芒果60Co-γ、EMS誘變及SC-SSR分子標(biāo)記遺傳多樣性分析

關(guān)鍵詞：芒果；60Co-γ 射線輻射；EMS 誘變；SC-SSR 分子標(biāo)記

中圖分類號：S667.7 文獻標(biāo)志碼：A

芒果果實成熟時，風(fēng)味濃郁、果肉色澤金黃且多汁，素有“熱帶水果之王”之美譽。我國芒果種植面積位居世界第二位[1]，根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞辦統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2021年全國芒果種植面積約37.46 萬hm²，產(chǎn)量395.80 萬t[2]。芒果起源于印度和東南亞，目前我國芒果栽培品種如凱特、圣心、澳芒、帕拉英達、金白花主要來源于美國、澳大利亞、緬甸、泰國等國家。自20世紀(jì)60年代起，國內(nèi)芒果育種專家主要通過實生和雜交育種的方式來選種，已篩選出桂香芒、紅象牙、臺農(nóng)1號、金煌、貴妃、粵西1號、熱農(nóng)2號、攀西紅芒、攀育2號、景東晚芒、云熱-5007等新品種[3-5]。由于通過傳統(tǒng)的人工雜交授粉方法工作量大，且結(jié)實率低，目前芒果新品種的選育仍是通過農(nóng)家品種篩選和實生選種。自主知識產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良品種缺乏是影響我國芒果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要問題之一，想要選育出能適應(yīng)多個優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)大面積推廣種植的新品種還需較長時間。

誘變作為一種創(chuàng)造新種質(zhì)、選育新品種的實用性技術(shù)，具有變異類型豐富、變異率高、育種周期短等優(yōu)勢[6]，被廣泛應(yīng)用于果樹育種改良，常見誘變技術(shù)包括γ 射線、中子、離子束、航天、EMS、NaN3誘變，目前成功選育出柑橘、蘋果、梨、葡萄、山楂等新品種（系）[7-9]。國外1960年首次報道了芒果誘變育種研究，并且開展了相關(guān)誘變劑量篩選研究[10]。RIME 等[11]分析ArkaPuneet 芒果的EMS 誘變?nèi)后w，篩選出濃度0.8%EMS 誘變芒果矮化效果最好，育成矮化突變體新材料R8P12。SAúCO等[12]首次發(fā)現(xiàn)并報道了Gomera-1 芒果芽變四倍體。國內(nèi)廣西亞熱帶作物研究所用⁶⁰Co-γ 射線輻射芒果種子、枝條，均未獲得優(yōu)良變異材料[3]。黃鏡浩等[13]用秋水仙堿處理芒果莖尖，發(fā)現(xiàn)細胞加倍效果不明顯。近年，本課題組分別用濃度0.2% EMS 和秋水仙堿處理凱特芒果胎萌種子，篩選出抗畸形病單株和同源四倍體單株。分子標(biāo)記具有操作簡便、效率高、重復(fù)性好等特點，已成為植物基因組DNA 研究的重要手段，其中SSR、AFLP、ISSR、SRAP、SCoT、SNP 等分子標(biāo)記，已被廣泛應(yīng)用于芒果遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建、遺傳圖譜構(gòu)建、雜交子代鑒定等研究[14-19]。采用分子標(biāo)記對誘變材料進行評價，有利于篩選出適合某種植物的最佳誘變育種方法和技術(shù)，進一步提高誘變效率。SC-SSR[20]是近年基于SCoT 和ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)開發(fā)的起始密碼子-微衛(wèi)星擴增多態(tài)性分子標(biāo)記，能將標(biāo)記位點與表達序列緊密聯(lián)系，同時具有較高擴增多態(tài)性，已被應(yīng)用于獼猴桃[21]種質(zhì)資源遺傳多樣性分析和指紋圖譜構(gòu)建。芒果SC-SSR分子標(biāo)記反應(yīng)體系已建立優(yōu)化[22]。本研究以凱特芒果為材料，通過⁶⁰Co-γ 射線輻射和EMS 溶液浸泡創(chuàng)制誘變?nèi)后w材料，再用SC-SSR 分子標(biāo)記分析誘變?nèi)后w遺傳變異，為芒果誘變育種實踐提供理論依據(jù)，便于加快創(chuàng)制芒果突變體育種新材料。

