逍遙散及其拆方對Erastin誘導(dǎo)的LO-2肝細(xì)胞系鐵死亡的影響

〔摘要〕 目的 探討逍遙散及其拆方對Erastin誘導(dǎo)肝細(xì)胞鐵死亡的影響及機(jī)制。方法 使用鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin誘導(dǎo)肝細(xì)胞LO-2鐵死亡，用逍遙散及各功效拆方（逍遙散去疏肝藥組、逍遙散去健脾藥組、逍遙散去養(yǎng)血藥組）的含藥血清進(jìn)行干預(yù)，陽性對照藥使用鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1。通過CCK-8檢測細(xì)胞活力，ELISA法檢測細(xì)胞上清液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase， AST）水平，比色法檢測細(xì)胞中丙二醛（malondialdehyde， MDA）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione， GSH）、Fe2+等含量，熒光酶標(biāo)儀檢測脂質(zhì)過氧化活性氧（reactive oxygen species， ROS），RT-PCR檢測細(xì)胞中谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2， PTGS2）、鐵調(diào)素（hepcidin）、膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ferroportin， FPN1）mRNA表達(dá)，Western blot檢測細(xì)胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白6（bone morphogenetic protein 6， BMP6）、鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白（hemojuvelin， HJV）、Smad同源物4（mothers against decapentaplegic homolog 4， SMAD4）蛋白表達(dá)。結(jié)果 erastin誘導(dǎo)肝細(xì)胞鐵死亡后，細(xì)胞活力較對照組顯著下降（P<0.05），細(xì)胞外上清液中ALT、AST含量顯著上升（P<0.05），細(xì)胞中MDA、ROS、Fe2+、PTGS2與hepcidin mRNA表達(dá)及BMP6/HJV/Smad4信號通路蛋白顯著上升（P<0.05），GSH含量及GPX4、FPN1 mRNA表達(dá)顯著下降（P<0.05）。除逍遙散去養(yǎng)血藥組在Smad4蛋白表達(dá)方面與模型組無顯著差異（P>0.05），逍遙散及各功效拆方及陽性對照藥Ferrostatin-1均能顯著逆轉(zhuǎn)上述指標(biāo)的變化（P<0.05）。與整方組療效比較，逍遙散去疏肝藥組AST、MDA、GSH、ROS、Fe2+、BMP6、hepcidin、FPN1指標(biāo)具有顯著差異（P<0.05）；除逍遙散去健脾藥組在Smad4蛋白表達(dá)方面與整方組無顯著差異（P>0.05），逍遙散去健脾藥組及逍遙散去養(yǎng)血藥組對所檢測指標(biāo)均有顯著改善（P<0.05）。結(jié)論 逍遙散可抑制Erastin誘導(dǎo)的肝細(xì)胞鐵死亡，其機(jī)制可能與調(diào)控 BMP6/HJV/SMAD4 信號通路及其下游 hepcidin-ferroportin 軸有關(guān)，而逍遙散各功效拆方均在一定程度上參與了逍遙散抑制肝細(xì)胞鐵死亡的過程。

〔關(guān)鍵詞〕 逍遙散；鐵死亡；Erastin；hepcidin-ferroportin軸；BMP6/HJV/Smad4信號通路；丙二醛；過氧化活性氧

〔中圖分類號〕R285.5 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.09.007

Effects of Xiaoyao Powder and its disassembled formulas on Erastin-induced ferroptosis in hepatocyte LO-2 cell line

