巴西橡膠樹GRAS基因家族鑒定及表達(dá)分析

關(guān)鍵詞：巴西橡膠樹；GRAS 基因家族；生物信息學(xué)；基因表達(dá)；DELLA

中圖分類號(hào)：S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor， TF）是功能基因組學(xué)的核心，它是一種能與特異DNA 序列結(jié)合的蛋白，可以單獨(dú)或與其他蛋白形成復(fù)合體，提高或阻斷特定基因RNA 聚合酶的招募，調(diào)控基因的表達(dá)[1]。轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控高等植物的生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)中起重要作用[2]。已知的轉(zhuǎn)錄因子包括GRAS、WRKY、AP2/EREBP、bZIP、MYB、MADS 和bHLH 等。

GRAS家族是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，其命名來源于該家族最早鑒定的3 個(gè)功能特征基因GAI（gibberellic-acid insensitive）、RGA（repressorof GA1-3 mutant）、SCR（scarecrow）[3-5]。GRAS蛋白的長(zhǎng)度為400～770 個(gè)氨基酸不等，具有1 個(gè)高度保守的C-端GRAS 結(jié)構(gòu)域。GRAS 結(jié)構(gòu)域約390 個(gè)氨基酸，由5 個(gè)不同基序按照特定順序排列組成：LHR I（leucine heptad repeat I）、VHIID、LHR II（leucine heptad repeat II）、PFYRE 和SAW[6]。其中，VHIID 基序與2 個(gè)亮氨酸七肽重復(fù)區(qū)（ LHR I 和LHR II ） 結(jié)合形成LHRI-VHIID-LHR II 復(fù)合體，該結(jié)構(gòu)可能在蛋白-DNA或蛋白-蛋白互作中發(fā)揮關(guān)鍵功能[7]。PFYRE 和SAW 基序功能仍未闡明，但這2 個(gè)基序發(fā)生缺失或錯(cuò)義突變導(dǎo)致擬南芥（Arabidopsis thaliana）表型異常[4， 8]。GRAS 蛋白的N 端保守性較差，但一些GRAS 家族成員在N 端區(qū)域含有保守的序列，如DELLA 亞家族包含2 個(gè)保守的基序DELLA 和TVHYNP[9]。最初根據(jù)擬南芥和水稻的研究將GRAS 家族分為DELLA、HAM（hairy meristem）、PAT1（phytochrome a signal transduction 1）、LAS（lateral suppressor）、SHR（short root）、SCR、SCL3（SCR- like 3）、LISCL（lilium longiflorumSCR-like）等8 個(gè)亞家族。而其他植物物種，如番茄（Solanum lycopersicum）[10]、茶樹（Camelliasinensis）[11]和葡萄（Vitis vinifera）[12]中有13 個(gè)亞家族，葫蘆（Lagenaria siceraria）[13]中有16 個(gè)亞家族，CENCI 等[14]將被子植物GRAS 家族分為17 個(gè)亞家族。目前，GRAS 基因家族已在多個(gè)物種中被報(bào)道，其中擬南芥（Arabidopsis thaliana）[15]有33 個(gè)成員、水稻（Oryza sativa）[15]有60 個(gè)、玉米（Zea mays）[16]有86 個(gè)、大白菜（Brassica rapassp. pekinensis）[17]有48 個(gè)、毛果楊（Populustrichocarpa ） [18] 有106 個(gè)、中國(guó)薔薇（ Rosachinensis）[19]有56 個(gè)成員，大戟科的木薯（Manihotesculenta）[20]有77 個(gè)、麻風(fēng)樹（Jatropha curcas）[21]和蓖麻（Castor bean）[22]均有48 個(gè)成員。

