大黃素抑制背根神經(jīng)節(jié)壓迫小鼠模型STAT3、VEGFA、p-ERK蛋白表達(dá)及其鎮(zhèn)痛作用研究

〔摘要〕 目的 研究大黃素（Emodin， ED）對(duì)背根節(jié)壓迫小鼠模型的鎮(zhèn)痛作用以及對(duì)STAT3/VEGFA/p-ERK信號(hào)通路的影響。方法 建立背根神經(jīng)節(jié)慢性壓迫（chronic compression damage， CCD）小鼠疼痛模型，隨機(jī)分為空白組、模型組、普瑞巴林組及ED低、中、高劑量組。通過(guò)檢測(cè)動(dòng)物機(jī)械痛敏和熱輻射痛敏閾值、醋酸扭體實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)鎮(zhèn)痛效果；ELISA檢測(cè)小鼠L4-L5節(jié)段脊髓組織中白細(xì)胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α， TNF-α）和CD18等炎癥因子含量；Western blot和免疫熒光檢測(cè)脊髓組織信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）和磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（phosphorylated extracellular signal-regulated kinases 1/2， p-ERK1/2）蛋白表達(dá)。結(jié)果 與空白組比較，模型組的機(jī)械痛敏、熱輻射痛敏閾值顯著降低（P<0.05），脊髓背角炎癥因子表達(dá)顯著增高（P<0.05），脊髓中VEGFA、STAT3、p-ERK的表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05）。與模型組比，ED低、中、高劑量組CCD小鼠模型的機(jī)械痛敏、熱輻射痛敏閾值升高（P<0.05）；脊髓背角炎癥因子表達(dá)降低（P<0.05）；脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞STAT3、VEGFA、p-ERK的表達(dá)降低（P<0.05），醋酸誘導(dǎo)的小鼠急性疼痛中扭體次數(shù)減少（P<0.05）。結(jié)論 ED對(duì)背根節(jié)壓迫小鼠模型有良好的鎮(zhèn)痛作用，其機(jī)制可能與抑制脊髓背角炎癥因子表達(dá)和STAT3/VEGFA/p-ERK介導(dǎo)的脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 大黃素;背根神經(jīng)節(jié)慢性壓迫；神經(jīng)病理性疼痛；STAT3/VEGFA/p-ERK信號(hào)通路；鎮(zhèn)痛；炎癥介質(zhì)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285.5 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.09.005

Inhibition of emodin on STAT3， VEGFA， and p-ERK protein

expressions in mouse model of dorsal root ganglion compression

and its analgesic effect

ZENG Jinming1， FAN Chenglong1， DENG Jiao1， QU Zhanli2， LI Gang1*

1. Department of Anesthesiology， The Second Clinical Medical College of Sichuan North Medical College， Nanchong， Sichuan 637000， China; 2. Department of Neurology， The Second Clinical Medical College of Sichuan North Medical College， Nanchong， Sichuan 637000， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To study the analgesic effect of emodin （ED） on dorsal root ganglion compression mouse model and its impact on STAT3/VEGFA/p-ERK signaling pathway. Methods A chronic compression damage （CCD） pain mice model was established and the mice were randomized into blank group， model group， pregabalin group， low-， medium-， and high-dose ED groups. The mechanical and thermal radiation pain sensitivity thresholds of the animals were measured， and the analgesic effect was evaluated using the acetic acid writhing test; the levels of inflammatory factors such as Interleukin-6 （IL-6）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， and CD18 in the spinal cord of mice at L4-L5 levels were checked by ELISA; the protein expressions of signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3）， vascular endothelial growth factor （VEGF）， and phosphorylated extracellular signal-regulated kinases 1/2 （p-ERK1/2） in the spinal cord were determined by Western blot and immunofluorescence. Results Compared with the blank group， the model group showed significantly decreased mechanical and thermal radiation pain sensitivity thresholds， as well as significantly increased expression of inflammatory factors in the spinal dorsal horn （P<0.05）， and the expressions of VEGFA， STAT3， and p-ERK in spinal cord were significantly up-regulated （P<0.05）. Compared with the model group， the low-， medium-， and high-dose ED groups of the CCD mouse model exhibited increased mechanical and thermal radiation pain sensitivity thresholds （P<0.05）， decreased expression of inflammatory factors in spinal dorsal horn （P<0.05）， reduced expressions of STAT3， VEGFA， and p-ERK in spinal dorsal horn microglia （P<0.05）， and a decreased number of writhing in acute pain induced by acetic acid in mice （P<0.05）. Conclusion ED has a good analgesic effect on dorsal root ganglion compression mouse model， and its mechanism may be related to the inhibition of inflammatory factor expression in the spinal dorsal horn and the activation of spinal microglia mediated by STAT3/VEGFA/p-ERK.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 emodin; chronic compression of dorsal root ganglion; neuropathic pain; STAT3/VEGFA/p-ERK signaling pathway; analgesia; inflammatory mediator