CAO Mengxing1， LI Yong2， QUE Renye1

1. Department of Spleen and Stomach Diseases， Shanghai Hospital of Integrated Chinese and Western Medicines of Shanghai University of Chinese Medicine， Shanghai 200082， China; 2. Department of Spleen and Stomach Diseases， Shanghai Hospital of Chinese Medicine of Shanghai University of Chinese Medicine， Shanghai 200071， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the effects of Xiaoyao Powder and its disassembled formulas on Erastin-induced ferroptosis in hepatocytes and the related mechanism. Methods Ferroptosis of hepatocyte LO-2 was induced by Erastin and intervened by the medicated serum of Xiaoyao Powder and its disassembled formulas （Xiaoyao Powder without liver-soothing medicines， Xiaoyao Powder without spleen-strengthening medicines， Xiaoyao Powder without blood-nourishing medicines）. Ferroptosis inhibitor Ferrostatin-1 was used as the positive control drug. The cell viability was evaluated by CCK-8. The levels of alanine aminotransferase （ALT） and aspartate aminotransferase （AST） in the cell supernatant were examined by ELISA， and the content of malondialdehyde （MDA）， reduced glutathione （GSH）， and Fe2+ in the cells were determined by colorimetry. Fluorescence enzyme-linked immunosorbent assay was used to check lipid peroxidation-related reactive oxygen species （ROS）， RT-PCR was used to examine the mRNA expressions of glutathione peroxidase 4 （GPX4）， prostaglandin-endoperoxide synthase 2 （PTGS2）， hepcidin， and ferroportin （FPN1） in the cells， and Western blot was used to check the expressions of bone morphogenetic protein 6 （BMP6）， hemojuvelin （HJV）， and mothers against decapentaplegic homolog 4 （Smad4） protein in the cells. Results After ferroptosis induced by Erastin， the viability of hepatocytes decreased significantly compared with the control group （P<0.05）; the content of ALT and AST in the extracellular supernatant increased significantly （P<0.05）; the contents of MDA， ROS， and Fe2+， the mRNA expressions of PTGS2 and hepcidin， and the protein level of BMP6/HJV/Smad4 signaling pathway in the cells increased significantly （P<0.05）， while the content of GSH and the mRNA expressions of GPX4 and FPN1 decreased significantly （P<0.05）. Except for the group of Xiaoyao Powder without blood-nourishing medicines showing no significant difference in Smad4 protein expression compared with the model group （P>0.05）， groups of Xiaoyao Powder and its disassembled formulas， as well as the positive control drug Ferrostatin-1 showed significant reversed changes in the aforementioned indicators （P<0.05）. There were significant differences in AST， MDA， GSH， ROS， Fe2+， BMP6， hepcidin and FPN1 between Xiaoyao Powder without liver-soothing medicines group and Xiaoyao Powder group （P<0.05）. Compared with Xiaoyao Powder， the group of Xiaoyao Powder without spleen-strengthening medicines showed no significant difference in Smad4 protein expression （P>0.05）， while both groups of Xiaoyao Powder without spleen-strengthening medicines and Xiaoyao Powder without blood-nourishing medicines showed significant differences in the detected indicators （P<0.05）. Conclusion Xiaoyao Powder can inhibit Erastin-induced ferroptosis in hepatocytes， and its mechanism may be related to the regulation of BMP6/HJV/Smad4 signal pathway and its downstream hepcidin-ferroportin axis. To some extent， each disassembled formula of it involves in the process of inhibiting ferroptosis in hepatocytes.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Xiaoyao Powder; ferroptosis; Erastin; hepcidin-ferroportin axis; BMP6/HJV/Smad4 signaling pathway; malondialdehyde; reactive oxygen species

鐵在機(jī)體內(nèi)參與細(xì)胞增殖、氧氣運(yùn)輸和儲存、DNA修復(fù)、維持造血功能、增強(qiáng)免疫等生理功能[1-2]，是構(gòu)成血紅蛋白、肌紅蛋白等許多蛋白質(zhì)的主要成分，是人體不可缺少的微量元素之一。機(jī)體具有嚴(yán)格的鐵調(diào)控機(jī)制來維持鐵穩(wěn)態(tài)，一般是通過食物吸收及循環(huán)鐵來保證足量的鐵發(fā)揮其生理效應(yīng)，又能防止鐵過量產(chǎn)生毒性[3]。肝臟是鐵貯存主要場所之一，鐵過載時(shí)會使細(xì)胞發(fā)生ATP水平降低、氧化應(yīng)激損傷、溶酶體功能減退、細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的破壞、DNA的損傷，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死。庫普弗細(xì)胞可被肝臟過多的鐵激活，將其內(nèi)吞至細(xì)胞中，分泌細(xì)胞因子、ROS等活化肝星狀細(xì)胞[4]，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，促使肝纖維化發(fā)生。

細(xì)胞內(nèi)過多的鐵可引起細(xì)胞損傷，在很長的一段時(shí)間內(nèi)研究者們將鐵過載引起的細(xì)胞死亡歸因于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死，而DIXON等[5]首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了一種新型細(xì)胞死亡方式鐵死亡（ferroptosis）后，為鐵代謝紊亂疾病研究領(lǐng)域指引了新的方向。鐵死亡是一種依賴于脂質(zhì)過氧化反應(yīng)驅(qū)動的非凋亡性細(xì)胞死亡方式，其發(fā)生過程需要細(xì)胞內(nèi)富含可利用的鐵。鐵死亡是一個(gè)全新的細(xì)胞死亡模式，它在形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)及遺傳學(xué)方面與凋亡、焦亡、自噬等有著明顯的不同。在形態(tài)學(xué)方面，發(fā)生鐵死亡的細(xì)胞主要表現(xiàn)為線粒體體積縮小，雙層膜密度增加，線粒體嵴減少或消失[5-6]。在生化方面，谷胱甘肽（reduced glutathione， GSH）耗竭，GPX4活性下降，脂質(zhì)氧化物不能經(jīng)GPX4催化的GSH還原反應(yīng)代謝，繼而二價(jià)鐵離子以類似芬頜反應(yīng)的方式氧化脂質(zhì)產(chǎn)生大量過氧化活性氧（reactive oxygen species， ROS），促使細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[5-6]。