GRAS基因家族在植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素信號(hào)傳導(dǎo)、逆境響應(yīng)等多個(gè)生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。如GRAS 家族成員DELLA 蛋白作為赤霉素（gibberellin， GA）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)控因子，通過與其他蛋白互作從而介導(dǎo)GA 調(diào)控植物生長(zhǎng)[23]。此外，DELLA 還參與調(diào)控茉莉酸（jasmonic acid， JA）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[24]及次生細(xì)胞壁形成[25-26]；PAT1 作為光敏色素A 信號(hào)途徑的正調(diào)控因子參與光信號(hào)途徑調(diào)控[27]；HAM 參與莖尖分生組織的生長(zhǎng)發(fā)育[28]；SCR 和SHR 通過形成復(fù)合體進(jìn)而共同調(diào)控?cái)M南芥根和芽的徑向生長(zhǎng)[29]；SCL3 參與調(diào)控陸地棉根的伸長(zhǎng)[30]；在大豆中過表達(dá)GmGRAS37 基因可以增強(qiáng)植株的耐旱和耐鹽能力[31]。近年來，隨著對(duì)GRAS 基因的深入研究，越來越多的證據(jù)表明，GRAS 基因家族在植物的適應(yīng)性進(jìn)化和環(huán)境適應(yīng)性方面起著關(guān)鍵的作用[32-34]。

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis），簡(jiǎn)稱橡膠樹，原產(chǎn)于巴西亞馬遜河流域馬拉岳西部地區(qū)，是大戟科橡膠樹屬一種典型的熱帶雨林樹種，也是我國(guó)及世界熱區(qū)的一種重要經(jīng)濟(jì)作物。橡膠樹所產(chǎn)生的膠乳是天然橡膠的主要原料。天然橡膠是重要的戰(zhàn)略物資和工業(yè)原料，盡管世界上有2000 多種產(chǎn)膠植物，如銀膠菊[35]、橡膠草[36]和杜仲[37]等，但目前所使用的天然橡膠約98%仍來源于橡膠樹[38]。隨著橡膠樹全基因組測(cè)序工作的完成，為基因家族的全基因組分析提供了便利，也為橡膠樹功能基因組學(xué)研究提供了可靠的基因組數(shù)據(jù)信息[39-41]。基于GRAS 基因家族在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)中的重要作用，本研究利用生物信息學(xué)方法，以橡膠樹基因組為基礎(chǔ)，鑒定橡膠樹GRAS 基因家族成員，并對(duì)其系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)、染色體位置和啟動(dòng)子順式作用元件等進(jìn)行分析，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及qPCR 技術(shù)分析GRAS 基因表達(dá)模式，從而為橡膠樹GRAS 基因功能的解析提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所采用的試驗(yàn)材料均來自于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)（海南省儋州市）種植的橡膠樹（Hevea brasiliensis）熱研73397 品種。采集橡膠樹不同組織（雌花、雄花、木質(zhì)部、葉片、樹皮和膠乳），不同節(jié)間木質(zhì)部（選取橡膠樹頂端分生組織從上往下數(shù)第一、第三和第五節(jié)間木質(zhì)部），以及150 mg/L 外源GA3 處理21周后（每周噴灑處理1次）的橡膠樹幼苗的木質(zhì)部（以H2O處理作為對(duì)照）樣品，立即置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室后于–80 ℃中保存?zhèn)溆?。? 株樹為1 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 橡膠樹GRAS家族成員的鑒定及理化性質(zhì)分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載橡膠樹基因組序列、蛋白質(zhì)序列和注釋信息。利用Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam-legacy.xfam.org/）下載的GRAS 結(jié)構(gòu)域（PF03514）和隱馬爾可夫模型（HMM）文件，通過hmmer 3.0軟件篩選橡膠樹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中含有GRAS 結(jié)構(gòu)域的全部蛋白序列，選取e 值小于1e–5 的候選蛋白序列。使用ClustalX 2.1 軟件將候選蛋白序列進(jìn)行一一比對(duì)去除冗余，并通過SMART（https：//smart. embl.de/）和NCBI-CDD 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）鑒定其保守結(jié)構(gòu)域，去除不含GRAS 結(jié)構(gòu)域的序列，得到橡膠樹GRAS 家族成員。分別利用ExPASyProtParam（ https：//web.expasy.org/protparam/）和Plant-mPLoc （ http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）在線軟件進(jìn)行氨基酸長(zhǎng)度、分子量大小、等電點(diǎn)、疏水性等理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.2.2 GRAS 的系統(tǒng)進(jìn)化分析 通過PlantTFdb（http：//planttfdb.gao-lab.org/index.php）數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載擬南芥、毛果楊和水稻GRAS家族蛋白序列，并與橡膠樹GRAS 蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)。利用MEGA 11 軟件，采用鄰接法（neighbor-joining method， NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap 設(shè)置為1000 以測(cè)試進(jìn)化樹的可靠性。利用Evolview（https：//www.evolgenius.info/evolviewv2/#login）在線軟件和AI 軟件進(jìn)行結(jié)果美化。

