)禽大腸埃希菌對(duì)金霉素耐藥性較高。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1、4、7、10、13、16.陰性對(duì)照；2、5、8、11、14、17.tetA、tetB、tetC、tetM、tetK、tetL陽性對(duì)照；3、6、9、12、15、18.tetA、tetB、tetC、tetM、tetK、tetL篩查結(jié)果M.DNA Marker DL 2 000;1,4,7,10,13,16.Negative control；2,5,8,11,14,17.tetA,tetB,tetC,tetM,tetK,tetL positive control；3,6,9,12,15,18.tetA,tetB,tetC,tetM,tetK,tetL screening result圖2 四環(huán)素類耐藥基因篩查電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of tetracycline resistance gene screening results of E.coli isolates

本試驗(yàn)在33株大腸埃希菌分離株中共篩查到tetB、tetC、tetM、tetK、tetL 5種四環(huán)素類耐藥基因，其中tetK分離率最高，為該場(chǎng)大腸埃希菌中主要的四環(huán)素類耐藥基因。耐藥基因分離情況與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道也存在差異，如張揚(yáng)等[9]在雞源大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)tetA基因，而本研究并未檢測(cè)出該基因；江西地區(qū)主要四環(huán)素耐藥基因?yàn)閠etA及tetB，而本研究飼養(yǎng)場(chǎng)中的主要耐藥基因?yàn)閠etK。不同的藥物敏感性及耐藥基因篩查結(jié)果，可能與地區(qū)間藥物使用習(xí)慣及治療方式有關(guān)[11]。

在本試驗(yàn)的33株大腸埃希菌分離株中，大部分分離株只攜帶1種四環(huán)素類耐藥基因，極少數(shù)分離株同時(shí)攜帶3種耐藥基因。說明四環(huán)素類藥物耐藥基因在病原菌，特別是大腸埃希菌中普遍存在，雖然同時(shí)攜帶3種耐藥基因的分離株較少，但由于其攜帶耐藥基因數(shù)量較多，能夠介導(dǎo)病原菌對(duì)四環(huán)素類抗生素的多藥耐藥，因此造成危害較大，需要引起注意[12]。

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TetracyclineSensitivityTestandDrugResistanceGeneDetectionofEscherichiacoliinOneChickenFarmofFuxin

ZHANG Ya-wei1, GAO Feng2, LIU Yao-chuan3, ZHU Jiang-wei3, WEI Shu1, WANG Jun1, ZHAO Pei1, ZHAO Xiao-tong1, GU Gui-bo1

(1.AnimalDiseasePreventionandControlCenterinLiaoningProvince,Shenyang,Liaoning,110164,China;2.LiaoningAgrculturalTechnicalCollege，Yingkou，Liaoning，115009，China;3.MajorAnimalEpidemicEmergencyCenterinLiaoningProvince,Shenyang,Liaoning,110161,China)

E.colicould cause chicken colibacilosis and bring huge harm to breeding industry.In this study,33E.coliisolates were obtained from a chicken breeding farm in Fuxin area,and antibiotic sensitivity test was taken out to detect the sensitivity of isolates to 6 kinds of tetracyclines which commonly used in clinical treatments.And drug resistance genes were screened.The results showed that, isolates were highly resistant to oxytetracycline and doxycyclinum,moderately resistant to tetracycline and doxycylcline,and sensitive to duomycin and deoxytetracycline.5 kinds of resistance genes were screened in 33E.coliisolates,the positive genes were tetB,tetC,tetM,tetK and tetL,none isolates was positive for tetA gene,and tetK was the major resistance gene.

E.coli;tetracyclines;antibiotic resistance;resistance gene

2016-12-13

遼寧省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(2015015)

張雅為(1981-)，女，遼寧丹東人，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)相關(guān)研究。

S852.612;S858.31

B

1007-5038(2017)10-0118-04