〔摘要〕 目的 探討紫龍膏聯(lián)合LED紅光促進慢性難愈性創(chuàng)面的愈合情況以及對轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth fator-β， TGF-β）和血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor， PDGF）的影響。方法 選取2022年1月至2023年1月湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的48例慢性難愈性創(chuàng)面患者，按隨機數(shù)字表法分為對照組、LED組、紫龍膏組、紫龍膏+LED組，每組12例，連續(xù)干預(yù)28 d。計算各組創(chuàng)面愈合率；比較各組臨床療效；HE染色觀察各組創(chuàng)面組織病理變化；免疫組織化學(xué)檢測各組PDGF蛋白表達水平；Western blot檢測各組TGF-β蛋白表達水平。結(jié)果 紫龍膏組（100.00%）、紫龍膏+LED組（100.00%）臨床有效率高于LED組（83.33%）、對照組（25.00%）（P＜0.01）。與第14天比較，第28天紫龍膏組和紫龍膏+LED組的創(chuàng)面愈合率和PDGF、TGF-β蛋白表達水平均升高（P＜0.05，P＜0.01）。與對照組、LED組比較，第14、28天紫龍膏組和紫龍膏+LED組的創(chuàng)面愈合率和PDGF、TGF-β蛋白表達水平均升高（P＜0.05，P＜0.01）。與紫龍膏組比較，紫龍膏+LED組第14天的創(chuàng)面愈合率和TGF-β蛋白表達水平升高（P＜0.05，P＜0.01），第28天的創(chuàng)面愈合率和PDGF、TGF-β蛋白表達水平均升高（P＜0.05）。結(jié)論 紫龍膏聯(lián)合LED紅光治療慢性難愈性創(chuàng)面的效果較好，其可能通過提高TGF-β與PDGF蛋白表達水平，促進創(chuàng)面毛細血管增生與成纖維細胞增生，從而加速創(chuàng)面的愈合。

〔關(guān)鍵詞〕 慢性難愈性創(chuàng)面；紫龍膏；LED紅光；轉(zhuǎn)化生長因子-β；血小板源性生長因子

〔中圖分類號〕R275 〔文獻標志碼〕B 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.09.015

Effects of Zilong Ointment combined with LED red light on the

healing of refractory ulcer wounds， TGF-β， and PDGF

SONG Xiaoling1， LIU Ning1*， LI Ling2， XIANG Liping1， TIAN Yi1， LIU Wen1， YUAN Wanjing1

1. The Second Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects of Zilong Ointment combined with LED red light on the healing of refractory ulcer wounds and on the transforming growth factor of transforming growth factor-β （TGF-β） and platelet-derived growth factor （PDGF）. Methods Forty-eight patients with refractory ulcer wounds admitted to the Second Hospital of Hunan University of Chinese Medicine from January 2022 to January 2023 were divided into control group， LED group， Zilong Ointment group， and Zilong Ointment+LED group according to the random table number method， with 12 patients in each group. Continuous intervention was administered for 28 days. The wound healing rate was calculated and clinical efficacy was compared in each group. The pathological changes of wound tissue of each group were observed by HE staining. The expression level of PDGF protein in each group was determined by immunohistochemistry. The expression level of TGF-β protein in each group was checked by Western blot. Results The clinical effective rate of Zilong Ointment group （100.00%） and Zilong Ointment+LED group （100.00%） was higher than that of LED group （83.33%） and control group （25.00%） （P<0.05， P<0.01）. Compared with those of the 14th day， the wound healing rate and the protein expression levels of PDGF and TGF-β in the Zilong Ointment group and Zilong Ointment+LED group were significantly increased on the 28th day （P<0.01）. Compared with those of the control group and LED group， the wound healing rate， the protein expression levels of PDGF and TGF-β in Zilong Ointment group and Zilong Ointment+LED group were higher on the 14th and 28th day （P<0.05， P<0.01）. Compared with those of Zilong Ointment Group， the wound healing rate and TGF-β protein expression level of Zilong Ointment+LED group were significantly elevated on both the 14th and 28th day （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Zilong Ointment combined with LED red light therapy has a good effect on chronic refractory ulcer wounds， which may promote wound capillary and fibroblast proliferation by increasing the protein expression levels of TGF-β and PDGF， thereby accelerating the wound healing.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 refractory ulcer wound; Zilong Ointment; LED red light; platelet-derived growth factor; transforming growth factor-β

