As和Ni超標礦山土壤對不同桑樹品種生長及根際微生物多樣性的影響

關鍵詞：桑樹；As；Ni；復合污染；富集；生長；根際土壤微生物；品種篩選

中圖分類號：S888；X53 文獻標志碼：A

礦山資源的開采，形成眾多廢棄尾礦庫[1]。從礦石中提取1 t 金屬會產(chǎn)生2～12 t 尾礦[2]，廢棄的尾礦中存在大量重金屬，這些重金屬有時在尾礦中比未開采的土壤高10～20 倍[3-4]。重金屬會隨地表徑流、雨水淋濾等自然作用向周邊土壤、地下水遷移，滲入土壤[5]，對周邊生態(tài)環(huán)境造成嚴重威脅[6]。我國污染耕地約有10⁸ hm²，中、重度污染耕地高達3.33×10⁶ hm²[7]。重金屬有富集作用，最終會通過食物鏈對人體健康產(chǎn)生極大危害[8-9]，攝入過量的重金屬會對人體肝臟、腎臟、消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等造成不可逆的損害[10]。閉庫尾礦庫重金屬土壤生態(tài)修復及土地再生利用[11]，不僅避免了隨意排放風險，還能增加土地使用面積，為人類活動提供更大空間，極大緩解當前人口、土地和資源矛盾，使尾礦庫產(chǎn)生更高的經(jīng)濟和社會價值[12]。

桑樹根系旺盛，抗逆性強，生物量大[13-14]，品種資源豐富，不同品種對于重金屬的耐受性和積累性存在差異[15]。桑樹對土壤復合重金屬具有一定的耐受和富集能力[16]，且大多數(shù)重金屬主要富集于根部[17-18]，而種桑養(yǎng)蠶模式可消除土壤中重金屬通過食物鏈進入人體造成累積毒害危險[19]，同時可獲得較好的經(jīng)濟和社會效益[20]，是礦山污染土地治理并實現(xiàn)作物種植結構調(diào)整的一種理想樹種[21]。桑樹通常在其地上和地下部分與各種微生物相互作用[22]，在生物圈中，桑樹與不同微生物的相互作用使它們能夠獲得廣泛的共生優(yōu)勢[23]，從而增強桑樹的生長發(fā)育以及對重金屬的脅迫耐受性[24]。桑樹根部會通過激素代謝、脅迫響應、次生代謝以及信號傳導、蛋白質代謝、轉運和細胞壁代謝參與重金屬脅迫響應[25]，改變根際微環(huán)境，影響根部土壤微生物群落結構、功能和多樣性。根際微生物可直接影響重金屬形態(tài)的遷移和轉化，因此，桑樹對重金屬的耐性和轉移具有重要作用[26]。

近年來因海南某礦區(qū)部分開采結束，產(chǎn)生廢棄尾礦庫，As 和Ni 超標。不同桑樹品種對As和Ni 復合污染的積累特性和土壤微生物的相關研究尚無報道，本研究比較3 個不同品種桑樹對礦區(qū)As 和Ni 復合污染土壤種植60 d 后不同部位對As 和Ni 的富集差異，同時采用宏基因組分析根際微生物組的差異，以明確不同桑樹品種對As和Ni 復合污染土壤的適應能力以及與桑樹根際微生物多樣性間的關系，為篩選適宜礦區(qū)生長且耐As 和Ni 復合污染的桑樹品種，以及為可促進桑樹在As 和Ni 復合污染礦山土壤生長的菌株篩選和利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1土壤采集

土樣采集地為海南省某鐵礦尾礦庫，尾礦庫土壤總體營養(yǎng)物質含量較低，無植被覆蓋，尾礦庫已閉庫。尾礦庫土壤營養(yǎng)參數(shù)：含水量為1.98%，pH 為7.80，總氮含量為0.01%，全磷含量為377.75 mg/kg，有效磷含量為0.85 mg/kg，有機碳含量為7.48 g/kg，微生物碳含量為139.69 mg/kg，微生物氮含量為49.57 mg/kg，溶解性有機碳含量為67.14 mg/kg。重金屬含量檢測為As 和Ni 超標，其中As 含量為88.19 mg/kg，達重度污染，Ni 含量為393.39 mg/kg，為中度污染。

