基因編輯MeERF127提高木薯抗旱和耐鹽性

關(guān)鍵詞：木薯；MeERF127；基因編輯；干旱脅迫；鹽脅迫

中圖分類號(hào)：S533 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子是一類主要存在于植物中的轉(zhuǎn)錄因子大家族， 其包括5 個(gè)亞族：AP2（APETALA2）、乙烯響應(yīng)因子（ERF）、脫水響應(yīng)元件結(jié)合蛋白（DREB）、RAV 和Soloist [1]。AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子包含約60 個(gè)氨基酸的AP2DNA 結(jié)合域，能與目標(biāo)基因啟動(dòng)子處的脫水響應(yīng)元件DRE/C-repeat 元件和GCC box 元件結(jié)合互作。AP2/ERF 超家族轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物的多種發(fā)育過程，在激素調(diào)控和逆境應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[2]。目前，在很多植物中已鑒定出大量的ERF 家族成員，如水稻中存在170 個(gè)ERF 基因[3]，擬南芥中存在147 個(gè)ERF 基因[4]，小麥中存在238 個(gè)ERF基因[5]，木薯中存在155 個(gè)ERF 基因[6]。

植物通過激活各種防御機(jī)制來抵御不同來源的生物（如昆蟲和病原體的攻擊）和非生物脅迫（如干旱、高鹽和極端溫度）。AP2/ERF 家族轉(zhuǎn)錄因子主要存在于植物中，在植物逆境響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。大量的研究表明，AP2/ERF 型轉(zhuǎn)錄因子是植物生長(zhǎng)發(fā)育和激素調(diào)節(jié)的重要調(diào)控因子，如控制花的生長(zhǎng)、發(fā)育和衰老[7]，小穗分生組織的命運(yùn)[8]，根的萌生和發(fā)育[9]，葉的大小[10]，籽粒發(fā)育[11]，果實(shí)發(fā)育和成熟等[12]。大豆GmERF057在受到激素（SA、JA、ABA）和非生物脅迫（鹽、干旱）處理后，其表達(dá)會(huì)顯著增加，并且在煙草中過表達(dá)該基因還可以提高植物的耐鹽性[13]。在鹽脅迫下，過表達(dá)PagERF072 的轉(zhuǎn)基因楊樹具有較高的耐鹽性，轉(zhuǎn)基因楊樹的過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性顯著高于野生型楊樹，而丙二醛（MDA）含量則表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)[14]。在干旱和鹽脅迫下，過表達(dá)SlERF.B1 番茄明顯萎焉，脯氨酸含量顯著低于對(duì)照，丙二醛含量顯著高于對(duì)照，而基因沉默株系恰好相反，說明SlERF.B1負(fù)調(diào)控番茄的抗旱和耐鹽性[15]。

木薯（Manihot esculenta Crantz）又名樹薯、木番薯，是大戟科木薯屬雙子葉植物，因其根部富含淀粉而被廣泛種植。在南美洲、非洲和亞洲的熱帶地區(qū)，約有10 億人以木薯為生存的能量來源[16]。已有研究發(fā)現(xiàn)逆境脅迫導(dǎo)致木薯的品質(zhì)和產(chǎn)量受到一定的影響[17]。但是，ERF 基因在木薯逆境脅迫中的研究還很少，主要集中于木薯作為飼料的價(jià)值研究[18]、采后生理性變質(zhì)的研究[19-20]和木薯抵抗病蟲害的研究[21]。因此，本研究從華南8 號(hào)（SC8）木薯中克隆獲得MeERF127 基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄活性和表達(dá)模式分析， 構(gòu)建基因編輯載體獲得MeERF127 基因編輯木薯，并研究MeERF127 基因編輯木薯在干旱、鹽和低溫脅迫下的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征，為探究MeERF127 轉(zhuǎn)錄因子在木薯抗逆中的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試木薯（Manihot esculenta Crantz）為華南8 號(hào)（SC8）木薯品種，來源于國(guó)家木薯種質(zhì)資源圃。取生長(zhǎng)于組培瓶中50 d 的木薯組培苗，一部分用300 mmol/L 甘露醇溶液、400 mmol/L NaCl溶液浸沒木薯的根，另外一部分置于4 ℃冰箱，處理0、12、24、48 h 取材，將其中一半樣品立即置于液氮速凍后保存于–80 ℃冰箱待用，另外一半取材后直接進(jìn)行氧化產(chǎn)物檢測(cè)和染色。每個(gè)樣品3 個(gè)重復(fù)。