背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion， DRG）是脊髓神經(jīng)根部的結(jié)構(gòu)，包含感覺(jué)神經(jīng)元胞體，負(fù)責(zé)傳導(dǎo)來(lái)自身體特定區(qū)域的感覺(jué)信息至中樞神經(jīng)系統(tǒng)[1-2]。當(dāng)背根神經(jīng)節(jié)由直接或間接因素受到壓迫時(shí)，機(jī)械性壓力可引起局部炎癥反應(yīng)，釋放炎性介質(zhì)如前列腺素，增強(qiáng)痛覺(jué)信號(hào)傳導(dǎo)，引發(fā)劇烈腰疼以及下肢放射性疼痛（坐骨神經(jīng)痛）；持續(xù)的壓迫可能導(dǎo)致背根神經(jīng)纖維損傷、缺血或變性，進(jìn)一步影響神經(jīng)傳導(dǎo)，出現(xiàn)感覺(jué)異常、肌肉力量減弱及反射改變等神經(jīng)功能受損表現(xiàn)；長(zhǎng)時(shí)間的壓迫還可能誘發(fā)DRG自身及其周?chē)M織的繼發(fā)性病理變化，如水腫、纖維化甚至神經(jīng)元死亡，加重癥狀并影響治療效果[1-2]。DRG受壓在腰椎間盤(pán)突出癥中扮演著關(guān)鍵的角色，是疾病引發(fā)疼痛及神經(jīng)癥狀的核心環(huán)節(jié)之一，也是臨床治療時(shí)需重點(diǎn)考慮解除病因以改善患者生活質(zhì)量的重要目標(biāo)[2]。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3 （signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）/磷酸化的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（phosphorylated extracellular signal-regulated kinase，p-ERK）信號(hào)通路在DRG介導(dǎo)腰痛的過(guò)程中具有重要的作用[3-4]。當(dāng)腰椎間盤(pán)突出或腰背部組織炎癥等病理狀態(tài)發(fā)生時(shí)，這些分子信號(hào)途徑可能被激活并參與到疼痛的產(chǎn)生和維持中。STAT3是一種轉(zhuǎn)錄因子，在多種細(xì)胞應(yīng)答過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，包括炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖；在神經(jīng)病理性疼痛背景下，STAT3在DRG內(nèi)可能因炎癥因子刺激而活化，促進(jìn)與疼痛相關(guān)的基因表達(dá)，從而加劇痛覺(jué)敏感性[5-7]。VEGFA原本是參與血管生成的重要生長(zhǎng)因子，但研究發(fā)現(xiàn)它也在神經(jīng)損傷和炎癥狀態(tài)下于DRG上調(diào)表達(dá)；VEGFA可增強(qiáng)神經(jīng)元的興奮性，通過(guò)調(diào)節(jié)離子通道功能及促進(jìn)神經(jīng)纖維的新生和重塑，間接導(dǎo)致疼痛感覺(jué)的增強(qiáng)[8-10]。ERK屬于絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族成員，其磷酸化形式p-ERK代表了該信號(hào)通路的激活狀態(tài)；在神經(jīng)病理性疼痛條件下，p-ERK信號(hào)通路在DRG中被激活，不僅影響神經(jīng)元的生存與分化，還參與調(diào)控疼痛相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而增加對(duì)疼痛刺激的感知和傳遞[11-13]。STAT3/VEGFA/p-ERK信號(hào)通路在DRG中協(xié)同作用，通過(guò)調(diào)控神經(jīng)元功能狀態(tài)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，介導(dǎo)并加劇腰痛的發(fā)生和發(fā)展[3]。大黃素（Emodin，ED）具有鎮(zhèn)痛、抗炎作用[14-15]，但其對(duì)疼痛的治療作用及機(jī)制尚不明確。本文旨在探究大黃素對(duì)慢性縮窄損傷（chronic constriction damage，CCD）小鼠疼痛模型的鎮(zhèn)痛作用及可能的作用機(jī)制，為研發(fā)新的鎮(zhèn)痛策略提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