隨著人口老齡化的趨勢日益嚴重及糖尿病、腦梗死等慢性疾病的發(fā)病率增高，慢性難愈性創(chuàng)面的發(fā)病率逐漸增高，其臨床特點是創(chuàng)面愈合周期長、復(fù)發(fā)率高、易遺留瘢痕，已成為醫(yī)療系統(tǒng)的巨大挑戰(zhàn)和負擔(dān)[1]。中醫(yī)學(xué)無慢性難愈性創(chuàng)面這一病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸屬于“久敗瘡”“頑瘡”“瘡瘍”“臁瘡”等范疇。紫龍膏是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院向麗萍教授研制的自制藥，適用于慢性創(chuàng)面黃、紅期，具有祛腐生肌作用。研究表明，LED紅光可通過促進血管新生使創(chuàng)面愈合，為創(chuàng)面愈合提供了新的物理治療方法[2]。血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是人體血小板中含有的一種多肽，可刺激成纖維細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和其他多種細胞分裂增殖[3]。轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming

growth factor-β，TGF-β）是一種多功能生長因子，具有趨化細胞遷移與黏附、促進細胞增殖及分化、介導(dǎo)基質(zhì)降解與重構(gòu)、調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)等作用[4]。PDGF和TGF-β在傷口愈合過程中起重要作用。創(chuàng)面覆蓋凡士林紗條是臨床治療創(chuàng)面的常用方法之一[5]?；诖?，本研究旨在探討紫龍膏聯(lián)合LED紅光與凡士林紗布對慢性難愈性創(chuàng)面愈合效果的影響，現(xiàn)匯報如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2022年1月至2023年1月湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院創(chuàng)面修復(fù)科收治的48例肢體慢性難愈性創(chuàng)面患者隨機分為4組：對照組、LED組、紫龍膏組、紫龍膏+LED組，每組12例。其中壓力性潰瘍18例，下肢潰瘍10例，糖尿病性肢體潰瘍12例，其他原因潰瘍8例。4組一般資料差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），詳見表1。本試驗通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理審批（審批號2024-KY-038）。

1.2 納入標準

（1）符合《中醫(yī)病證診斷療效標準》[6]中“臁瘡”“脫疽”“褥瘡”診斷標準：潰瘍久不愈合潰瘍數(shù)目≥1處，且創(chuàng)面處于黃、紅期。黃、紅期分期標準[7]：黃期主要對應(yīng)炎性滲出期，以濕性壞疽為主，創(chuàng)面可見大量黃色腐肉，滲出液較多，臭穢難聞，創(chuàng)周紅腫熱痛明顯；紅期主要對應(yīng)肉芽組織增生期，創(chuàng)周紅腫減退，創(chuàng)面滲出減少，臭味減輕，可見新鮮肉芽組織生長，創(chuàng)緣開始爬皮或有皮島形成。（2eK05bD9uANf6UI9RusSEjbxCJ/X+TVu3BbGXbf9oDVE=）符合國際傷口愈合學(xué)會對于慢性難愈性創(chuàng)面的定義[8]與《創(chuàng)傷骨科慢性難愈性創(chuàng)面診療指南（2023版）》[9]的診斷標準：①有特定致病病因且嚴格治療4周未愈的創(chuàng)面；②年齡30～70歲；③配合治療方案且已簽署知情同意書者。

1.3 排除標準

（1）哺乳期或妊娠期婦女及相關(guān)藥物過敏患者；（2）合并嚴重心力衰竭、呼吸衰竭、腎衰竭、低蛋白血癥以及酮癥酸中毒的患者；（3）因特殊原因不能繼續(xù)治療的患者。