DH5α 大腸桿菌菌株、AH109 酵母菌株、LBA4404 菌株和GV3101 菌株均購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司；pMD19-T 載體、pCAMBIA1300-GFP 載體、pGBKT7 誘餌載體、基因編輯載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 MeERF127基因克隆和序列結(jié)構(gòu)分析 從木薯基因組數(shù)據(jù)網(wǎng)站（https：//phytozome.jgi.doe.gov）下載MeERF127（Manes. 15G066800）的序列，設(shè)計(jì)該基因的克隆引物（MeERF127-F： ATGAGGAGAGGAAGGGGAG，MeERF127-R： TTAAAGCCATAGAGCAGTAC）。以SC8 木薯組培苗cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增MeERF127 編碼區(qū)片段，反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物切膠回收，得到純化產(chǎn)物連接pMD19-T 載體并轉(zhuǎn)化DH5α 大腸桿菌感受態(tài)，PCR 檢測(cè)挑選陽(yáng)性菌落送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。使用DNAMAN 軟件將測(cè)序成功的木薯MeERF127 基因序列所對(duì)應(yīng)的蛋白序列與其他物種中已鑒定的且同源性較高的AP2/ERF 蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，分析其保守結(jié)構(gòu)。

1.2.2 MeERF127 亞細(xì)胞定位分析 以測(cè)序成功的MeERF127-19T 載體為模板，采用同源重組法將MeERF127 基因構(gòu)建到pCAMBIA1300-GFP 載體，構(gòu)建pCAMBIA1300-MeERF127-GFP 重組質(zhì)粒[MeERF127-F （Sal I）： tgatacatatgcccgtcgacATGAGGAGAGGAAGGGGAG，MeERF127-R （BamHI）： acgtcgtatgggtaggatccTTAAAGCCATAGAGCAGTACAATG]，然后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。成功轉(zhuǎn)化的菌株在YEP（50 mg/L 利福平+50 mg/L 卡那霉素）液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)至OD600 為1.0，5000 r/min 離心10 min 去上清，用煙草侵染液重懸菌體至OD600=0.6，室溫避光放置2 h 后用注射器緩慢注入煙草葉片背面進(jìn)行瞬時(shí)侵染表達(dá)，注射后的煙草于25 ℃培養(yǎng)2～3 d 后取材制片，在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察。

1.2.3 MeERF127 轉(zhuǎn)錄活性分析 以測(cè)序成功的MeERF127-19T 載體為模板，采用同源重組法將MeERF127 基因構(gòu)建到酵母雙雜交載體pGBKT7上， 構(gòu)建pGBKT7-MeERF127 重組質(zhì)粒[MeERF127-F （BamH I）： ggccgaattcccggggatccATGAGGAGAGGAAGGGGAG，MeERF127-R（Sal I）： tgcggccgctgcaggtcgacTTAAAGCCATAGAGCAGTACAATG]。將pGBKT7-MeERF127、pGBKT7-p53+pGADT7-largeT（陽(yáng)性對(duì)照）和pGBKT7（陰性對(duì)照）分別轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)AH109。涂布于SD/-Trp 固體培養(yǎng)基，待其長(zhǎng)出菌斑，隨機(jī)挑選10 個(gè)菌斑進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)。轉(zhuǎn)化成功的菌液在SD/-Trp 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.6 時(shí)，各取5 μL 菌液點(diǎn)到含10 mg/mL X-α-gal 的SD/-Trp固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2 d 后觀察菌落生長(zhǎng)情況及菌落顏色，以此判斷MeERF127 蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。

1.2.4 MeERF127 基因在各組織器官和塊根不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析 根據(jù)已獲得的SC8 木薯9個(gè)組織器官（脆性愈傷、體胚、塊根、塊根韌皮部、塊根木質(zhì)部、須根、莖、成熟葉和嫩葉）的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，提取MeERF127 的FPKM 值（每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段），對(duì)其進(jìn)行不同組織的表達(dá)分析。根據(jù)已獲得的SC8 木薯種植后5 個(gè)發(fā)育時(shí)期（S1：塊根形成期，80 d；S2：塊根膨大前期，130 d；S3：塊根膨大后期，180 d；S4：塊根成熟前期，230 d；S5：塊根成熟后期，80 d）木薯塊根的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，提取MeERF127 的FPKM 值，對(duì)其進(jìn)行木薯塊根不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析。