54只SPF級(jí)ICR雄性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，合格證號(hào)：SCXK（京）2021-0011。所使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（許可證號(hào)：SYXK（京）2019-0008），在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，光照周期為12 h光/12 h暗，溫度控制在（23±1） ℃，濕度為55%±5%。在適應(yīng)性飼養(yǎng)2～3 d后用于實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審批號(hào)：2022KY1145。

1.2 藥物與試劑

大黃素（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：2082588）；普瑞巴林膠囊[齊魯制藥（海南）有限公司，批號(hào)：2022.03.26]；STAT3、VEGFA、p-ERK1（沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物有限公司，批號(hào)分別為WLP2412、WLP001a、WLP1512）；小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（ionized calcium-binding adapter molecule 1，IBA-1）（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為ab201015、1832039、1816955）；GAPDH（美國(guó)Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：2118s）；TNF-α試劑盒（上海翌圣生物科技股份有限公司，批號(hào)：98029ES48）；IL-6（上海碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：PI326）；CD18試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：E2023？鄄0803-31063A）；DAPI染色試劑（武碧云天生物科技有限公司，批號(hào)：C1006）。

1.3 儀器設(shè)備

37370型足底紅外熱刺激儀（法國(guó)BIOSEB公司）；VonFrey型機(jī)械刺痛測(cè)試包（上海軟隆科技發(fā)展有限公司）；Varioskan LUX型多功能酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技（上海）有限公司]；CM1950型冰凍切片機(jī)[徠卡生物系統(tǒng)（努斯洛赫）有限公司]；WSF400LED型倒置熒光顯微鏡（廣州微域光學(xué)儀器有限公司）；冷熱板測(cè)痛儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）；光熱尾痛測(cè)試儀（北京亞歐德鵬科技有限公司）；ELITE系列電泳儀（蘇州賽恩斯儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 疼痛模型的建立與藥物、試劑配制