1.4 治療方法

4組均在使用藥物治療之前進行創(chuàng)面基本清潔：2%聚維酮碘消毒液創(chuàng)面消毒后用0.9%氯化鈉注射液去碘，再用無菌紗布擦干。

對照組創(chuàng)面清潔后使用凡士林紗布覆蓋，無菌紗布包扎固定，2次/d。LED紅光組創(chuàng)面清潔后使用LED光治療儀（武漢康進醫(yī)療科技有限公司，型號：KJ-RB-8D）紅光照射10 min，能量密度為20 J/cm，再無菌紗布包扎固定，2次/d。紫龍膏組創(chuàng)面清潔后使用紫龍膏均勻涂抹于創(chuàng)面，藥物厚度2～3 mm，覆蓋無菌紗布包扎固定，2次/d；LED紅光+紫龍膏組：創(chuàng)面清潔后使用LED紅光照射10 min，能量密度為20 J/cm，然后將紫龍膏均勻涂抹于創(chuàng)面，藥物厚度2～3 mm，覆蓋無菌紗布包扎固定，2次/d。4組均干預(yù)28 d。

1.5 標本取材

分別于第0、14、28天選取各組標本，在創(chuàng)面去痂后從創(chuàng)面邊緣分離創(chuàng)面組織，取創(chuàng)面中的肉芽組織，部分創(chuàng)面組織經(jīng)液氮冷卻后放入-80 ℃冰箱凍存，部分創(chuàng)面組織固定于多聚甲醛中。

1.6 觀察指標

1.6.1 創(chuàng)面愈合率 于第14、28天觀察并記錄各組創(chuàng)面愈合情況，用透明膜描記創(chuàng)面大小，將描記的透明膜放至小方格紙上計算創(chuàng)面面積，并計算每個時間點的創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=（治療前面積-治療后面積）/治療前面積×100%。

1.6.2 臨床療效評定 參照《中醫(yī)病證診斷療效標準》[6]制定疾病療效評價標準。顯效：創(chuàng)面明顯縮小≥75%；有效：創(chuàng)面縮小＜75％且≥25%；無效：創(chuàng)面縮小＜25%，甚至擴大。有效率=（顯效例數(shù)+有效例數(shù)）/總例數(shù)×100%。

1.6.3 創(chuàng)面組織的病理變化 將各組1/2的潰瘍組織固定于10%緩沖福爾馬林溶液中12～24 h，石蠟包埋，切成3～4 μm，常規(guī)脫水后，進行HE染色，中性樹膠封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6.4 創(chuàng)面組織中PDGF蛋白表達水平 將固定組織梯度乙醇脫水、二甲苯+石蠟透蠟、包埋、切片，檸檬酸抗原修復(fù)液修復(fù)抗原，PBS洗滌5 min×3次，切片放入3％過氧化氫溶液中室溫避光孵育15 min，BSA室溫封閉30 min，滴加一抗PDGF（1∶100），滴加至完全覆蓋組織，濕盒內(nèi)4 ℃過夜，第2天PBS洗滌5 min×3次，加相應(yīng)二抗HRP標記山羊抗兔IgG，滴加至完全覆蓋組織，濕盒內(nèi)37 ℃孵育60 min，PBS中5 min，重復(fù)3次。DAB顯色后蘇木素復(fù)染，脫水、封片，顯微鏡觀察染色效果于鏡下拍照。組織切片細胞質(zhì)染為淡黃色至棕褐色顆粒為PDGF陽性表達，顏色越深表示陽性表達越強。

1.6.5 創(chuàng)面組織中TGF-β蛋白表達水平 將標本組織裂解后離心取上清液提取蛋白，BCA法測定樣本蛋白濃度；按濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為14%制備聚丙烯酰胺凝膠，然后進行蛋白電泳與轉(zhuǎn)印，封閉后孵育一抗：用5%（M/V）脫脂奶粉稀釋抗體TGF-β1（1∶500）、β-actin（1∶1 000），將抗體工作液封閉后，進行抗體孵育過夜。孵育二抗：取出封閉的PVDF膜，浸入TBST中，搖床搖動5 min，重復(fù)此步驟4次。用5%（M/V）脫脂奶粉稀釋抗體，羊抗兔IgG-HRP，制成二抗工作液，37 ℃孵育45 min，取出PVDF膜，浸入TBST中，搖床搖動5 min，重復(fù)此步驟6次后，將PVDF膜灑上ECL發(fā)光液，靜置反應(yīng)5 min，轉(zhuǎn)入暗盒，在暗室進行曝光。將膠片進行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用統(tǒng)計軟件SPSS 25.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料用“ｘ±s”表示。單因素方差分析采用組間均值進行比較，事后多重比較采用LSD檢驗；不同時期蛋白表達變化情況采用重復(fù)測量方差分析；自身前后對照采用配對t檢驗；組間比較采用卡方檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者創(chuàng)面愈合率比較