1.2.5 MeERF127 在干旱、鹽、低溫脅迫下的表達(dá)分析 選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且長(zhǎng)勢(shì)一致的8～10周SC8 木薯組培苗，分別用300 mmol/L 甘露醇（干旱脅迫）、400 mmol/L NaCl 溶液（鹽脅迫）和4 ℃（低溫脅迫）處理0、12、24、48 h 后取材，每個(gè)樣品取3 個(gè)重復(fù)。提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)MeERF127 定量PCR 引物（qPCR-F： CTGTGGAGTCATTCAGCGGT，qPCR-R： CACAAAGACGACGACGATGC），以Tublin 為內(nèi)參基因（Tublin-F： ATGCGGTTCTTGATGTTGTTC， Tublin-R：TCGGTGAAGGGAATACAGAGA），對(duì)MeERF127基因進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)。反應(yīng)體系：Mon-AmpTM ChemoHS qPCR Mix 5 μL，DNA 模板1 μL，上/下游引物各0.2 μL，H2O 3.6 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s，95 ℃15 s 作溶解曲線。使用2–ΔΔCT 法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品3 次重復(fù)，利用SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，用Graphpad 軟件作圖。

1.2.6 MeERF127 基因編輯木薯的轉(zhuǎn)化及鑒定參照耿沙等[22]方法，利用CRISPR-P 2.0 網(wǎng)站設(shè)計(jì)MeERF127 基因的靶點(diǎn)，送金斯瑞生物科技有限公司合成pCAMBIA1301-Cas9-MeERF127-gRNA基因編輯載體，然后轉(zhuǎn)入LBA4404 農(nóng)桿菌并轉(zhuǎn)化SC8 木薯脆性愈傷組織。待轉(zhuǎn)基因木薯出芽后，用15 mg/L 潮霉素進(jìn)行生根篩選，再選取生根苗的葉片進(jìn)行PCR 分子檢測(cè)是否轉(zhuǎn)化成功。用葉片裂解液提取葉片DNA 后用2×M5 Hiper 超光速mix 進(jìn)行PCR，所用引物為Cas 9 通用檢測(cè)引物（Cas 9-F： GCTGGGCCGTGATCACCGAC， Cas9-R： CACTCTCAGGATGTCGCTCAGC），PCR 反應(yīng)程序如下：95 ℃ 3 min；94 ℃ 25 s，59 ℃ 25 s，72 ℃ 50 s，32 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。提取陽(yáng)性株系的基因組DNA，用MeERF127 基因靶點(diǎn)引物（ target-F： GAGGAGAGGAAGGGGAGGAG， target-R： ATCTCAGCGGCGTATCTTCC ） 擴(kuò)增MeERF127 基因靶點(diǎn)區(qū)域上、下游200 bp 的序列，用Hi-TOM 接頭引物（F： GGAGTGAGTACGGTGTGC，R： GAGTTGGATGCTGGATGG）進(jìn)行新一輪PCR后送至廣州諾禾生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序，檢測(cè)靶點(diǎn)是否成功編輯。

1.2.7 MeERF127 基因編輯木薯脅迫后生理特性研究 選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且長(zhǎng)勢(shì)一致的8～10 周的MeERF127 基因編輯木薯組培苗和未轉(zhuǎn)基因的SC8 木薯組培苗（對(duì)照，WT），分別用300 mmol/L甘露醇、400 mmol/L NaCl 溶液和4 ℃低溫處理48 h。參照蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生理指標(biāo)測(cè)定試劑盒的操作步驟，檢測(cè)脅迫處理前后各木薯株系葉片的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）的酶活，丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）的含量，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值。每個(gè)樣品設(shè)3 次重復(fù)。

1.2.8 超氧陰離子染色 取1.2.7 中干旱、鹽和低溫脅迫處理前后的MeERF127 基因編輯木薯組培苗和未轉(zhuǎn)基因的SC8 木薯組培苗葉片，洗凈后浸沒于NBT 染色液（武漢賽維爾生物科技有限公司）中，室溫避光染色12 h。取出葉片用純水洗凈后濾紙吸干，置于95%乙醇中40 ℃處理12 h，讓葉片中的葉綠素溶于酒精，每隔2～3 h 更換1次95%乙醇。當(dāng)葉片中的葉綠素被全部去除后取出木薯葉片，用純水洗凈吸干后置于NBT 樣本保存液30 min 即可取出拍照。每個(gè)樣本取6～8 個(gè)葉片進(jìn)行染色。