1.2.3 橡膠樹GRAS基因結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)橡膠樹基因組注釋信息，利用在線網(wǎng)站MEME（https：//meme-suite.org/meme/）與NCBI Batch CD-search（ https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）在線軟件進(jìn)行motif 預(yù)測(cè)和保守結(jié)構(gòu)域分析，其中motif 數(shù)量設(shè)置為10，其他參數(shù)均為默認(rèn)值。通過使用TBtools 軟件對(duì)橡膠樹GRAS家族的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并將系統(tǒng)進(jìn)化樹、蛋白保守基序、保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化展示。

1.2.4 橡膠樹GRAS 基因染色體定位分析 利用TBtools軟件在橡膠樹基因組注釋信息的基礎(chǔ)上，將橡膠樹GRAS 基因定位到染色體上，并作共線性分析，同時(shí)利用該軟件計(jì)算其Ka/Ks 值。

1.2.5 橡膠樹GRAS 基因啟動(dòng)子順式作用元件分析 選取橡膠樹GRAS 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000 bp的序列作為啟動(dòng)子分析區(qū)域，利用PlantCARE（ https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線軟件進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)，并通過TBtools 進(jìn)行可視化展示。

1.2.6 基于RNA-Seq 數(shù)據(jù)的基因表達(dá)分析 利用課題組前期獲得的RNA-Seq 數(shù)據(jù)，以及HeveaDB（http：//hevea.catas.cn/home/index）數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)，獲得不同組織（膠乳、樹皮、葉片、雌花、雄花和木質(zhì)部）及葉片不同發(fā)育時(shí)期（古銅期、變色期、淡綠期和穩(wěn)定期）的橡膠樹GRAS 家族成員的轉(zhuǎn)錄本FPKM（fragments perkilobase of exon per million reads mapped）值，并使用TBtools 軟件對(duì)橡膠樹GRAS 基因表達(dá)水平進(jìn)行聚類及熱圖繪制。

1.2.7 qPCR 分析 對(duì)橡膠樹DELLA 亞家族6個(gè)成員組織的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行qPCR 驗(yàn)證，并分析其在不同節(jié)間木質(zhì)部及GA3處理下的表達(dá)模式。利用天根生化科技（北京） 有限公司的RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（TIANGEN， Beijing， China）提取樣品總RNA。采用NanoDrop 2000分光光度計(jì)和凝膠電泳檢測(cè)RNA 樣品的濃度和完整性。將1 μg RNA 樣品用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（Takara， Dalian， China）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用Primer 3軟件設(shè)計(jì)HbGRAS 基因的qPCR 引物（表1），以YLS8 為內(nèi)參基因。將上述反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 作為模板，利用2×Q3 SYBR qPCRMaster Mix（Universal）（TOLOBIO， China）進(jìn)行qPCR，反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序按照說明書進(jìn)行。采用2–ΔΔCT 法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)包括3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 橡膠樹GRAS基因家族成員鑒定與理化性質(zhì)分析

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的橡膠樹蛋白質(zhì)序列及隱馬爾可夫模型，結(jié)合SMART 和NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫(kù)篩選和驗(yàn)證，最終得到91 個(gè)非冗余的橡膠樹GRAS 基因家族成員，根據(jù)其在染色上的位置將其命名為HbGRAS1～HbGRAS91（表2）。理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，橡膠樹GRAS 基因編碼的蛋白長(zhǎng)度在117～824 個(gè)氨基酸之間，其中HbGRAS91的氨基酸序列最短，HbGRAS9 最長(zhǎng)。蛋白分子量在14.07～89.46 kDa 之間，等電點(diǎn)在4.72（HbGRAS70）～9.07（HbGRAS21）之間，平均值為6.90。蛋白總平均疏水性在–0.656～0.151 之間，其中，除HbGRAS12 、HbGRAS32 、HbGRAS59 和HbGRAS61 的總平均疏水性大于0 之外，其余皆小于0，說明橡膠樹GRAS 家族成員大部分為親水蛋白。蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，有49 個(gè)HbGRAS 蛋白定位于細(xì)胞核，36 個(gè)定位于葉綠體，3 個(gè)定位于質(zhì)膜，2 個(gè)定位于細(xì)胞質(zhì)，1 個(gè)定位于過氧化物酶體。