與第14天比較，第28天各組的創(chuàng)面愈合率均明顯升高（P＜0.01）。與對照組比較，第14天紫龍膏組和紫龍膏+LED組的創(chuàng)面愈合率均明顯升高（P＜0.01）；第28天LED組、紫龍膏組和紫龍膏+LED組的創(chuàng)面愈合率均明顯升高（P＜0.01）。與LED組比較，第14、28天紫龍膏組和紫龍膏+LED組的創(chuàng)面愈合率均升高（P＜0.05，P＜0.01）。與紫龍膏組比較，第14、28天紫龍膏+LED組的創(chuàng)面愈合率均升高（P＜0.05）。詳見表2。

2.2 各組患者臨床療效比較

LED組（83.33%）、紫龍膏組（100.00%）、紫龍膏+LED組（100.00%）臨床有效率高于對照組（25.00%）（P＜0.01）。紫龍膏組（100.00%）、紫龍膏+LED組（100.00%）臨床有效率高于LED組（83.33%）（P＜0.01）。詳見表3。

2.3 各組創(chuàng)面組織病理形態(tài)變化比較

第14、28天，對照組創(chuàng)面組織無明顯形態(tài)學(xué)變化。與第0天比較，第14天LED組、紫龍膏組、紫龍膏+LED組仍有大量中性粒細胞，成纖維細胞與毛細血管有所增加；第28天LED組、紫龍膏組、紫龍膏+LED組中性粒細胞減少，成纖維細胞和毛細血管均明顯增生，其中紫龍膏+LED組效果最佳。詳見圖1。

2.4 各組創(chuàng)面組織PDGF蛋白表達水平比較

鏡下觀察可見，對照組第0、14、28天棕黃色顆粒均不明顯；LED組、紫龍膏組、紫龍膏+LED組第14天棕黃色顆粒較第0天明顯增多，第28天時，胞質(zhì)中黃褐色染色顆粒更明顯，出現(xiàn)少量棕褐色顆粒，以紫龍膏+LED組最為明顯。詳見圖2。

與第0天比較，第14天LED組、紫龍膏+LED組的PDGF蛋白表達水平升高（P＜0.05），第28天各組的PDGF蛋白表達水平升高（P＜0.05，P＜0.01）。與第14天比較，第28天對照組、紫龍膏組、紫龍膏+LED組的PDGF蛋白表達水平升高（P＜0.05），LED組的PDGF蛋白表達水平降低（P＜0.05）。與對照組比較，第0天紫龍膏組和紫龍膏+LED組的PDGF蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01），第14、28天LED組、紫龍膏組和紫龍膏+LED組的PDGF蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）；與LED組比較，第0、14、28天紫龍膏組和紫龍膏+LED組的PDGF蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）；與紫龍膏組比較，紫龍膏+LED組，第0天的PDGF蛋白表達水平下降（P＜0.05），第28天的PDGF蛋白表達水平升高（P＜0.05）。詳見表4。

2.5 各組創(chuàng)面組織TGF-β蛋白表達水平比較

與第0天比較，第14、28天各組的TGF-β蛋白表達水平升高（P＜0.05，P＜0.01）。與第14天比較，第28天對照組、LED組的TGF-β蛋白表達水平降低（P＜0.05），紫龍膏組和紫龍膏+LED組TGF-β蛋白表達水平升高（P＜0.05，P＜0.01）。與對照組比較，第14、28天LED組、紫龍膏組和紫龍膏+LED組的TGF-β蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.01）。與LED組比較，紫龍膏組和紫龍膏+LED組的TGF-β蛋白表達水平第0天降低（P＜0.05），第14、28天升高（P＜0.05，P＜0.01）。與紫龍膏組比較，紫龍膏+LED組第14、28天的TGF-β蛋白表達水平升高（P＜0.05，P＜0.01）。詳見表5。