逍遙散出自《太平惠民和劑局方·卷九·治婦人諸疾》，具有疏肝、健脾、養(yǎng)血作用[7-8]，臨床上多用于治療慢性肝臟疾病。方中柴胡順肝之性，使之不郁[9]，為君藥。因肝藏血，肝血不足導(dǎo)致肝之疏泄功能失常，白芍收斂肝陰并養(yǎng)血柔肝體，柴胡配白芍而無傷陰之弊；當(dāng)歸能夠養(yǎng)血和血，與白芍并用，可以增強(qiáng)補(bǔ)養(yǎng)陰血的功效，白芍、當(dāng)歸為臣藥。柴胡、白芍、當(dāng)歸三藥并用，達(dá)到補(bǔ)肝體而助肝用之效。方中薄荷可疏散肝經(jīng)郁遏之氣，透達(dá)肝經(jīng)之郁熱[10]；茯苓及白術(shù)二味藥均可健脾祛濕，恢復(fù)脾的運(yùn)化功能，從而使氣血生化有源；炙甘草益氣和中，緩肝之急；煨生姜能辛散達(dá)3osNKEC6+2kflIroybfTBw==郁，五味藥共為佐藥。八藥合用，相輔相成，使肝郁可舒，血虛可養(yǎng)，脾虛可復(fù)，神明可安[11]，共奏疏肝解郁、健脾和營之效。鐵代謝與血液形成有關(guān)，如《靈樞·決氣》云：“中焦受氣取汁，變化而赤，是謂血也?！薄端貑枴ち?jié)臟象論篇》載：“肝……其充在筋，以生血?dú)??！边@些描述充分說明了脾胃主運(yùn)化及肝主疏泄的作用在人體化生血液過程中的重要作用。肝主疏泄藏血，脾胃收納水谷，賴肝氣疏泄得以輸布精微。脾胃與肝臟在鐵的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)及參與血液生成中都發(fā)揮極重要的作用，臨床上一些患者因肝失疏泄，脾失運(yùn)化，不能將鐵通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)至造血器官，沉積于肝臟導(dǎo)致纖維化的發(fā)生。故認(rèn)為鐵代謝紊亂原因之一是肝失疏泄、脾失運(yùn)化，治療上應(yīng)著重“疏肝健脾”[12]。

逍遙散是臨床上多用于治療慢性肝臟疾病，具有疏肝健脾養(yǎng)血功效的方劑[12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，恩替卡韋聯(lián)合逍遙散治療肝郁脾虛型乙型肝炎肝硬化患者的鐵過載優(yōu)于單用恩替卡韋[12]。本實(shí)驗(yàn)研究擬構(gòu)建肝細(xì)胞鐵死亡模型，觀察逍遙散抑制鐵死亡的效果及機(jī)制，以及逍遙散疏肝、健脾、養(yǎng)血3個(gè)功效發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源和試劑

LO-2細(xì)胞系購買于復(fù)旦大學(xué)IBS細(xì)胞庫。丙二醛（malondialdehyde， MDA）（批號：A003-1-2）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione， GSH）比色法試劑盒（批號：A006-2-1）購自南京建成生物科技有限公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（批號：GB23301）、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（批號：GB23303）購自賽維爾生物公司；β-actin抗體（Cell Signaling Technology公司，批號：4970S）；RIPA裂解液（批號：P0013B）、PMSF蛋白酶抑制劑（批號：ST506）、1.5M Tris-HCl（pH8.8）（批號：ST789）、1.0M Tris-HCl（pH6.8）（批號：ST768）、10%SDS（批號：ST628）、四甲基乙二胺（批號：ST728）、Western blot一抗二抗稀釋液（批號：P0023）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0009）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）（批號：P0015）、脫脂奶粉（批號：P0216）、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號：P0018S）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜（美國Millipore公司，批號：IPFL07810）；DMEM培養(yǎng)基（江蘇凱基生物科技有限公司，批號：KGM12800-500）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司，批號：RR047A）；去鐵胺（上海源葉生物科技有限公司，批號：B70140）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級雄性SD成年大鼠購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司[SCXK（滬）2013-0016]，飼養(yǎng)于上海市中醫(yī)醫(yī)院動物房清潔級大鼠飼養(yǎng)室，飼養(yǎng)環(huán)境是恒溫（25±2） ℃、濕度50%～80%，自由攝食、飲水。本動物實(shí)驗(yàn)遵循“實(shí)驗(yàn)動物關(guān)愛和使用指南”，已通過上海市中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心動物實(shí)驗(yàn)倫理與福利委員會審核，倫理號：2020333。