2.2 橡膠樹GRAS 基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

為解析橡膠樹GRAS 蛋白的特征，分別從PlantTFdb 和NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載擬南芥、毛果楊和水稻GRAS 家族蛋白序列，與本研究鑒定得到的91 個(gè)橡膠樹GRAS 家族成員的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明，GRAS 蛋白被劃分為14 個(gè)亞家族，分別是Os19、HAM、SCL4/7、LAS、SCR、DLT、SCL3、Os4、Os43、DELLA、Pt20、LISCL、SHR 和PAT1（圖1）。其中LISCL亞家族的成員數(shù)目最多有16 個(gè)，PAT1 亞家族有13 個(gè)，HAM 亞家族有11 個(gè)，SHR 亞家族有10個(gè)，Pt20 亞家族有8 個(gè)，Os4、SCR 和 DELLA亞家族各有6 個(gè)，SCL3 亞家族有5 個(gè)，Os19、Os43、SCL4/7、LAS 和DLT 各亞家族僅有2 個(gè)成員。比較不同植物之間GRAS 各亞家族的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，橡膠樹、擬南芥和水稻中LISCL 亞家族的數(shù)量最多，分別為16、7 和10 個(gè)。毛果楊中DELLA和HAM 亞家族成員數(shù)量最多，均為14 個(gè)。Pt20亞家族僅存在于橡膠樹和毛果楊中，而擬南芥無(wú)Os4、Os43 和Os19 亞家族成員（表3，圖2A）。

2.3 橡膠樹GRAS家族保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析

保守基序分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)motifs 位于序列C 端，motif 6存在于全部HbGRAS 蛋白中，且始終在C 端。motif 1 大多與motif 4、motif 5 或者motif 10相鄰。同一亞族的HbGRAS 成員通常具有相似的基序組成。例如， LISCL 亞族除HbGRAS91只含有motif 2 和motif 6 外，其余均包括motif 9、motif 7、motif 1、motif 8、motif 5、motif 3、motif 2、motif 6，DELLA 亞族均含有motif 9、motif 7、motif 4、motif 1、motif 10、motif3、motif 2、motif 6，HAM 亞家族成員僅含有4個(gè)保守的motifs（圖2B）。

保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，HbGRAS成員均含有GRAS 或GRAS superfamily 結(jié)構(gòu)域，除HbGRAS91外其他均位于C端，而DELLA結(jié)構(gòu)域僅存在于DELLA 亞家族中。同一亞家族的成員其基因結(jié)構(gòu)相似，如PAT1 亞家族僅有GRAS結(jié)構(gòu)域，Pt20 亞家族僅有GRAS superfamily 結(jié)構(gòu)域。DELLA 亞家族中除HbGRAS62J1JlAwCy+K8obl18ie46cA==外，其余均含有DELLA 保守結(jié)構(gòu)域（圖2C）。

基因結(jié)構(gòu)多樣性是基因家族進(jìn)化的重要組成部分[42]。橡膠樹GRAS 基因具有0～7 個(gè)數(shù)量不等的內(nèi)含子，其中63 個(gè)HbGRAS 無(wú)內(nèi)含子，18 個(gè)HbGRAS 僅有1 個(gè)內(nèi)含子，HbGRAS59 含有7 個(gè)內(nèi)含子，數(shù)量最多。DELLA、LAS、Os19、HAM和DLT 亞家族無(wú)內(nèi)含子，Os4/7、SCL3 和SHR亞家族含有0～1 個(gè)內(nèi)含子，Os4 亞家族含有0～7個(gè)內(nèi)含子（圖2D）?？傮w來說，系統(tǒng)進(jìn)化中同一亞家族的橡膠樹GRAS 基因具有相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。