使用“L”型不銹鋼絲插入椎間孔建立CCD小鼠模型，模擬壓迫神經(jīng)節(jié)或神經(jīng)根的經(jīng)典動(dòng)物模型，持續(xù)的壓迫可導(dǎo)致疼痛、感覺(jué)缺失等神經(jīng)元的異常反應(yīng)[16]。動(dòng)物造模后，能夠保持肢體的感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)功能，動(dòng)物自主活動(dòng)減少；造模后的動(dòng)物表現(xiàn)出顯著的對(duì)機(jī)械性和熱痛敏感，動(dòng)物手術(shù)后對(duì)側(cè)的肢體亦表現(xiàn)出顯著的對(duì)機(jī)械性和熱痛敏感。CCD小鼠有上述表現(xiàn)或行為學(xué)異常，提示造模成功。本文構(gòu)建的CCD小鼠模型參照DECOSTERD等的方法[17]，具體步驟如下：首先小鼠使用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）進(jìn)行麻醉。剃毛，消毒后然后沿著L4～L5脊椎左側(cè)約0.5 cm處手術(shù)刀縱向切口，使用鈍器分離器充分暴露腰4至腰5橫突及乳狀突等解剖結(jié)構(gòu)，直至術(shù)野完全暴露左側(cè)第4腰椎間孔。采用直徑為0.6 mm不銹鋼絲（長(zhǎng)約5 mm）小心緩慢緊貼椎間孔上緣插入左側(cè)腰4椎間孔，進(jìn)針?lè)较驗(yàn)殇摻z向頭背方向與與脊柱側(cè)面水平線(xiàn)成10°且與背部正中線(xiàn)成30°。觀(guān)察到同側(cè)后肢肌肉輕微顫動(dòng)表示鋼絲插入成功。生理鹽水沖洗傷口，縫合，放回鼠籠等待其蘇醒。預(yù)防傷口感染。對(duì)于空白組的動(dòng)物，暴露椎間孔后即縫合術(shù)口。動(dòng)物造模次日口服灌胃給予相應(yīng)受試物。

藥物配制：稱(chēng)取所需量受試物（ED和普瑞巴林）置于定容過(guò)的燒杯中，緩慢加入少量生理鹽水，使受試物表面潤(rùn)濕后再緩慢加入生理鹽水，定容至所需體積。使用生理鹽水稀釋0.6%醋酸溶液至所需體積。

2.2 動(dòng)物分組與給藥

將54只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為6組，即空白組、模型組、普瑞巴林組（60 mg/kg）及 ED 低、中、高劑量組（7.5、15、30 mg/kg）?？瞻捉M只暴露椎間孔后即縫合術(shù)口；模型組CCD小鼠模型是使用“L”型不銹鋼絲插入椎間孔，具體操作見(jiàn)上述造模方法；普瑞巴林組在模型組基礎(chǔ)上給予普瑞巴林（60 mg/kg）灌胃；ED低、中、高劑量組在模型組基礎(chǔ)上給予ED低、中、高劑量（7.5、15、30 mg/kg）灌胃。第二天上午9點(diǎn)起開(kāi)始給藥，空白組和模型組動(dòng)物灌胃給予等體積的生理鹽水。每日1次，連續(xù)16 d。

受試物劑量設(shè)置理由：根據(jù)人與小鼠的體表面積折算等效劑量。普瑞巴林臨床推薦最大日用劑量為5 mg/kg，折算成小鼠的給藥劑量為60 mg/kg。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16]，50 mg/kg ED對(duì)結(jié)腸癌小鼠模型的腫瘤具有明顯抑制作用。因此，本研究將30 mg/kg設(shè)為最大給藥劑量，并以2倍為梯度，設(shè)置低劑量組與中劑量組。

2.3 取材

末次給藥后1.5 h，使用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉。打開(kāi)椎骨游離脊髓取出L4～L5脊髓節(jié)段，借助顯微鏡游離L4～L5脊髓背角，擦除血跡，保存樣品備測(cè)，用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)、ELISA和Western blot檢測(cè)評(píng)價(jià)ED鎮(zhèn)痛藥效。

2.4 機(jī)械痛覺(jué)和熱輻射痛覺(jué)閾值的檢測(cè)疼痛情況

將動(dòng)物放置安靜的環(huán)境適應(yīng)1～2 h。使用Von Frey細(xì)絲（2～26） g隨機(jī)測(cè)試小鼠左后足足底的機(jī)械痛覺(jué)閾值變化，采用序貫法檢測(cè)小鼠縮足反應(yīng)并通過(guò)軟件計(jì)算50%縮足閾值。紅外線(xiàn)熱刺激儀依照時(shí)間順序聚焦熱源，于小鼠左后足底中央，觀(guān)察熱刺激縮足反應(yīng)的潛伏期。每只動(dòng)物每隔5 min重復(fù)測(cè)試，共測(cè)試3次。最大反應(yīng)時(shí)間預(yù)設(shè)定為20 s，基礎(chǔ)閾值預(yù)設(shè)范圍：18～22 s。