1.3 含藥血清制備

稱取逍遙散（柴胡15 g、白芍15 g、當(dāng)歸15 g、白術(shù)15 g、茯苓15 g、甘草7.5 g），加水1 500 mL煮沸，保持沸騰20 min，加入薄荷和煨姜，繼續(xù)煎煮10 min，煎煮液過5層紗布，濾液濃縮至2 g/mL（按生藥量計(jì)），經(jīng)冷凍干燥制成粉末，以蒸餾水配制成混懸液。逍遙散各拆方組按逍遙散去疏肝藥組（去柴胡、薄荷）、逍遙散去養(yǎng)血藥組（去當(dāng)歸、白芍）、逍遙散去健脾藥組（去茯苓、白術(shù)、甘草） 混懸液制作方法同上。按大鼠體質(zhì)量10 mL/kg灌胃給藥，鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1用濃度為2.5 μmol/kg的水溶液（10 mL/kg）灌胃給藥，對照組予灌胃等量蒸餾水。每天給藥1次，連續(xù)7 d。實(shí)驗(yàn)期間自由攝食、飲水。末次給藥24 h后，腹主動脈采血，以6 000 r/min×10 min冷凍離心，收集上清液，將收集好的血清于56 ℃水浴中滅活30 min，0.22 μm濾膜過濾滅菌，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)胞分組及干預(yù)

用含有10%熱滅活胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2完全飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，每48 h更換培養(yǎng)基，細(xì)胞生長鋪滿培養(yǎng)瓶底80%后，用0.25%胰蛋白酶聯(lián)合0.02% EDTA消化傳代，實(shí)驗(yàn)選用對數(shù)生長期細(xì)胞。將LO-2細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，分為對照組、模型組、逍遙散全方組、逍遙散去疏肝藥組、逍遙散去健脾藥組、逍遙散去養(yǎng)血藥組、Ferrostatin-1組。對照組加DMEM完全培養(yǎng)基，模型組采用鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin（5 μmol/L）進(jìn)行造模，其他藥物組添加相應(yīng)藥物進(jìn)行干預(yù)，各組干預(yù)24 h后行相應(yīng)指標(biāo)檢測。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

1.5.1 肝細(xì)胞細(xì)胞活力、功能及鐵死亡指標(biāo)檢測 使用CCK-8檢測各組細(xì)胞活力；采用ELISA法檢測各組細(xì)胞上清液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase， ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase， AST）的含量，使用比色法檢測MDA、GSH含量，均按照試劑說明書操作進(jìn)行。

1.5.2 脂質(zhì)過氧化ROS檢測 PBS充分清洗藥物干預(yù)后的細(xì)胞，加入1 mL探針工作液充分覆蓋細(xì)胞，于37 ℃避光孵育10 min，再用預(yù)熱的PBS輕洗細(xì)胞3次；用10 μg/mL濃度的Hoechst 33342工作液1 mL充分覆蓋細(xì)胞，于37 ℃避光孵育30 min，用預(yù)熱的PBS輕洗細(xì)胞3次，加入2 mL/孔細(xì)胞培養(yǎng)液；置于熒光酶標(biāo)儀或熒光顯微鏡，于激發(fā)波長為488～535 nm、發(fā)射波長610 nm檢測熒光強(qiáng)度，ROS結(jié)果以熒光度值表示。