于2022 年4 月9 日每個點按100 m×200 m 布設土壤采樣點位，共布設3 個土壤樣品采集點位，每個采樣點位采10 個分樣點的土樣并進行混合，采樣深度為0～20 cm，去除小石塊和其他非土壤成分。所取每個點位混合土壤均按照四分法各取1 kg 進行pH、重金屬含量及主要營養(yǎng)元素測定。之后在礦區(qū)土壤中補充主要營養(yǎng)元素（N、P、K）至與周邊正常土壤一致，裝入花盆中種植桑苗，種植后不再施肥。

1.2 桑苗種植及取樣

供試3 個桑樹品種分別為Y120、G62 和G12，均為同水平種植的一年生種子苗，屬于熱帶亞熱帶栽培品種，產(chǎn)量高，抗逆性強。于2022 年4 月10 日種植，隨機選取長勢一致的3 個品種各30株，并統(tǒng)一修剪至15 cm 高度，單株種植于裝有10 kg 尾礦庫土壤的花盆（直徑33 cm，高22 cm）。每個花盆之間的間距約為10 cm，每天早上8：00澆水，保持土壤相對濕度為60%～70%。以正常土壤種植為對照。60 d 后對植株和土壤分別進行采樣。

于2022 年6 月11 日對3 個桑樹品種隨機各選取9 株，并平均分成3 組，每組3 株，將每組土壤和桑樹分離，每組土壤混勻后取1000 g，研磨后過100 目篩，用于重金屬含量測定；每組桑樹分別用滅菌毛筆刷取根際土壤，土壤混勻后用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于宏基因組測序，分析不同桑樹品種根際土壤微生物的種屬變化；每組桑樹洗去根部附著土壤，用超純水沖洗，吸干水分后稱量植株鮮質量，并將根、莖和葉分開，70 ℃烘干至恒重，研磨并過100 目篩，用于重金屬含量測定。

1.3 土壤pH 及重金屬含量測定

取（10.0±0.1）g 土壤加入25 mL 水，密封、攪拌5 min，靜置2 h 后，參照NY/T 1377—2007 測定土壤pH；參照HJ 680—2013 采用原子熒光法測定土壤As 含量；采用ICP-MS 法測定土壤Cd、Cr 和Pb 含量；參照HJ 491—2019采用火焰原子吸收分光光度法測定土壤Ni 含量。

1.4 桑樹組織內(nèi)重金屬含量測定

稱取植物樣品0.50 g，加入5 mL 68%硝酸（HNO）浸泡過夜。再加入10 mL HNO、5 mLHClO 加熱消煮蒸發(fā)至透明，繼續(xù)蒸發(fā)至溶液冒濃厚白煙，冷卻，用1% HNO 沖洗過濾于25 mL比色管中，用蒸餾水定容至25 mL，采用原子分光光度計測定桑樹各部位重金屬含量。

1.5 桑樹根際土壤微生物分析

采用DNA 提取試劑盒提取所有樣品的總DNA。完成基因組DNA 提取后，使用瓊脂糖凝膠電泳（AGE）分析DNA 的純度和完整性，使用NanoDrop 檢測DNA 的純度（OD/OD），使用Qubit 對DNA 濃度進行精確定量以完成對提取DNA 的檢測。

檢測合格的DNA 樣品用超聲波破碎儀隨機打斷成長度為所需片段，然后進行末端修復，3?端加A，連接測序接頭，進行PCR 擴增與純化后，構建測序文庫。文庫構建完成后，先使用Qubit 2.0進行初步定量，稀釋文庫至1 ng/μL，隨后使用Agilent 2100 對文庫的insert size 進行檢測，insertsize 符合預期后，使用Q-PCR 方法對文庫的有效濃度進行準確定量（文庫有效濃度>2 nmol/L），以保證文庫質量。庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數(shù)據(jù)量的需求pooling 后進行PE125/150/250，使用Illumina HiSeq 2500 進行測序。