2.5 醋酸扭體實(shí)驗(yàn)檢測(cè)疼痛情況

普瑞巴林組于實(shí)驗(yàn)前0.5 h灌胃給予60 mg/kg普瑞巴林，ED低、中、高劑量組（7.5、15、30 mg/kg）于實(shí)驗(yàn)前1 h灌胃給予相應(yīng)濃度ED，空白組和模型組給予等體積生理鹽水。動(dòng)物均按照10 mL/kg腹腔注射0.6%醋酸溶液，記錄小鼠20 min內(nèi)的扭體次數(shù)。

2.6 ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-6和CD18的含量

嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)各組小鼠L4-L5節(jié)段脊髓組織中TNF-α、IL-6和CD18的含量。使用FULL-自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各組樣本的吸光度值，計(jì)算TNF-α、IL-6和CD18的相對(duì)含量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.7 Western blot檢測(cè)STAT3、VEGFA、ERK1/2蛋白表達(dá)水平

提取各組小鼠L4～L5脊髓組織，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗（STAT3，1∶800；VEGFA，1∶300；p-ERK1/2，1∶500；ERK1/2，1∶500；GAPDH，1∶1 000）過(guò)夜，PBS洗滌3次，室溫孵育二抗（1∶5 000），PBS洗滌3次后顯影、凝膠成像儀成像，最后用Image J軟件分析結(jié)果。

2.8 免疫熒光法檢測(cè)STAT3、VEGF、p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平

取出脊髓組織進(jìn)行病理切片，PBS漂洗，封閉，與特異性一抗（STAT3、VEGF、p-ERK1/2、IBA-1），4 ℃孵育過(guò)夜。PBS漂洗后，室溫孵育熒光二抗2 h。熒光顯微鏡下觀(guān)察標(biāo)志物在組織中的表達(dá)和定位。采用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率和積分吸光度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以“ｘ±s”表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）評(píng)估不同處理組之間是否存在顯著差異，進(jìn)一步使用多重比較法（Tukey's HSD test）明確各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ED對(duì)各組機(jī)械痛敏及熱輻射痛敏閾值的影響

與空白組相比，模型組機(jī)械痛敏和熱輻射痛敏閾值明顯降低（P<0.05）；與模型組相比，ED低、中、高劑量組及普瑞巴林組機(jī)械痛敏和熱輻射痛敏閾值明顯上升（P<0.05）；與ED高劑量組比較，低、中劑量組機(jī)械痛敏和熱輻射痛敏閾值明顯降低（P<0.05）；與ED中劑量組比較，低劑量組機(jī)械痛敏和熱輻射痛敏閾值明顯降低（P<0.05），普瑞巴林組機(jī)械痛敏和熱輻射痛敏閾值明顯增加（P<0.05）。詳見(jiàn)表1。

3.2 ED對(duì)各組疼痛所致小鼠疼痛扭體次數(shù)的影響

與空白組相比，模型組小鼠的扭體次數(shù)顯著增加（P<0.05）。與模型組相比，ED低、中、高劑量組及普瑞巴林組扭體次數(shù)減少（P<0.05）；與ED高劑量組比較，低、中劑量組及普瑞巴林組扭體次數(shù)增加（P<0.05）；與ED中劑量組比較，低劑量組及普瑞巴林組扭體次數(shù)增加（P<0.05）；與普瑞巴林組相比，ED高劑量組扭體次數(shù)無(wú)明顯差異（P>0.05）。詳見(jiàn)圖1。