1.2.9 逆境脅迫相關(guān)基因的表達(dá)分析 取1.2.7中干旱、鹽和低溫脅迫處理前后的MeERF127 基因編輯木薯組培苗和未轉(zhuǎn)基因的SC8 木薯組培苗，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以Tublin 為內(nèi)參基因，對(duì)逆境響應(yīng)基因MeSOD、MeWRKY31進(jìn)行熒光定量PCR。MeSOD 引物為qMeSOD-F（CGCTATGGAGAAGGGCGATT）和qMeSOD-R（GTCAATAGCCCGAGCGAGAG），MeWRKY31引物為qMeWRKY31-F（TCTCAAGAAACGGTGCCCTC）和qMeWRKY31-R（TTGTGGGCATTAGTGCTGGT）。反應(yīng)體系：MonAmpTM ChemoHSqPCR Mix 5 μL，DNA 模板1 μL，上/下游引物各0.2 μL，H2O 3.6 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s 作溶解曲線。使用2–ΔΔCT 法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)部位進(jìn)行3次重復(fù)。利用SPSS 軟件進(jìn)行差異顯著性分析，并采用Graphpad 軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeERF127 基因的克隆和序列結(jié)構(gòu)分析

為克隆木薯MeERF127（Manes.15G066800）基因，本研究提取SC8 木薯總RNA 逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA 為模板，PCR擴(kuò)增MeERF127 基因CDS 片段，獲得總長(zhǎng)為711bp的MeERF127 基因（圖1）。

將木薯MeERF127 與其他物種中已鑒定的且同源性較高的AP2/ERF 基因的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其蛋白序列具有高度保守性，均含有1個(gè)AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域，N 端是YRG 元件，C 端是RAVD 元件，且AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域的第14 位和第19 位的氨基酸分別是丙氨酸和天冬氨酸，說明MeERF127 屬于ERF 亞家族（圖2）。

2.2 MeERF127 的亞細(xì)胞定位

將pCAMBIA1300-MeERF127-GFP 重組質(zhì)粒和pCAMBIA1300-GFP 空載質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)入煙草瞬時(shí)表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)pCAMBIA1300-MeERF127-GFP 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的煙草葉片只在細(xì)胞核中可見GFP 綠色熒光（圖3），說明MeERF127 蛋白定位于細(xì)胞核。

2.3轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定

將pGBKT7-MeERF127、pGBKT7（陰性對(duì)照）、pGBKT7-p53+pGBKT7-largeT（陽(yáng)性對(duì)照）質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母AH109，挑選陽(yáng)性菌斑點(diǎn)板至SD/-Trp 固體培養(yǎng)基上（含10 mg/mL X-α-gal）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)帶有目的基因的pGBKT7-MeERF127 和陽(yáng)性對(duì)照pGBKT7-p53+pGBKT7-layqcLzUMUmD9VO8ePaoX4AQ==rgeT 長(zhǎng)出藍(lán)色菌斑，而陰性對(duì)照pGBKT7 的菌斑未變藍(lán)（圖4），說明MeERF127 具有轉(zhuǎn)錄活性，是轉(zhuǎn)錄因子。

2.4 MeERF127 在不同組織器官的表達(dá)模式分析

將植后180d的SC8木薯的脆性愈傷、體胚、塊根、塊根韌皮部、塊根木質(zhì)部、須根、莖、嫩葉和成熟葉等9 個(gè)組織器官進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)MeERF127 在各組織器官中均有表達(dá)，在莖中的表達(dá)量最高，其次為嫩葉和塊根木質(zhì)部，在愈傷組織中的表達(dá)量最低（圖5）。

2.5 MeERF127 在木薯塊根發(fā)育過程中的表達(dá)模式分析

對(duì)植后不同發(fā)育時(shí)期的木薯塊根進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)MeERF127 在塊根發(fā)育前期如形成期（S1）和膨大前期（S2）的表達(dá)量較高，在塊根發(fā)育后期表達(dá)水平趨于平緩（ 圖6 ）。推測(cè)MeERF127 主要在木薯塊根發(fā)育的前期發(fā)揮作用，促進(jìn)木薯塊根的形成和膨大。