1.5.3 LO-2肝細(xì)胞BMP6/HJV/Smad4信號通路蛋白表達(dá)檢測 使用PMSF的（強(qiáng)）RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白，BCA蛋白試劑盒檢測蛋白含量。以SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至0.45 μm孔徑的PVDF膜。用脫脂奶粉與含TBST配制5%脫脂奶粉封閉液，條帶浸沒在封閉液中室溫慢搖3 h。封閉完成后，用TBST漂洗3次，每次5 min，使用TBST配制適合濃度的一抗，將目標(biāo)條帶浸沒于BMP6、HJV、Smad4、β-actin抗體中，4 ℃孵育過夜，用TBST漂洗。使用TBST配制適合濃度的HRP標(biāo)記二抗，將目標(biāo)條帶浸于二抗中，避光室溫慢搖孵育1 h。用TBST漂洗后，ECL顯色液覆蓋全膜，最后應(yīng)用Bio-Rad ChemiDocTM XRS+系統(tǒng)與Image Lab軟件曝光。

1.6 LO-2肝細(xì)胞GPX4、PTGS2及hepcidin-ferroportin軸mRNA表達(dá)檢測

采用RT-PCR法檢測：按步驟提取各組細(xì)胞總RNA，測各樣本RNA濃度及純度。在無核酸酶的離心管中每個(gè)樣本加入1 μg RNA樣本，5×g DNA digester Mix 2 μL，gDNA Eraser 1 μL， RNase freeH2O補(bǔ)足至10 μL，42 ℃水浴加熱2 min；在上述10 μL體系中加入反轉(zhuǎn)錄試劑，反應(yīng)條件：37 ℃，15 min，85 ℃，5 s，得到的 cDNA -20 ℃保存?zhèn)溆?。然后進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，引物見表1。在無核酸酶的離心管中加入TB Green Premix Ex Taq 10 μL，加上下游引物各0.4 μL，加入第1步得到的cDNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL，混勻，實(shí)時(shí)上機(jī)檢測。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s預(yù)變性，95 ℃ 5 s變性，60 ℃ 30 s 退火，同時(shí)收集熒光，40個(gè)循環(huán)。用相對表達(dá)量=2-△△Ct公式分析計(jì)算各個(gè)組的表達(dá)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Image J軟件、SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)作圖、分析，數(shù)據(jù)采用“ｘ±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 逍遙散及其功效拆方對Erastin誘導(dǎo)的LO-2肝細(xì)胞細(xì)胞活力及功能的影響

與對照組比較，模型組細(xì)胞活力顯著下降，細(xì)胞外上清液中ALT、AST含量顯著上升（P<0.05）。逍遙散全方及各拆方組干預(yù)后細(xì)胞活力顯著上升，ALT、AST含量顯著下降，陽性對照藥物具有相似的作用（P<0.05）。與全方組比較，逍遙散去疏肝藥組細(xì)胞活力和ALT指標(biāo)無顯著差異（P>0.05），AST顯著降低（P<0.05）；逍遙散去健脾藥組和逍遙散去養(yǎng)血藥組細(xì)胞活力、ALT、AST 3個(gè)指標(biāo)療效均顯著降低（P<0.05）。詳見表2。

2.2 逍遙散及其功效拆方對Erastin誘導(dǎo)的LO-2肝細(xì)胞鐵死亡的影響

相較于對照組，模型組細(xì)胞中MDA及ROS顯著上升（P<0.05），GSH顯著下降（P<0.05）。逍遙散全方及各拆方組干預(yù)后可顯著降低細(xì)胞中MDA、ROS含量，提高GSH含量（P<0.05），陽性對照藥物具有相似的作用（P<0.05）。與全方組比較，3個(gè)拆方組在改善MDA、ROS、GSH三者方面療效均顯著降低（P<0.05）。詳見表3。

與對照組比較，模型組細(xì)胞中Fe2+含量及PTGS2 mRNA表達(dá)顯著上升，GPX4 mRNA表達(dá)顯著下降（P<0.05）。逍遙散全方及各拆方組干預(yù)后可顯著降低細(xì)胞中Fe2+含量及PTGS2 mRNA表達(dá)顯著下降，GPX4 mRNA表達(dá)顯著上升，陽性對照藥物具有相似的作用（P<0.05）。與全方組療效比較，逍遙散去疏肝藥組在改善Fe2+含量方面療效降低（P<0.05），在改善PTGS2、GPX4 mRNA表達(dá)方面無顯著差異（P>0.05）；逍遙散去健脾藥組與逍遙散去養(yǎng)血藥組在改善Fe2+、GPX4及PTGS2三者方面療效均顯著降低（P<0.05）。詳見表4。