3.3 ED對(duì)各組脊髓背角炎癥因子表達(dá)水平的影響

與空白組相比，模型組脊髓組織中炎癥因子（TNF-α、IL-6和CD18）水平顯著增加（P<0.05）；與模型組相比，ED低、中、高劑量組及普瑞巴林組小鼠病變脊髓組織中炎癥因子（TNF-α、IL-6和CD18）水平顯著降低（P<0.05）；與普瑞巴林組相比，ED低、中劑量組炎癥因子水平明顯上升（P<0.05）；與ED高劑量組比較，ED低、中劑量組炎癥因子水平明顯上升（P<0.05）；與ED中劑量組比較，ED高劑量組炎癥因子水平明顯降低（P<0.05）。詳見(jiàn)表2。

3.4 ED對(duì)各組脊髓背角組織STAT3表達(dá)水平的影響

與空白組比較，模型組小鼠脊髓背角組織中的STAT3表達(dá)量及IBA-1與STAT3共同標(biāo)定的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.05）。與模型組比，ED中、高劑量組以及普瑞巴林組STAT3表達(dá)量及IBA-1與STAT3共同標(biāo)定的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著降低（P<0.05）；與普瑞巴林組比，ED低、中劑量組STAT3表達(dá)量及IBA-1與STAT3共同標(biāo)定的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.05）；與ED高劑量組比，ED低、中劑量組STAT3表達(dá)量及IBA-1與STAT3共同標(biāo)定的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.05）。詳見(jiàn)圖2。

3.5 ED對(duì)各組脊髓背角組織VEGFA表達(dá)水平的影響

與空白組比較，模型組小鼠脊髓背角組織中的VEGFA表達(dá)量及IBA-1與VEGFA共同標(biāo)定的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.05）。與模型組比，ED中、高劑量組以及普瑞巴林組VEGFA表達(dá)量及IBA-1與VEGFA共同標(biāo)定的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著降低（P<0.05）；與普瑞巴林組比，ED低、中劑量組VEGFA表達(dá)量及IBA-1與VEGFA共同標(biāo)定的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.05）；與ED高劑量組比，ED低、中劑量組VEGFA表達(dá)量及IBA-1與VEGFA共同標(biāo)定的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.05）。詳見(jiàn)圖3。

3.6 ED對(duì)各組脊髓背角組織p-ERK表達(dá)水平的影響

各組間ERK蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著性差異（P>0.05）。與空白組比較，模型組小鼠脊髓背角組織中的p-ERK表達(dá)量及IBA-1與p-ERK共同標(biāo)定的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.05）。與模型組比，ED中、高劑量組以及普瑞巴林組p-ERK表達(dá)量及IBA-1與p-ERK共同標(biāo)定的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著降低（P<0.05）；與普瑞巴林組比，ED低、中劑量組p-ERK表達(dá)量及IBA-1與p-ERK共同標(biāo)定的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.05）；與ED高劑量組比，ED低、中劑量組p-ERK表達(dá)量及IBA-1與p-ERK共同標(biāo)定的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.05）。詳見(jiàn)圖4。