2.6 MeERF127在干旱、鹽和低溫脅迫下的表達(dá)分析

為了研究干旱、鹽和低溫脅迫是否會(huì)影響MeERF127 在木薯中的表達(dá)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析MeERF127 基因在干旱、鹽和低溫脅迫下的表達(dá)情況。結(jié)果如圖7 所示，在干旱脅迫48 h后，MeERF127 的表達(dá)顯著上升；在鹽脅迫12 h后，MeERF127 表達(dá)量上調(diào)至顯著水平；在4 ℃低溫脅迫后，MeERF127 的表達(dá)變化不大，僅在48 h 時(shí)稍有下降。

2.7 MeERF127 基因編輯木薯苗的獲得與鑒定

根據(jù)MeERF127 基因序列信息在CRISPR-P2.0 在線軟件上設(shè)計(jì)MeERF127 的基因編輯靶點(diǎn)構(gòu)建PCAMBIA1301-Cas9-MeERF127-gRNA 基因編輯載體（圖8），轉(zhuǎn)入LBA4404 農(nóng)桿菌并轉(zhuǎn)化SC8 木薯脆性胚性愈傷組織，誘導(dǎo)出芽成苗后進(jìn)行潮霉素生根篩選，提取生根陽(yáng)性苗葉片DNA用Cas9 檢測(cè)引物進(jìn)行PCR 分子檢測(cè)，成功獲得帶有編輯表達(dá)框的陽(yáng)性株系（圖9）。

為檢測(cè)獲得的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系體內(nèi)發(fā)生MeERF127 的成功編輯，分別提取5 個(gè)陽(yáng)性株系基因組DNA 進(jìn)行Hi-TOM 高通量測(cè)序。測(cè)序結(jié)果如表1 所示，與SC8 對(duì)照相比，5 個(gè)株系均為缺失22個(gè)堿基和3個(gè)堿基的雜合突變，且22個(gè)堿基缺失的概率遠(yuǎn)大于3 個(gè)堿基缺失，說明成功得到MeERF127基因編輯植株。

2.8 MeERF127 基因編輯木薯在干旱、鹽和低溫脅迫下的生理特性研究

為了研究MeERF127 基因編輯木薯對(duì)干旱、鹽堿和低溫脅迫的耐受性，以SC8 木薯為對(duì)照（WT），對(duì)MeERF127基因編輯木薯用300 mmol/L 甘露醇、400 mmol/L NaCl 溶液和4 ℃低溫處理48 h，觀察其表型并測(cè)量其生理指標(biāo)。發(fā)現(xiàn)在干旱和鹽脅迫后，對(duì)照SC8 木薯植株發(fā)生明顯萎焉，葉片下垂，而MeERF127 基因編輯木薯未出現(xiàn)萎焉；在低溫脅迫下，二者均出現(xiàn)萎焉（圖10A）。

NBT 染色后植株呈現(xiàn)的藍(lán)色深淺代表植株的超氧陰離子含量，可用來判斷植株的受損傷程度，藍(lán)色越深說明超氧陰離子含量越高，植株受損傷度越高。干旱、鹽和低溫脅迫處理后的木薯葉片的NBT 染色結(jié)果顯示，干旱和鹽處理后，MeERF127基因編輯木薯較對(duì)照組葉片顏色更淺，說明MeERF127 基因編輯木薯的超氧陰離子含量更低，受損傷程度更小，可能更抗旱和耐鹽。在低溫處理后，MeERF127 基因編輯木薯和對(duì)照組的顏色深淺差別不大，說明受損傷程度大致相同，MeERF127基因編輯木薯對(duì)低溫脅迫無響應(yīng)（圖10B）。

進(jìn)一步測(cè)定脅迫前后各株系的生理指標(biāo)發(fā)現(xiàn)（圖10C），在正常條件下，MeERF127基因編輯木薯的SOD、POD活性和Pro 含量均顯著高于野生型木薯，MDA 含量則差異不顯著。在干旱和鹽脅迫下，MeERF127 基因編輯木薯的SOD、POD活性和Pro 含量均顯著高于野生型木薯，而MDA含量顯著低于野生型木薯；在低溫脅迫下，基因編輯木薯的SOD、POD酶活和MDA含量與野生型木薯差異不顯著。以上結(jié)果說明，MeERF127基因編輯木薯對(duì)干旱和鹽脅迫有一定的耐受性，而對(duì)低溫脅迫不敏感。