2.3 逍遙散及其功效拆方對Erastin誘導(dǎo)的LO-2肝細(xì)胞BMP6/HJV/Smad4信號通路的影響

相較于對照組，模型組細(xì)胞中BMP6/HJV/Smad4信號通路蛋白表達(dá)顯著上升（P<0.05）。逍遙散全方組、逍遙散去疏肝藥組、逍遙散去健脾藥組及陽性對照藥物干預(yù)后均可顯著降低細(xì)胞中BMP6/HJV/Smad4信號通路蛋白表達(dá)（P<0.05），逍遙散去養(yǎng)血藥組可顯著減低細(xì)胞中BMP6、HJV蛋白表達(dá)（P<0.05），但對Smad4蛋白表達(dá)無顯著影響（P>0.05）。與全方組比較，逍遙散去疏肝藥組BMP6蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05），對HJV及Smad4蛋白表達(dá)無顯著差異（P>0.05）；逍遙散去健脾藥組BMP6、HJV蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05），Smad4蛋白表達(dá)水平無顯著性差異（P>0.05）。逍遙散去養(yǎng)血藥組在改善BMP6/HJV/Smad4信號通路蛋白表達(dá)方面療效均顯著降低（P<0.05）。詳見圖1、表5。

2.4 逍遙散及其功效拆方對Erastin誘導(dǎo)的LO-2肝細(xì)胞hepcidin-ferroportin軸的影響

與對照組比較，模型組細(xì)胞中hepcidin mRNA表達(dá)顯著上升，F(xiàn)PN1 mRNA表達(dá)顯著下降（P<0.05）。逍遙散全方組及各拆方組干預(yù)后可顯著降低細(xì)胞中hepcidin mRNA表達(dá)，提高FPN1 mRNA表達(dá)，陽性對照藥物具有相似的作用（P<0.05）。與全方比較，3個(gè)拆方組在改善hepcidin-ferroportin mRNA表達(dá)方面療效均顯著降低（P<0.05）。詳見表6。

3 討論

在遺傳學(xué)方面，對于鐵死亡的發(fā)生及調(diào)控機(jī)制的研究尚處于起始階段，鐵死亡是多基因調(diào)控的。目前認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)Fe2+的蓄積及GPX4活性抑制是Lipid-ROS生成并誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生的兩個(gè)關(guān)鍵因素。HSC能攝取膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從庫普弗細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外的鐵。通過細(xì)胞的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（TfR1）連接含三價(jià)鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白，將三價(jià)鐵轉(zhuǎn)化為HSC可儲存的鐵[13]。研究發(fā)現(xiàn)，大量的鐵沉積于肝組織可形成HSC活化的外環(huán)境，會促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展，甚至導(dǎo)致肝硬化的發(fā)生[14]。Ferrostatin-1作為一種特異性鐵死亡抑制劑，可通過抑制ROS蓄積降低脂質(zhì)過氧化作用，保護(hù)Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，利用高鐵蓄積的血色病小鼠模型發(fā)現(xiàn)高鐵蓄積小鼠肝臟可發(fā)生顯著的肝細(xì)胞鐵死亡，而通過缺鐵飼料或Ferrostatin-1清除鐵死亡能明顯改善肝纖維化等鐵過載引發(fā)的病理損傷，提示鐵過載可能是通過誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生鐵死亡進(jìn)而活化肝星狀細(xì)胞引起肝纖維化的發(fā)生[16]，而抑制肝細(xì)胞鐵死亡可逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進(jìn)展[17]。

鐵調(diào)素是肝細(xì)胞分泌的HAMP基因編碼的肽類物質(zhì)，鐵調(diào)素在缺氧、炎癥、鐵過載等情況下可通過調(diào)節(jié)小腸對鐵的吸收、巨噬細(xì)胞對鐵的回收以及肝細(xì)胞對鐵的儲存來調(diào)節(jié)機(jī)體鐵水平[18-19]。hepcidin與鐵輸出蛋白FPN1結(jié)合，誘導(dǎo)FPN1內(nèi)化及降解作用，抑制FPN1向外轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)鐵，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵過載，并調(diào)節(jié)十二指腸對鐵的吸收以及巨噬細(xì)胞對鐵的循環(huán)再利用[12，20]。近年研究發(fā)現(xiàn)，hepcidin受很多因素的調(diào)節(jié)，如機(jī)體鐵的營養(yǎng)狀況、炎癥、貧血和缺氧均可影響hepcidin的表達(dá)變化。其中研究最多且與肝臟關(guān)系較密切的有兩條：即貧血，缺氧，鐵過載通過BMP6/HJV/Smad4信號通路在肝臟實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)hepcidin的表達(dá)；炎癥通過IL-6/JAK2/STAT3信號通路在肝臟、巨噬細(xì)胞促進(jìn)hepcidin的表達(dá)，同時(shí)BMP6/HJV/Smad4信號通路可以協(xié)同增強(qiáng)IL-6/JAK2/STAT3信號通路。