測序結束后對結果進行宏基因組信息分析，利用基因組比對軟件BWA，將過濾后的cleanreads 與宿主參考序列進行比對，將比對到宿主的序列去除后，剩余的clean reads 與細菌（或XT1ilI/ZyCE8elxefAtosg==病毒）參考序列進行比對。采用Illumina 二代測序的短序列拼接軟件SOAPdenovo，Velvet 和SPAdes 短序列組裝軟件均基于de-Bruijn 算法進行構圖，對測序序列進行簡化、糾錯；reads 取K-mer 后基于overlap 形成contig；contig 基于reads 的雙末端關系組成scaffold；最后scaffold 延伸得到組裝序列。采用MetaGeneMark 軟件對組裝序列進行基因預測，將預測出來的基因與Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，得到注釋信息。

計算不同取樣深度下Observed species 、Chao1、Simpson 和Shannon Index 4 種Alpha 多樣性指標值，繪制實際觀測到的物種稀釋曲線圖、推測出物種指數(shù)稀釋曲線圖、物種均一性稀釋曲線圖、綜合稀釋曲線圖，分析樣品間物種的類別豐富度以及物種數(shù)目的均勻度。對樣品進行Beta多樣性分析，使用Unifrac 算法計算不同樣品之間的Unifrac 距離，以Unifrac 距離繪制Heatmap，分析不同樣品之間微生物群落結構的相似性或差異性。繪制不同桑樹品種根際土壤微生物屬水平上的物種豐度熱圖，分析不同桑樹品種微生物群落菌屬組成的相似性和差異性。

1.6 數(shù)據(jù)處理

重金屬單因子污染指數(shù)（P）=土壤中污染元素的實測含量/土壤污染元素的評價標準。P≤1表示無污染，1.03.0 表示重度污染。

轉運系數(shù)（TF）=植物地上部重金屬元素含量/植物地下部重金屬元素含量。

富集系數(shù)（BCF）=植物體內(nèi)重金屬元素含量/土壤中對應重金屬元素含量。

采用Microsoft Excel 2013軟件計算不同桑樹品種根際土壤重金屬污染指數(shù)、不同桑樹品種對重金屬的富集系數(shù)以及在桑樹中的遷移系數(shù)等。采用IBM SPSS Statistic 25軟件鄧肯氏新復極差檢驗法進行差異顯著分析。

2 結果與分析

2.1 As 和Ni超標礦山土壤對不同桑樹品種生長的影響

種植60 d 后，與正常土壤種植（CK）相比，3 個桑樹品種的生長均受到不同程度的影響，其中，G62 的影響程度最小，而且長勢最好，其次為Y120，G12 影響程度最大，長勢最弱。3 個桑樹品種的株高均顯著下降，但是葉片數(shù)與株高不同，種植在尾礦庫土壤后，G62 的葉片數(shù)量增加，而G12 和Y120 的葉片數(shù)卻顯著減少（圖1，圖2）。表明桑樹品種G62 的耐脅迫能力最強，能在尾礦庫土壤中較好生長。

2.2 種植不同桑樹品種后土壤As 和Ni含量的變化

3個桑樹品種種植60 d 后，土壤pH 為7.6，As 和Ni 含量均較種植前下降。其中，種植G62后土壤As 含量從88.19 mg/kg 降至69.25 mg/kg，降低了21.47%，土壤污染指數(shù)從種植前的3.53降至2.77，從重度污染降為中度污染；種植G12后土壤As 含量降至75.08 mg/kg，降低了14.86%，土壤污染指數(shù)降至3.00，但仍為重度污染；種植Y120 后土壤As 含量降至80.79 mg/kg，降低了8.39%，土壤污染指數(shù)降至3.23，也仍為重度污染。種植G62 后土壤Ni 含量從393.39 mg/kg 降至302.72 mg/kg，降低了23.05%，土壤污染指數(shù)從種植前的2.07 降至1.59，從中度污染降為輕度污染；種植G12 后土壤Ni 含量降至246.93 mg/kg，降低了37.23%，土壤污染指數(shù)降至1.30，從中度污染降為輕度污染；種植Y120 后土壤Ni 含量降為307.32 mg/kg，降低了21.88%，土壤污染指數(shù)降為1.62，從中度污染降為輕度污染（表1）。