1 材料與方法

1.1 材料

選用凱特芒果枝條和種子為試材，供試凱特芒果種植于四川省攀枝花市農(nóng)林科學(xué)研究院芒果科技示范園。

1.2 方法

1.2.1 ⁶⁰Co-γ 射線輻射誘變 2021 年4 月，選取直徑為1.5～2.0cm 的2年生芒果枝條10 個，在中部密集芽上1.0 cm 處短截，分別在0、3、6、9、12、15 d 調(diào)查剪口飽滿芽、裂紋芽數(shù)量，確定輻射枝條短截預(yù)處理時間。同年5 月，剪取長9 cm的短截預(yù)處理輻射接穗，送至云南華源核輻射技術(shù)有限公司進行60 Co-γ 射線輻射誘變，輻射劑量設(shè)0、10、20、30、40、50、60Gy 共7 個處理，劑量率為1 Gy/min。每處理接穗40 個，重復(fù)3次。輻射處理后，所有接穗均嫁接于3 年生緬甸8 號苗砧木，60 d 后調(diào)查成活率。相對成活率=（輻射接穗成活率/對照接穗成活率）×100%。根據(jù)接穗的不同輻射劑量對應(yīng)的相對成活率，擬合直線回歸方程y=bx+a，確定y=50%的x 值即為半致死劑量（LD），再以半致死劑量輻射處理接穗，培育一批誘變苗。

1.2.2 EMS 溶液浸泡誘變 2021年9月，用0.067 mol/L 的磷酸緩沖液（pH 7.0）配成濃度為0.2% EMS 溶液（含1%二甲基亞砜），浸泡果實生育期120 d 的種子，浸泡時間設(shè)0、2、4、6、8 h共5 個處理，每處理種子數(shù)50個，重復(fù)3 次。每浸泡1 h 輕攪動種子1 min，浸泡后用清水浸泡清洗2～3 次，每次5 min，最后按照株行距20 cm×30 cm 在砂床進行播種育苗。播種10 d 后調(diào)查萌發(fā)率，30 d 后調(diào)查成苗率和株高，擬合處理時間與相對成苗率直線回歸方程，計算EMS 溶液浸泡芒果種子半致死時間，再以半致死時間浸泡種子，培育一批誘變苗。

1.2.3 SC-SSR 分子標(biāo)記檢測 2022年9月，取0.1 g凱特芒果及其誘變材料[60Co-γ 射線輻射60株（F1～F60），EMS 溶液浸泡40 株（E1～E40）]的嫩葉，CTAB 法提取DNA，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計分別檢測DNA純度和濃度，樣品檢測合格后用于PCR 擴增，并放置于–20 ℃冰箱中保存。選SCoT、ISSR 引物各10 個（表1），用2 種引物組合對研究材料進行多態(tài)性引物篩選。PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：10 μLTaq PCR Mix，2 μL 引物（1 μmol/L），50 ng DNA模板。PCR 擴增程序參考張安世等[21]的方法，僅將循環(huán)數(shù)改為32 個。PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖膠電泳分離，再用凝膠成像系統(tǒng)拍照，其中樣品擴增條帶統(tǒng)計按照有條帶記為“1”，無條帶記為“0”。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用SAS 9.3 軟件進行方差分析，使用單因素方差分析和Duncan’s 法比較處理間的差異顯著性。整理形成標(biāo)記擴增電泳條帶（0 ，1） 矩陣數(shù)據(jù)， 用POPGENE 32 軟件計算多態(tài)性比率（PPB）、觀測等位基因（N）、有效等位基因（N）、Nei’s 遺傳多樣性指數(shù)（H）、Shannon 多樣性指數(shù)（H?）、多態(tài)性信息含量（PIC），計算參照Botstein 公式[23]。利用NTSYSpc 2.1軟件計算試驗材料的遺傳相似系數(shù)，使用非加權(quán)組平均法（UPGMA）進行聚類分析，以遺傳相似系數(shù)進行主成分分析（PCA），遺傳距離=1-遺傳相似系數(shù)。使用MEGA 7.0 軟件繪制環(huán)形遺傳聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 60Co-γ 射線輻射對枝條成活率的影響