本研究提出假說逍遙散通過疏肝健脾功效抑制肝細(xì)胞鐵死亡，機(jī)制可能與調(diào)控BMP6/HJV/Smad4及其下游hepcidin-ferroportin軸有關(guān)。因此，設(shè)置鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1為陽性對照藥物，觀察逍遙散及其拆方對肝細(xì)胞LO-2鐵死亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，逍遙散可抑制LO-2肝細(xì)胞系的鐵死亡，主要表現(xiàn)在降低Fe2+與鐵死亡標(biāo)志物MDA、ROS、PTGS2的含量，上調(diào)GSH含量及GPX4的表達(dá)，降低細(xì)胞脂質(zhì)過氧化作用，緩解細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生。通過進(jìn)一步檢測鐵過載通路BMP6/HJV/Smad4及hepcidin-ferroportin軸，發(fā)現(xiàn)逍遙散可以降低鐵調(diào)素hepcidin及其上游通路BMP6/HJV/Smad4的表達(dá)，上調(diào)膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ferroportin的含量，從而促進(jìn)機(jī)體對鐵的回收與儲存來減輕鐵過載。通過拆方實(shí)驗(yàn)，將逍遙散拆分為逍遙散去疏肝藥、逍遙散去養(yǎng)血藥以及逍遙散去健脾藥3組，發(fā)現(xiàn)與逍遙散全方療效相比，逍遙散去疏肝藥、逍遙散去健脾藥及逍遙散去養(yǎng)血藥在改善肝細(xì)胞活力、功能及鐵死亡方面均有明顯差異，如逍遙散去健脾藥在改善Erastin誘導(dǎo)的肝細(xì)胞細(xì)胞活力及功能下降的療效，低于逍遙散全方；逍遙散去養(yǎng)血藥在改善鐵死亡標(biāo)志物MDA、ROS、GSH、PTGS2、GPX4及Fe2+含量的療效，低于逍遙散全方；逍遙散去疏肝藥在改善鐵死亡通路蛋白BMP6及hepcidin-ferroportin的表達(dá)，低于逍遙散全方。說明逍遙散全方無論去除疏肝藥、養(yǎng)血藥或健脾藥均對其抑制肝細(xì)胞鐵死亡的療效有影響，提示逍遙散疏肝、養(yǎng)血以及健脾的功效都參與了機(jī)體鐵代謝的平衡。

逍遙散調(diào)控鐵過載通路BMP6/HJV/Smad4及其下游hepcidin-ferroportin軸，抑制肝細(xì)胞鐵死亡，其疏肝、養(yǎng)血、健脾功效均參與了這個(gè)過程，為探索逍遙散治療肝病提供了新的靶點(diǎn)和思路。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在改善肝郁脾虛型乙肝肝硬化患者肝纖維化方面，逍遙散聯(lián)合恩替卡韋療效優(yōu)于單用恩替卡韋，聯(lián)合用藥改善患者鐵過載水平[12]。逍遙散可改善慢性鐵過載誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化，方中疏肝藥、健脾藥、養(yǎng)血藥均對改善鐵過載及肝纖維化有一定作用[21]。但逍遙散治療肝纖維化的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本次研究結(jié)果不僅完善了逍遙散組方功效的理論認(rèn)知，更為逍遙散調(diào)節(jié)機(jī)體鐵代謝提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為中藥復(fù)方的臨床使用提供了基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的理論依據(jù)。

綜上所述，逍遙散可抑制Erastin誘導(dǎo)的肝細(xì)胞鐵死亡，其機(jī)制可能與調(diào)控BMP6/HJV/Smad4信號通路及其下游hepcidin-ferroportin軸有關(guān)，而逍遙散各功效拆方均在一定程度上參與了逍遙散抑制肝細(xì)胞鐵死亡的過程。

參考文獻(xiàn)

[1] RAMOS-ALONSO L， WITTMAACK N， MULET I， et al. Molecular strategies to increase yeast iron accumulation and resistance[J]. Metallomics： Integrated Biometal Science， 2018， 10（9）： 1245-1256.

[2] GANZ T， NEMETH E. Iron homeostasis in host defence and inflammation[J]. Nature Reviews Immunology， 2015， 15（8）： 500-510.

[3] 林鵬展， 田 菲， 張 林， 等.中醫(yī)藥干預(yù)鐵死亡機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2021， 41（2）： 318-322.