2.9 脅迫響應(yīng)基因在MeERF127基因編輯木薯中的表達(dá)分析

為了進(jìn)一步闡明MeERF127 基因響應(yīng)脅迫的具體機(jī)制，選取SOD 和WRKY31 這2 個(gè)逆境響應(yīng)基因，分析其在MeERF127 基因編輯木薯受到干旱、鹽和低溫脅迫后的表達(dá)變化情況。結(jié)果如圖11所示，在干旱和鹽脅迫后，脅迫響應(yīng)基因SOD 和WRKY31在MeERF127 基因編輯木薯中的表達(dá)量顯著高于野生型；而在低溫脅迫時(shí)二者差異不顯著，表明MeERF127 可能調(diào)控這些基因以響應(yīng)干旱和鹽脅迫。綜上，基因編輯MeERF127提高了木薯的抗旱性和耐鹽性，但對(duì)低溫脅迫無響應(yīng)。本研究結(jié)果為揭示MeERF127 基因在木薯響應(yīng)干旱和鹽脅迫過程中的調(diào)控作用提供理論依據(jù)。

3討論

AP2/ERF 家族是包含AP2/ERF 型DNA 結(jié)合域的大型轉(zhuǎn)錄因子家族，該結(jié)構(gòu)域首次在擬南芥同源異型基因APETALA2[23]中被發(fā)現(xiàn)。木薯ERF家族被鑒定出155 個(gè)成員，本研究的MeERF127基因是其中之一。AP2/ERF 家族中的ERF 亞族存在一個(gè)AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域，其N 端和C 端分別包含YRG 和RAYD 兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)元件，且第14 位和第19 位的氨基酸分別是丙氨酸和天冬氨酸[24]，本研究從華南8 號(hào)木薯中成功克隆獲得的MeERF127 基因的蛋白結(jié)構(gòu)和ERF 亞族一致。ERF 家族作為轉(zhuǎn)錄因子，大多定位于細(xì)胞核[25]，但也有定位于細(xì)胞質(zhì)[26] 和葉綠體[27] 的ERF 基因。本研究發(fā)現(xiàn)MeERF127 定位于細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄活性分析證實(shí)其具有轉(zhuǎn)錄活性，說明MeERF127 是一個(gè)定位于細(xì)胞核且具有轉(zhuǎn)錄活性的ERF 轉(zhuǎn)錄因子。

已有研究表明，AP2/ERF 型轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中扮演重要角色。HIROTA 等[28]從擬南芥中鑒定出一個(gè)AP2/ERF 家族基因PUCHI，該基因參與側(cè)根的萌生和發(fā)育。楊樹PtaERF 基因在韌皮部組織中表達(dá)，對(duì)楊樹莖的發(fā)育具有潛在作用[29]。本研究中的MeERF127 在莖中的表達(dá)最高，在葉片和木質(zhì)部也有較高的表達(dá)。并且在塊根形成期高表達(dá)，推測(cè)MeERF127 可能參與木薯莖、葉和塊根的生長(zhǎng)發(fā)育。

干旱、鹽堿和低溫等非生物脅迫嚴(yán)重影響作物的生長(zhǎng)發(fā)育并限制其產(chǎn)量[30]。大量研究表明AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。例如，番茄ERF 蛋白JERF1 通過增加滲透脯氨酸的合成顯著提高抗旱性[31]。水稻OsERF922通過破壞Na+/K+穩(wěn)態(tài)和介導(dǎo)ABA 信號(hào)通路負(fù)調(diào)控植物的耐鹽性[32]。水稻OsERF101 過表達(dá)植株中脯氨酸含量和過氧化物酶活性的增加有助于提高水稻的耐旱性[33]。剛毛檉柳（Tamarix hispida）中ThWRKY2 基因在干旱脅迫下啟動(dòng)乙烯響應(yīng)因子ThERF1 基因的表達(dá)，負(fù)向調(diào)控包括干旱脅迫在內(nèi)的非生物脅迫[34]。木薯MeERF5 基因能快速響應(yīng)干旱、鹽和低溫脅迫[35]。本研究中MeERF127基因在干旱和鹽脅迫處理后表達(dá)上調(diào)，基因編輯MeERF127 提高了木薯的抗旱性和耐鹽性，脅迫響應(yīng)基因SOD 和WRKY31 在MeERF127 基因編輯木薯中的表達(dá)量顯著高于野生型，推測(cè)MeERF127可能通過調(diào)控這些基因來參與調(diào)節(jié)木薯的抗旱和耐鹽能力。本研究為揭示AP2/ERF 基因在木薯響應(yīng)干旱和鹽脅迫過程中的調(diào)控作用提供理論依據(jù)，具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。