2.4橡膠樹GRAS基因染色體定位和基因復(fù)制分析

橡膠樹GRAS基因的染色體定位如圖3所示，91個(gè)HbGRAS基因分布于除11號(hào)染色體外的其他17條染色體和2條Scaffold上，并且每個(gè)染色體上分布的數(shù)目不同。16號(hào)染色體上分布最多，有17個(gè)基因，約占總數(shù)的18.68%，其次是9號(hào)染色體分布有12個(gè)基因，而8和18號(hào)染色體，以及Scaffold402和Scaffold409分布最少，各自僅含1個(gè)HbGRAS基因。

串聯(lián)重復(fù)事件是指200kb內(nèi)包含2 個(gè)或更多基因的染色體區(qū)[43]，在基因組進(jìn)化、調(diào)控和穩(wěn)定性等方面具有重要的作用[44]。在橡膠樹4、9、15和16號(hào)等4條染色體上共發(fā)現(xiàn)17 個(gè)HbGRAS基因的10個(gè)串聯(lián)重復(fù)事件（圖3）。共線性分析顯示，橡膠樹GRAS 基因片段重復(fù)區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了87個(gè)基因（圖4），說明片段重復(fù)事件可能是橡膠樹GRAS 基因家族成員進(jìn)化的主要原因。HbGRAS家族的同源基因?qū)Φ腒a/Ks 值在0.091～0.388 之間，說明這些基因經(jīng)過片段復(fù)制后發(fā)生了純化選擇。

2.5橡膠樹GRAS基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析結(jié)果顯示，橡膠樹GRAS 家族主要包含植物激素應(yīng)答順式作用元件，如GA、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate， MeJA）、脫落酸（abscisic acid， ABA）、生長(zhǎng)素（auxin）和水楊酸（salicylic acid， SA）響應(yīng)元件，脅迫應(yīng)答順式作用元件，如傷害、干旱和低溫響應(yīng)元件，以及參與分生組織、胚乳、種子等時(shí)空表達(dá)及光響應(yīng)的順式作用元件等。其中，光響應(yīng)元件在全部91 個(gè)HbGRAS 基因中都存在且數(shù)量最多，有1111個(gè)。其次，是茉莉酸甲酯響應(yīng)元件有178 個(gè)，厭氧誘導(dǎo)元件164 個(gè)，脫落酸響應(yīng)元件129 個(gè)，GA 響應(yīng)元件85 個(gè)，其中數(shù)量最少的元件是光敏色素互作因子、SEF1因子結(jié)合位點(diǎn)和參與柵欄葉肉細(xì)胞分化的順式作用元件，各有2個(gè)（圖5）。上述結(jié)果表明，HbGRAS 可能參與多種植物激素和環(huán)境脅迫應(yīng)答，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)中起著重要作用。

2.6 橡膠樹GRAS基因家族成員表達(dá)分析

HbGRAS基因在橡膠樹膠乳、樹皮、葉片、雌花、雄花和木質(zhì)部等不同組織的表達(dá)模式如圖6所示，其中HbGRAS11、HbGRAS12、HbGRAS26、HbGRAS30、HbGRAS42、HbGRAS48、HbGRAS49、HbGRAS59 和HbGRAS69等9 個(gè)基因在所有檢測(cè)組織中均不表達(dá)。HbGRAS45 和HbGRAS84 在膠乳中高表達(dá)，HbGRAS67 在樹皮和木質(zhì)部中表達(dá)量較高，HbGRAS82在葉片和木質(zhì)部中的表達(dá)豐度較高。雄花中表達(dá)豐度最高的是HbGRAS60，其次是HbGRAS87。不同亞族中HbGRAS 的組織表達(dá)模式也不盡相同，比如LAS 和Pt20 亞家族成員在所有組織中的表達(dá)水平都低于其他亞家族，而PAT1、DELLA 和SCL4/7 亞家族的相對(duì)表達(dá)量較其他各亞族略高。