2.3 不同桑樹品種對As 和Ni的富集轉移能力

種植60 d 后，3 個桑樹品種As 和Ni 含量及對As 和Ni 的轉移系數(shù)及富集系數(shù)見表2。種植60 d 后，3 個桑樹品種植株內(nèi)的As 和Ni 含量存在一定差異，其中，Y120 植株內(nèi)的As 含量最高，為10.59 mg/kg，其次為G62（6.25 mg/kg），最低為G12（5.68 g/kg）。G62 的Ni 含量最高，為78.38 mg/kg，其次為Y120（71.7 mg/kg），G12最低（70.21 mg/kg）。

3個桑樹品種地上部分對As 和Ni 的轉運系數(shù)均大于1（表2），但對As 的轉移能力均低于Ni，對Ni 的轉移系數(shù)最高可達3.16（G12），最低為1.19（Y120），G62 居中，為1.74。3 個品種對As 和Ni 的富集系數(shù)均較低，在As 和Ni 重度或中度污染環(huán)境中可生長，可能存在避性而使其能夠在較高質量濃度的As 和Ni 復合污染土壤中生長，因此可作為As 和Ni 復合污染礦山土壤修復的先鋒植物。

2.4 不同桑樹品種根際土壤微生物Alpha多樣性和Beta多樣性分析

Observed species 和Chao1 分別反映了G12、G62 和Y120 根際土壤樣本中實際檢測到的微生物物種數(shù)量和外推微生物物種數(shù)量，可直觀比較不同桑樹品種根際微生物群落的物種豐富度。隨著取樣加深，曲線均趨向平坦，G12、G62 和Y120實際檢測到的物種和外推物種豐富度相近（圖3A，圖3B）。Simpson index 可衡量每個樣本中物種分布的均勻程度，Shannon index 是綜合考慮樣本中物種豐富度與均勻度的一個多樣性指數(shù)。由圖3C、圖3D 可知，3 個桑樹品種種植于尾礦庫土壤后，根際土壤微生物群落不僅在物種分布均勻度上相似，而且在物種豐富度及其相對豐度的組合方面也無顯著差異。

Unifrac 分析基于物種組成和物種豐度數(shù)據(jù)，通過計算每個群落中物種的相對豐度來評估群落的相似性和差異性。Unifrac 分析可視化結果能夠直觀展示樣本間微生物組成的相似性和差異性。每個小方格的顏色代表2 個樣本間的Unifrac 值，顏色越深表示差異越大，顏色越淺則表示相似度越高。不同桑樹品種種植于尾礦庫土壤60 d 后，G12 和G62 之間的顏色較淺，表明它們之間相似度較高，微生物群落組成具有較大相似性；Y120 與G12、G62 之間的顏色較深，表明它們之間相似度較低，微生物群落組成具有較大的差異（圖4）。

2.5 不同桑樹品種根際土壤微生物多樣性分析

種植于As 和Ni 超標礦山土壤60 d 后，不同桑樹品種根際土壤微生物屬和種水平豐度均存在顯著差異，其中G12 和G62 的物種豐富度水平相近，分別檢測到62 個和61個類群，Y120 僅檢測到50 個類群（圖5）。

不同桑樹品種根際土壤微生物屬組成分析表明，G12和G62的根際土壤微生物屬組成較為相似，而與Y120 組成具有顯著差異（圖6）。Nocardioides、Thiomonas 和Rhizobium 3 個屬在G62 根際土壤中豐富度較高，分別達5.22、3.15和2.43，顯著高于G12（1.45、0.93 和1.28）和Y120（0.48、0.15 和1.16），結合G62 根際土壤As 的污染指數(shù)下降較多，而生長情況優(yōu)于G12和Y120 的現(xiàn)象，說明這些屬可能更多地參與桑樹根際對As 的阻隔吸收或解毒，降低了其對桑樹生長的影響。Actinoplanes、Rhodopseudomonas、Pseudoxanthomonas 、Variovorax 、Achromobacte和Bradyrhizobium 6 個屬在Y120 根際土壤中的豐富度較高，分別為7.66、5.34、5.05、3.65、2.27和1.23，顯著高于G12（2.69、3.63、3.48、2.62、1.10 和0.65）和G62（1.45、3.76、0.65、2.32、0.33和0.55），結合Y120 對As 的轉運和富集系數(shù)均高于G62 和G12，這些屬可能與桑樹對As 的轉運和富集有關。相比其他2 個品種，G12 生長最差，其根際微生物中Sphaerobacter 和Brevundimonas 2 個屬的豐富度顯著高于G62 和Y120，Sphingopyxis和Sphingobium 2 個屬顯著高于G62。