2.1.1 短截芒果枝條密集芽的動態(tài)變化 由圖1可知，健壯芒果枝條經(jīng)中部短截處理促進截口密集芽萌動，隨處理時間增加，飽滿芽、裂紋芽數(shù)量逐漸增多，飽滿芽率高于裂紋芽率。處理時間與飽滿芽率、裂紋芽率的直線擬合方程分別為y=3.712x+29.853 （ R2=0.9595 ）、y=4.8593x–6.96（R²=0.9484）。根據(jù)擬合方程計算出輻射枝條短截預(yù)處理時間為8 d，確保采集的接穗有六成飽滿芽（59.55%）和少于四成裂紋芽（31.91%）。

2.1.2 短截芒果枝條輻射半致死劑量 由表2 可知，與對照（0 Gy）相比，接穗經(jīng)⁶⁰Co-γ 射線輻射后嫁接成活率和相對成活率均顯著降低，隨輻射劑量增加成活率和相對成活率降低幅度逐步增加。輻射劑量為60Gy 時，成活率和相對成活率分別比對照降低了67.50%和88.04%。輻射劑量與相對成活率擬合直線方程y=–1.2545x+89.356（R²=0.9312）（圖2），相關(guān)系數(shù)達極顯著水平，根據(jù)方程計算短截芒果枝條的半致死劑量（LD）為31.37 Gy。

2.2 EMS 浸泡處理對種子萌發(fā)和成苗的影響

種子在濃度為0.2% EMS 溶液中經(jīng)不同浸泡時間處理后，萌發(fā)率、成苗率、相對成苗率和株高均顯著低于對照（0 h），浸泡時間越長其降低幅度越大（表3）。浸泡2、4 h 的萌發(fā)率、成苗率和相對成苗率差異不顯著，但株高降低顯著。浸泡8 h 后的萌發(fā)率、成苗率、相對成苗率和株高最低，分別是20.67%、17.33%、40.62%和10.20 cm，分別比對照降低了60.66%、25.34% 、59.38% 和11.77 cm。不同浸泡時間的成苗率均明顯低于萌發(fā)率，隨浸泡時間的增加，萌發(fā)率降低減少，降低幅度為3.34%～38.66%。浸泡時間與相對成苗率擬合直線方程y=–6.794x+90.604（R²=0.8739）（圖3），相關(guān)系數(shù)達極顯著水平，根據(jù)方程計算芒果種子的半致死時間（LD）為5.9 h。

2.3 誘變材料SC-SSR 分子標(biāo)記分析

2.3.1 引物篩選 選取6 份材料（凱特、F7、F8、F50、E2、E8）DNA 模板用于引物篩選，從100對引物y2YRsMhBlsGLcBGupWNUgg==中篩選出多態(tài)性引物16 對（表4），用于試驗材料NAD 模板PCR 擴增分析。

2.3.2 多態(tài)性分析 基于篩選出的16 對SC-SSR 引物，對101份試驗材料進行PCR 擴增，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，擴增條帶大小主要集中在250～1000 bp 之間，共擴增出126 條帶（圖4），其中多態(tài)性條帶117 條，平均多態(tài)性條帶為7.3 條，平均多態(tài)性條帶比率為93.18%。結(jié)果表明，SC-SSR 引物擴增多態(tài)性好。

2.3.3 遺傳多樣性分析 由表4 可知，16 對引物擴增條帶分析顯示觀測等位基因數(shù)范圍為1.750～2.00，平均值為1.923；有效等位基因數(shù)范圍為1.114～1.796，平均值為1.583；Nei’s 基因多樣性指數(shù)范圍為0.093～0.430 ， 平均值為0.334 ；Shannon’s 信息指數(shù)范圍為0.178～0.619，平均值為0.493；多態(tài)性信息含量介于0.129～0.825，平均值為0.610。說明芒果誘變試驗材料遺傳多樣性豐富，SC-SSR 分子標(biāo)記適用于芒果遺傳多樣性分析。