為進(jìn)一步了解HbGRAS 在橡膠樹葉片發(fā)育中的作用，從Hevea DB數(shù)據(jù)庫(kù)下載HbGRAS基因在橡膠樹葉片不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，表達(dá)模式分析結(jié)果顯示，DELLA 亞家族中HbGRAS44 隨著葉片的發(fā)育進(jìn)程表達(dá)量逐漸上調(diào)，而HbGRAS58、HbGRAS64、HbGRAS82 和HbGRAS89 則逐漸下調(diào)表達(dá)；PAT1 亞家族中HbGRAS7和HbGRAS60，HAM亞家族中HbGRAS6 和HbGRAS36 均隨著葉片的成熟表達(dá)量逐漸上調(diào)。HAM 亞族中HbGRAS84和HbGRAS54 在變色期和淡綠期的表達(dá)量相對(duì)較高（圖7），說明HbGRAS 基因表達(dá)與葉片發(fā)育有關(guān)，但可能存在功能差異。

作為GRAS 家族的重要成員，DELLA 是GA信號(hào)傳導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)控因子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[45]。因此，進(jìn)一步利用qPCR技術(shù)分析橡膠樹DELLA 亞家族成員的基因表達(dá)模式。結(jié)果顯示HbGRAS62在樹皮中表達(dá)量最高，木質(zhì)部中表達(dá)量最低，而 RNA-Seq結(jié)果顯示表達(dá)量最高和最低的組織分別為膠乳和雌花。其余5個(gè)DELLA基因表達(dá)量最高和最低的組織均與RNA-seq 結(jié)果一致，其中HbGRAS44分別為葉片和樹皮、HbGRAS58 分別為葉片和膠乳、HbGRAS64分別為雌花和膠乳、HbGRAS82和HbGRAS89 均分別為木質(zhì)部和膠乳（圖8）。造成HbGRAS62 qPCR和RNA-Seq表達(dá)模式不一致的原因可能與2 種技術(shù)本身的差異（即轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是對(duì)該基因的所有轉(zhuǎn)錄本定量，而qPCR則可能不能代表所有的轉(zhuǎn)錄本）有關(guān)。在不同節(jié)間木質(zhì)部中，除HbGRAS62外，其余5 個(gè)橡膠樹DELLA基因均隨木質(zhì)化程度加深上調(diào)表達(dá)（圖9），說明橡膠樹DELLA 基因可能參與橡膠樹莖的次生細(xì)胞壁形成。外源GA3 處理抑制DELLA 亞家族成員表達(dá)（圖10），說明DELLA基因表達(dá)受GA 調(diào)控。

3討論

GRAS作為植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及非生物脅迫應(yīng)答中具有重要的調(diào)控作用，但目前在橡膠樹中尚無(wú)該轉(zhuǎn)錄因子家族分析相關(guān)的研究報(bào)道。本研究從橡膠樹全基因組中篩選并鑒定到HbGRAS 基因家族成員91個(gè)，所有HbGRAS 蛋白在結(jié)構(gòu)上存在顯著差異，表明其高度復(fù)雜。其成員數(shù)量與擬南芥（33個(gè)）、水稻（60個(gè)）、玉米（86個(gè)）、葡萄（43個(gè)）、辣椒（50個(gè)）[46]、楊樹（106個(gè)）、蘋果（127 個(gè)）[47]等物種相比差異較大，較同科的木薯（77個(gè)）、蓖麻（48個(gè)）和麻風(fēng)樹（48 個(gè)）中GRAS 基因數(shù)量明顯增加，且蛋白長(zhǎng)度在117～824 個(gè)氨基酸之間變化，這種較大的差異可能與基因組大小或基因復(fù)制事件有關(guān)[20]。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，HbGRAS蛋白可分為14 個(gè)亞家族，而在水稻的每個(gè)亞群中均鑒定到HbGRAS 蛋白，這表明GRAS 家族的分化可能早于單、雙子葉植物的分化。橡膠樹GRAS亞族數(shù)量與木薯一致[20]，其中LISCL 成員最多（16個(gè)，17.58%），與擬南芥和水稻等植物相似[15]，表明這些GRAS 基因家族在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中可能具有較強(qiáng)的分化能力?；谙到y(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和多序列比對(duì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)HbGRAS 蛋白的N 端包含1 個(gè)高度無(wú)序的區(qū)域，這導(dǎo)致了GRAS 蛋白的多樣化，并影響了其功能分化。DELLA 亞家族蛋白N 端相對(duì)保守。橡膠樹DELLA 亞家族成員中除HbGRAS62 無(wú)DELLA 保守結(jié)構(gòu)域外，其余5個(gè)均含有DELLA 結(jié)構(gòu)域，這可能是HbGRAS62在進(jìn)化過程中發(fā)生了DELLA 基因的丟失事件，或者該基因不包含典型的“DELLA”和“DXLLX”五肽結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致[48]。