3 討論

氣虛毒滯證是各種慢性潰瘍的核心證候[10]。中醫(yī)醫(yī)家多認為，慢性難愈性創(chuàng)面主要的病機為“虛”“瘀”“毒”，其中多因久病致虛、正氣不足、氣血不榮、氣血瘀滯、余毒未盡導(dǎo)致局部創(chuàng)面處于慢性期[11-12]。本病多秉承內(nèi)外兼治的治療原則，其中外治法在創(chuàng)面治療中起主導(dǎo)治療作用，中醫(yī)外用藥膏可使藥物直達病灶，改善局部的“虛”“毒”“瘀”癥狀。紫龍膏由龍血竭、紫草、黃芪、當(dāng)歸、白芷、連翹組成，方中白芷、連翹、紫草清熱解毒，龍血竭、當(dāng)歸、黃芪活血益氣，全方共奏益氣活血、化瘀解毒之效。研究表明，龍血竭具有活血化瘀、消炎鎮(zhèn)痛、生肌斂瘡之效[13]。紫草具有涼血活血、清熱解毒之效，現(xiàn)代藥理研究證明，紫草具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗炎等作用[14]。黃芪為補氣要藥，黃芪多糖能通過調(diào)控巨噬細胞表型，增加促炎因子的表達，維持正常炎癥反應(yīng)，促進創(chuàng)面愈合[15]。當(dāng)歸為治療癰疽瘡瘍的常用藥，具有活血化瘀、改善局部循環(huán)、促進血管內(nèi)皮細胞生長的作用[16]。白芷有抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛等藥理作用，促進內(nèi)皮細胞形成新生血管[17-18]。連翹素有“瘡家圣藥”之稱，是清熱解毒重要的代表中藥之一，上述諸藥合用，促進創(chuàng)面組織修復(fù)。

PDGF參與創(chuàng)面愈合過程的始終，其可促進新生血管生成，從而直接決定了組織愈合的速度[19]。TGF-β在創(chuàng)面愈合中的作用已被廣泛研究并得到認可，其具有調(diào)節(jié)細胞分化、增殖、遷移的作用，可促進創(chuàng)面組織再生與愈合[20-21]。本實驗研究結(jié)果顯示，與對照組相比，紫龍膏組、紫龍膏+LED組的創(chuàng)面愈合率升高，表明在慢性難愈性創(chuàng)面治療中對照組促組織修復(fù)效果較弱，這可能與凡士林紗布僅只有濕性覆蓋的作用有關(guān)，而慢性難愈性創(chuàng)面治療關(guān)鍵在于激活細胞組織抗炎活性，啟動機體修復(fù)機制。此外，紫龍膏+LED組臨床療效高于LED組，可能與創(chuàng)面的黃白組織液化不足、濕潤環(huán)境維持不足有關(guān)，說明紫龍膏聯(lián)合LED紅光具一定的祛腐生肌與維持創(chuàng)面濕潤的功效。與對照組相比，LED組、紫龍膏組以及紫龍膏+LED組治療后PDGF與TGF-β蛋白表達水平均升高，其中紫龍膏+LED組升高最明顯，提示在維持適合的濕潤環(huán)境下，利用祛腐生肌法疊加光生物效應(yīng)可能刺激創(chuàng)面PDGF與TGF-β細胞因子的表達，進而有利于創(chuàng)面修復(fù)。

綜上所述，紫龍膏和紫龍膏聯(lián)合LED治療慢性難愈性創(chuàng)面均可促進創(chuàng)面愈合。紫龍膏和紫龍膏聯(lián)合LED治療方案適用于治療慢性難愈性創(chuàng)面黃、紅期，可能與祛腐生肌法疊加光生物效應(yīng)刺激創(chuàng)面PDGF與TGF-β細胞因子的表達相關(guān)。光生物效應(yīng)與中醫(yī)藥聯(lián)合運用是一種有效的治療慢性難愈性創(chuàng)面的方法，其細胞分子機制的研究及臨床研究需要進一步探索。

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本文引用： 宋曉玲， 劉 寧， 李 玲， 向麗萍， 田 毅， 劉 文， 袁婉婧. 紫龍膏聯(lián)合LED紅光對慢性難愈性創(chuàng)面愈合及TGF-β與PDGF的影響[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2024， 44（9）： 1653-1659.

〔收稿日期〕2024-05-29

〔基金項目〕湖南省中醫(yī)藥科研基金項目（B2023130）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)校級科研基金項目（2021XJJJ059）。

〔通信作者〕*劉 寧，女，碩士，副主任醫(yī)師，副教授，E-mail：89257010@qq.com。