不同桑樹品種根際土壤微生物種的組成分析表明（圖7），Sphingopyxis sp.、Rhodopseudomonaspalustris 和Variovorax sp.在3個桑樹品種根際土壤中的豐富度均超過2.00，其中Sphingopyxis sp.在G12 中豐富度最高，達6.01，而該品種植株內(nèi)轉移和富集的As 和Ni 均最低，說明Sphingopyxissp.可能與桑樹對As和Ni 復合污染的解毒有關。Sphingobium sp.、Actinoplanes sp.和Thiomonas sp.均超過1.00。Sphingopyxis sp.、Rhodopseudomonas palustris 、Variovorax sp. 、Sphingobium sp. 和Actinoplanes sp. 5 種菌在Y120 和G12 兩個品種根際土壤中的豐富度均顯著高于G62，可能與其更多參與桑樹對As 和Ni 復合污染的解毒有關；而Thiomonas sp.在G62 中可能與其更多參與桑樹對As 的解毒有關。

3 討論

目前，關于重金屬污染土壤對桑樹影響的研究主要集中在單一重金屬污染上，特別是鎘污染[27-29]，但是在實際的重金屬污染土壤中，土壤污染多以多種重金屬污染共存的狀態(tài)存在[30-31]，因此，研究復合重金屬污染土壤對桑樹生長的影響具有重要的理論和實踐意義。本研究開展As和Ni 復合污染礦山土壤中不同桑樹品種的生長特性和耐受性及其與根際土壤微生物多樣性的關系研究，為利用適宜當?shù)貧夂颦h(huán)境的桑樹品種修復和再利用礦山土壤提供有效途徑。

研究發(fā)現(xiàn)，在As 和Ni 重、中度污染礦區(qū)土壤中種植60d 后，3個桑樹品種地上部分的生長受到不同程度的抑制。As 可以通過磷吸收系統(tǒng)和質膜進入植物，與磷競爭結合位點[32-34]，還可以與生物大分子結合，導致結構變化和功能破壞，影響酶活性和細胞功能，并誘導氧化應激和其他對植物生長產(chǎn)生負面影響的生理反應[35-36]。然而，鄭鵬飛等[37]的研究中，As 和Cd 的污染指數(shù)遠高于本研究的礦山土壤，而供試桑樹品種湘7920生長完好，無脅迫癥狀?？赡芘c不同桑樹品種對As的耐受程度存在較大差異有關，也可能是As 和Ni 復合污染對桑樹的生長發(fā)育影響較As 和Cd復合污染更大，后續(xù)有待進一步研究證實。重金屬在植物根際細胞壁中的固定或螯合是植物生長的一個重要解毒過程[38]，在本研究中，觀察到與葉和莖相比，3 個桑樹品種在根部表現(xiàn)出更高的As 富集能力，能夠積累近一半的總As 含量，表明桑樹的根部可能具有固定As 的能力，從而降低As 對地上部分的毒性，而本研究3 個桑樹品種對As 的富集和轉運系數(shù)均較低，但對Ni 的富集和轉運系數(shù)卻均較高，同時也發(fā)現(xiàn)，不同桑樹品種的不同部位對Ni 的富集能力與As 不同，尤其是根部，3 個品種差異較大，G12 地上部分轉移Ni的能力最強，顯著強于G62 和Y120，其生長所受抑制也最強，表現(xiàn)出較少的分枝和葉片，這可能是由于Ni 脅迫引起的。研究表明，土壤中Ni含量的增加會抑制植物發(fā)芽、葉片斑點和黃化、減少根和芽的生長等，同時也會影響植物的Fe吸收，最終導致作物產(chǎn)量的損失[39]。另一方面，G62 中Ni 轉移到葉片的能力較強，可能與其生理機制的發(fā)展，如將重金屬儲存在液泡和葉脈中的主動轉運，從而降低它們的毒性并確保植物的正常生長有關[40]。研究發(fā)現(xiàn)桑樹對重金屬的富集能力Cd>Ni>Cr>As[41]，本研究的3 個桑樹品種對Ni 的富集能力強于As，且可將Ni 的污染指數(shù)從中度污染降為輕度，其中G12 使土壤Ni 含量降了37.23%，可進一步研究利用G12 作為Ni 修復的潛力和機制。