分析91個(gè)HbGRAS 基因的內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，無(wú)內(nèi)含子的HbGRAS 基因比例（69.23%）與同科的木薯（53.25%）[20]、蓖麻（78.3%）[22]和麻風(fēng)樹（95.83%）[21]類似，均較高。內(nèi)含子可以增加基因長(zhǎng)度及重組頻率，有利于物種進(jìn)化[49]。雖然內(nèi)含子較少的基因在物種進(jìn)化或重組中沒有優(yōu)勢(shì)，但它們往往對(duì)壓力反應(yīng)迅速[50]。因此，推測(cè)許多橡膠樹GRAS 基因成員可能會(huì)對(duì)環(huán)境變化做出快速響應(yīng)。

基因擴(kuò)增是基因組進(jìn)化的重要驅(qū)動(dòng)力，可以導(dǎo)致新的功能基因的產(chǎn)生和新物種的分化，從而使植物在進(jìn)化過程中更好地適應(yīng)環(huán)境[17]。染色體定位結(jié)果顯示，HbGRAS 基因位于除Chr11外的幾乎所有染色體上，這可能是進(jìn)化過程中發(fā)生片段丟失或染色體移位導(dǎo)致。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)有17 個(gè)HbGRAS 基因（18.68%）發(fā)生串聯(lián)重復(fù)事件，所有具有串聯(lián)重復(fù)序列的HbGRAS 基因均來自同一亞家族，且主要集中在LISCL 亞家族中（58.82%）。這意味著，基因復(fù)制保留在全基因組復(fù)制后存在一定程度的偏倚，不同亞家族的保留和丟失也不同。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，如果蛋白質(zhì)與基因編碼的其他產(chǎn)物存在相互作用，則在復(fù)制事件發(fā)生后，這類基因會(huì)發(fā)生偏置[51]。共線性分析顯示，片段重復(fù)區(qū)域中有87 個(gè)HbGRAS 基因（95.6%），說明片段重復(fù)在橡膠樹GRAS 基因進(jìn)化中可能發(fā)揮主要作用。

GA促進(jìn)植物次生細(xì)胞壁形成[52]，DELLA通過與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子互作調(diào)控水稻次生細(xì)胞壁中纖維素合成[53]。外施GA3 抑制橡膠樹木質(zhì)部DELLA表達(dá)，DELLA亞家族成員HbGRAS82 和HbGRAS89在木質(zhì)部中高表達(dá)，且隨橡膠樹木質(zhì)化程度加深上調(diào)表達(dá)，故推測(cè)它們可能參與橡膠樹次生細(xì)胞壁的形成。擬南芥DELLA 蛋白競(jìng)爭(zhēng)性地阻止阻遏蛋白JAZ 與轉(zhuǎn)錄因子MYC2 結(jié)合，從而提高M(jìn)YC2 對(duì)靶基因的調(diào)控能力[54]；WILD等[55]證實(shí)擬南芥RGL3能分別與MYC2 和JAZ 蛋白互作，進(jìn)而調(diào)控JA 介導(dǎo)的響應(yīng)；MYC2是調(diào)控橡膠生物合成途徑之一——JA 信號(hào)途徑的關(guān)鍵因子。吳紹華等[56]發(fā)現(xiàn)割膠和MeJA調(diào)控橡膠樹HbGAIPB基因的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示橡膠樹DELLA亞族成員在膠乳中均有表達(dá)，且除HbGRAS44外其他成員都含有MeJA 響應(yīng)元件。據(jù)此，推測(cè)橡膠樹DELLA基因可能通過調(diào)控JA 信號(hào)途徑參與橡膠生物合成。以上結(jié)果為進(jìn)一步研究橡膠樹GRAS基因的生物學(xué)功能、調(diào)控橡膠樹生長(zhǎng)發(fā)育與逆境響應(yīng)的分子機(jī)制奠定了一定的理論基礎(chǔ)。