2.3.4 遺傳相似系數(shù)分析 基于SC-SSR 分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，用NTSYSpc 2.1 軟件計算獲得的101 份試驗材料兩兩間遺傳相似系數(shù)在0.373～0.984 之間，平均為0.779。將遺傳相似系數(shù)轉(zhuǎn)換為遺傳距離作頻數(shù)分布直方圖（圖5），96.69%的遺傳距離分布在0.05～0.51 之間，遺傳距離小于0.05的有25個（0.50%），遺傳距離大于0.51 有142 個（2.81%），說明少數(shù)試驗材料間的差異性大。100 個誘變材料與對照凱特的遺傳距離為0.040～0.556，平均為0.156，F(xiàn)3 遺傳距離最小，E2 遺傳距離最大；其中60份⁶⁰Co-γ 射線輻射誘變材料與對照的遺傳距離為0.040～0.254，平均為0.103；其中40份EMS浸泡誘變材料與對照的遺傳距離在0.095～0.556之間，平均為0.259。結(jié)果表明，種子EMS 浸泡比枝條60Co-γ 射線輻射的變異大。

2.3.5 聚類分析 選遺傳距離數(shù)據(jù)，用UPGMA方法對試驗材料進行聚類分析，101 份試驗材料被分為三大類群（圖6）。Ⅰ類群共11 份試驗材料，占總數(shù)的10.89%，Ⅰ-1 亞群包括E13、E21、E22、E23、E27、E28、E31、E33、E35，Ⅰ-2 亞群包括E3和E4；Ⅱ類群共3 份試驗材料，占總數(shù)的2.97%，Ⅱ-1 亞群僅有E37，Ⅱ-2 亞群包括E2 和E7；Ⅲ 類群共87 份試驗材料，占總數(shù)的86.14%，Ⅲ-1 亞群包括E18 和E36，Ⅲ-2 亞群僅有E20，Ⅲ-3 亞群包括23 份EMS誘變、60份⁶⁰Co-γ射線輻射誘變和凱特。結(jié)果表明，不同種子EMS誘變試驗材料多數(shù)聚類在一起， 部分與枝條⁶⁰Co-γ 射線輻射誘變和凱特試驗材料聚類在一起，表明誘變處理方法基因組DNA 水平變異的差異明顯。

2.3.6 主成分分析 基于SC-SSR 標(biāo)記獲得的試驗材料遺傳相似系數(shù)，用NTSYSpc 2.1 軟件進行主成分分析，其中前3 個主成分解釋率分別為26.12%、6.75%和5.12%，以第一主成分和第二主成分作二維主成分分析圖（圖7）。101 份試驗材料被劃分為3 個類群（A、B 和C 類群），A 類群12 份，B 類群2 份，C 類群87 份。主成分分析與聚類分析結(jié)果相比較，A 類群與Ⅰ類群僅有E3、E18 和E37 劃分聚類不一致，B 類群與Ⅱ類群僅有E37 劃分聚類不一致，C 類群與Ⅲ類群僅有E13和E18 劃分聚類不一致。

3 討論

因我國保存的芒果種質(zhì)資源主要是從美國和東南亞國家引進，遺傳信息狹窄，綜合性狀優(yōu)良種質(zhì)資源數(shù)量少，人工雜交結(jié)實率低，培育突破性芒果新品種難度較大。研究認為60Co-γ、EMS等誘變是創(chuàng)制水稻、油菜、西瓜、柑橘、菊花等植物育種新材料的重要手段，通過誘變能快速構(gòu)建植物突變體基因庫，獲得更多有益的新種質(zhì)材料，可用于功能基因組學(xué)研究和品種選育[24-26]。在誘變過程中增加輻射劑量、EMS濃度或處理時間能提高誘變效率，同時也相應(yīng)提高誘變材料的致死率[27]，目前常以半致死率來確定植物誘變適宜的輻射劑量和EMS 濃度、處理時間。本研究發(fā)現(xiàn)， 輻射劑量增加嫁接成活率降低，EMS 處理時間增加萌發(fā)率和成苗率降低，與澳洲堅果[28]、白樺[29]、高粱[30]等研究結(jié)果相似。通過模擬直線方程計算出的枝條60Co-γ 射線輻射半致死劑量和種子0.2% EMS 溶液浸泡半致死處理時間，可為芒果相關(guān)誘變育種提供參考借鑒。