本研究中G62 在As 和Ni 污染礦山土壤中生長較好，分枝和葉片數(shù)量增多，可能與其根際土壤中的Thiomonas、Rhizobium 和Nocardioides 豐度較高有關。土壤微生物的大量繁殖會進一步提高土壤的生物肥力和物理肥力，從而提高土壤中N、P、K等礦質營養(yǎng)元素的利用率，形成良性循環(huán)，有利于植物的生長并可增強植株抗逆性[42]。Thiomonas可以利用As 作為能源自養(yǎng)，提高植物的固碳能，還可以使用As（III）作為唯一的能量來源進行自養(yǎng)生長，誘導其固碳特異性酶的表達，從而提高其固碳能[43]，G62根際土壤中的Thiomonas sp.豐度較高，可能促進了G62 對碳的固定能力，從而部分補償了土壤中碳的不足，使G62可較好生長，發(fā)出更多的分枝，長出更多的葉片。Rhizobium 對As 表現(xiàn)出高度的耐受性，并且可提高宿主根瘤數(shù)，增加宿主植株的地上部分氮含量，為植物提供可利用的氮[44-45]。G62根際土壤中的Rhizobium etli 豐度較高，可能為其他根際微生物和桑樹植株提供生物可利用的氮，在As 和Ni 超標土壤修復中發(fā)揮積極作用。Nocardioides 在多種As 污染的根際土壤中富集，與As 含量呈正相關[46]。本研究中Nocardioides sp.在生長良好的G62 根際土壤中豐富度較高，可能該品種在As 的抗性和轉化中發(fā)揮著重要作用。Rhodopseudomonas 和Bradyrhizobium均具有氧化As 的能力，能把高毒性的三價As 氧化為低毒的五價As ， 不利于植物吸收， 且Rhodopseudomonas 有多種解毒機制，可有效去除環(huán)境中As 的污染[47-48]。Y120 根際土壤中的Rhodopseudomonas palustris 和Bradyrhizobiumjaponicum 在3 個桑樹品種根際土壤中的豐度均較高，可能主要參與桑樹對As 的解毒過程。

桑樹作為我國廣泛分布的多年生木本植物，對土壤和環(huán)境的適應性強，生長速度快，根系發(fā)達，生物量大，耐剪伐，對重金屬具有一定的富集和耐受能力，在修復土壤重金屬污染方面的應用價值日益突出[47-48]。本研究中，在As 和Ni 復合污染的尾礦庫土壤中種植桑樹60 d 后，G62 的分枝數(shù)和葉片數(shù)增加，生長較好，且能使根際土壤的As 和Ni 含量分別降低21.47%和23.05%，污染指數(shù)均下降，結合其根際Rhodopseudomonaspalustris、Bradyrhizobium japonicum、Thiomonassp.、Rhizobium etli 和Nocardioides sp.豐度較高的現(xiàn)象，推薦可將G62 作為鐵礦尾礦庫修復和再利用的優(yōu)良桑樹品種，并通過進一步驗證微生物的促生作用，選擇添加合適的菌株，以更好發(fā)揮G62對As 和Ni 復合污染土壤中的修復和利用價值，不僅可通過根部吸收轉運和固定As 和Ni，桑葉用于養(yǎng)蠶，部分As 和Ni 又可轉移至蠶沙被無害化處理，實現(xiàn)尾礦生態(tài)修復和蠶桑高效安全利用模式。