[4] ANDERSON E R， SHAH Y M. Iron homeostasis in the liver[J]. Comprehensive Physiology， 2013， 3（1）： 315-330.

[5] DIXON S J， LEMBERG K M， LAMPRECHT M R， et al. Ferroptosis： An iron-dependent form of nonapoptotic cell death[J]. Cell， 2012， 149（5）：1060-1072.

[6] GAO M H， MONIAN P， JIANG X J. Metabolism and iron signaling in ferroptotic cell death[J]. Oncotarget， 2015， 6（34）： 35145-35146.

[7] 甄雪燕， 代逸丹， 趙 歆. 從明代文獻(xiàn)看逍遙散的發(fā)展[J]. 中醫(yī)學(xué)報(bào)， 2022， 37（9）： 2020-2026.

[8] 李卓嫻， 徐麗靜， 夏 猛. 逍遙散類方治療肝癌的研究進(jìn)展[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥， 2022， 15（8）： 1491-1496.

[9] 楊婧雯， 苗 香， 梁文青， 等. 逍遙散治郁證辨析[J]. 中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志， 2023， 29（1）： 52-55.

[10] 李 萌， 祁向爭， 周 月. 逍遙散及其化裁方治療慢性胃炎臨床研究進(jìn)展[J]. 中國民族民間醫(yī)藥， 2023， 32（17）： 65-69.

[11] 葛冰景， 肖鐵剛， 周 薏， 等. 逍遙散聯(lián)合恩替卡韋治療肝郁脾虛型乙肝后肝硬化代償期30例臨床研究[J]. 江蘇中醫(yī)藥，2020， 52（11）： 28-31.

[12] 葛冰景， 周 薏， 肖鐵剛， 等. 逍遙散聯(lián)合恩替卡韋對肝郁脾虛型乙型肝炎肝硬化代償期患者纖維化及鐵代謝的影響[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2021， 41（2）： 296-302.

[13] 江 遠(yuǎn)， 張 玲， 鐘肖英， 等. 鐵沉積對大鼠肝纖維化影響的機(jī)制研究[J]. 實(shí)用肝臟病雜志， 2015， 18（2）： 173-177.

[14] ANGELI J P F， PRONETH B， HAMMOND V J， et al. Inactivation of the ferroptosis regulator Gpx4 triggers acute renal failure in a therapeutically relevant mechanism[J]. Free Radical Biology and Medicine， 2014， 76： S77-S78.

[15] 陳 浩， 李小楓， 王 華. 鐵死亡調(diào)控肝纖維化中的作用機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2021， 56（11）： 2916-2922.

[16] WANG H， AN P， XIE E J， et al. Characterization of Ferroptosis in Murine Models of Hemochromatosis[J]. Hepatology， 2017， 66（2）： 449-465.

[17] WU A M， FENG B， YU J， et al. Fibroblast growth factor 21 attenuates iron overload-induced liver injury and fibrosis by inhibiting ferroptosis[J]. Redox Biology， 2021， 46： 102131.

[18] VIATTE L， VAULONT S. Hepcidin， the iron watcher[J]. Biochi？鄄

mie， 2009， 91（10）： 1223-1228.

[19] 李余佳， 王 玲， 金 春， 等. 鐵死亡的調(diào)控機(jī)制及其在肝疾病中的作用研究進(jìn)展[J]. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志， 2019， 33（4）： 307-31.

[20] 劉玉潔， 耿 惠. 鐵調(diào)素受體-膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究進(jìn)展[J]. 重慶醫(yī)學(xué)， 2016， 45（8）： 1110-1113.

[21] 周 薏， 葛冰景， 肖鐵剛， 等. 逍遙散及其功效拆方對慢性鐵過載誘導(dǎo)的肝纖維化的影響[J]. 云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2021， 44（1）： 17-23， 41.

本文引用： 曹夢醒， 李 勇， 闕任燁. 逍遙散及其拆方對Erastin誘導(dǎo)的LO-2肝細(xì)胞系鐵死亡的影響[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2024， 44（9）： 1601-1607.

〔收稿日期〕2023-07-10

〔基金項(xiàng)目〕國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81873157，81573775）；上海市科學(xué)技術(shù)委員會科研計(jì)劃項(xiàng)目（19YF1445200）；上海市虹口區(qū)衛(wèi)生健康委員會中醫(yī)藥科研基金項(xiàng)目（HKQGYQY-ZYY-2022-08）。

〔通信作者〕*闕任燁，男，博士，主治醫(yī)師，E-mail：824492@qq.com。