本研究對芒果誘變試驗材料進行SC-SSR 分子標(biāo)記分析， 16 對引物擴增條帶的PPB 為93.18%。高于羅聰?shù)萚16]應(yīng)用SCoT 標(biāo)記分析的73份芒果資源（PPB 為73.63%）和余賢美等[31]利用ISSR 標(biāo)記分析的芒果野生居群（PPB 為87.25%）。PIC 值能反應(yīng)基因變異程度高低，研究材料群體的PIC 值越大，該基因座雜合子比例就越大，提供的遺傳信息越高[32]。本研究所選的SC-SSR 標(biāo)記獲得的PIC 為0.610，高于SSR、CDDP、SRAP標(biāo)記在芒果上的應(yīng)用[33-35]，參考BOTSEIN 等[36]提出的PIC 指標(biāo)判別方法，獲得14 個SC-SSR 基因座為高度多態(tài)位點（PIC>0.50），能較好地提供遺傳信息。綜合認為，SC-SSR 標(biāo)記擴展檢測多態(tài)位點效率高，在芒果遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建、變異材料鑒定等方面研究應(yīng)用前景廣。

芒果為高度雜合的多年生果樹，種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富。報道基于SSR 熒光標(biāo)記分析國內(nèi)145 份芒果品種及其近緣野生種的遺傳相似系數(shù)在0.50～0.78 之間[15]，SSR 標(biāo)記分析國內(nèi)116 份芒果實生資源的遺傳相似系數(shù)在0.60～1.00 之間[33]，SRAP 標(biāo)記分析芒果品種貴妃、金煌及其98 株雜交F1 代群體的相似系數(shù)在0.52～0.92 之間[18]，相比較發(fā)現(xiàn)，本研究選用SC-SSR 標(biāo)記分析凱特及其100 份誘變試驗材料的遺傳相似系數(shù)在0.37～0.98 之間，遺傳多樣性更豐富，認為在可利用種質(zhì)資源有限的情況下誘變優(yōu)于實生、雜交對芒果遺傳變異的影響。進一步分析發(fā)現(xiàn)，芒果種子EMS 浸泡比枝條60Co-γ 射線輻射誘變變異大，與常媚瑕等[27]研究不同誘變方法對朝天椒種子誘變效應(yīng)和鄧仁菊等[37]誘變篩選火龍果抗寒突變體結(jié)果一致，原因可能是受2 種誘變機理差異影響所致，EMS 誘變多是堿基點突變，輻射誘變多是大片缺失或者顛換。已有研究表明不同萌發(fā)狀態(tài)的草莓種子對EMS 的敏感程度不同[38]，推測不同生育期芒果種子對EMS 的敏感程度同樣會存在差異，還需開展相關(guān)研究提高芒果種子EMS 誘變效率。

聚類分析和主成分分析結(jié)果基本一致，101份試驗材料被劃分為三大類群，Ⅰ、Ⅱ類群全部為EMS 浸泡誘變試驗材料，Ⅲ類群為凱特、部分EMS 浸泡和全部60Co-γ 射線輻射誘變試驗材料。多數(shù)EMS 誘變試驗材料聚集在一起，離凱特較遠，而多數(shù)60Co-γ 射線輻射誘變聚集在一起，離凱特較近?？梢姴煌T變方法在同種植物上誘變差異明顯，同時也可能在基因組同位點產(chǎn)生相近變異，需進一步研究探討其他誘變方法在芒果上的應(yīng)用，優(yōu)化芒果高效誘變育種技術(shù)，加快芒果突變體基因庫構(gòu)建。

4 結(jié)論

⁶⁰Co-γ 射線輻射短截預(yù)處理8d，凱特芒果枝條的半致死劑量為31.37 Gy。0.2%EMS 溶液浸泡處理果實生育期120d，凱特芒果種子的半致死時間為5.9 h。EMS 浸泡種子比⁶⁰Co-γ 射線輻射枝條更易獲得豐富的遺傳變異。