4 討論

慢性神經(jīng)性疼痛，常由DRG壓迫引發(fā)，是臨床上最常見(jiàn)且治療難度較高的癥狀之一。盡管科學(xué)家和臨床醫(yī)生已經(jīng)探索了眾多治療靶點(diǎn)和方法，但臨床治療效果仍有限。據(jù)研究報(bào)道，約11.9%的人口遭受著難以控制的神經(jīng)性疼痛[18]。這種慢性疼痛不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，還導(dǎo)致了醫(yī)療保健成本的增加和生產(chǎn)力的損失[19]。在保守治療失敗后，藥物治療成為選擇，但往往受限，尤其是阿片類(lèi)藥物的使用，其成癮性成為一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題[20]。CCD小鼠模型是研究慢性疼痛的重要?jiǎng)游锬Ｐ停梢阅M人類(lèi)慢性疼痛的病理生理過(guò)程[3]。CCD模型不僅有助于揭示疼痛信號(hào)在神經(jīng)系統(tǒng)中的傳遞、處理和調(diào)控機(jī)制，還可以探究神經(jīng)可塑性、神經(jīng)炎癥和神經(jīng)再生等與慢性疼痛密切相關(guān)的領(lǐng)域[4]。此外，CCD模型在藥物研發(fā)領(lǐng)域具有極高的應(yīng)用價(jià)值，它可以用來(lái)評(píng)估不同藥物對(duì)慢性疼痛的治療效果，探討藥物的作用機(jī)制，并研究藥物的毒副作用、耐受性及聯(lián)合用藥等問(wèn)題。CCD模型還能用于研究慢性疼痛對(duì)動(dòng)物行為的影響，通過(guò)觀(guān)察小鼠在慢性疼痛狀態(tài)下的行為變化，可以更好地理解慢性疼痛對(duì)患者情緒、認(rèn)知功能和社交行為的影響，從而為患者提供有效的心理干預(yù)。通過(guò)對(duì)CCD小鼠模型進(jìn)行基因編輯，可以揭示特定基因在疼痛感知和傳遞中的作用，為慢性疼痛的遺傳基礎(chǔ)研究和基因治療提供理論基礎(chǔ)[4]。總之，CCD小鼠疼痛模型在慢性疼痛研究領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，通過(guò)對(duì)該模型的研究可以深入了解慢性疼痛的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制，為藥物研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為臨床治療提供新的思路。

ED作為一種天然的苯醌類(lèi)化合物，存在于多種中草藥中，為中藥大黃和虎杖的主要成分。研究表明[14-15]，ED表現(xiàn)出多方面的藥理活性，ED可能通過(guò)影響神經(jīng)遞質(zhì)釋放或其他疼痛信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮一定的鎮(zhèn)痛效果；在神經(jīng)病理性疼痛的研究中，ED可通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF/ERK信號(hào)通路影響痛覺(jué)傳遞，這表明它可能對(duì)疼痛有一定的調(diào)控作用。此外，ED對(duì)多種炎癥反應(yīng)有抑制作用，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥因子的表達(dá)來(lái)減輕炎癥及疼痛癥狀[21-22]。

在探討ED的鎮(zhèn)痛作用中，STAT3、VEGFA和p-ERK三個(gè)蛋白在信號(hào)傳導(dǎo)通路中的相互作用至關(guān)重要，它們參與調(diào)控神經(jīng)生長(zhǎng)、炎癥反應(yīng)以及組織修復(fù)過(guò)程，與疼痛的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。STAT3作為上游的轉(zhuǎn)錄因子，在多種病理?xiàng)l件下被激活，其激活可以促進(jìn)包括VEGFA在內(nèi)的多種基因的表達(dá)，促進(jìn)傷害感受神經(jīng)元的功能改變，從而加劇疼痛感[5-6]。VEGFA的上調(diào)不僅促進(jìn)血管生成，還可能通過(guò)其受體作用于神經(jīng)元，增強(qiáng)神經(jīng)興奮性，從而在神經(jīng)病理性疼痛中起到作用[8-10]。而p-ERK作為MAPK信號(hào)通路的關(guān)鍵成員，其激活狀態(tài)影響著細(xì)胞的多種生物學(xué)功能，包括痛覺(jué)信號(hào)的傳導(dǎo)；同時(shí)，ERK也與VEGFA和STAT3信號(hào)傳導(dǎo)互作，共同介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和疼痛感知的持續(xù)和放大[3，11-13]。STAT3的激活可以導(dǎo)致VEGFA的表達(dá)增加，VEGFA通過(guò)其受體影響神經(jīng)元功能，可能進(jìn)一步激活或增強(qiáng)p-ERK的信號(hào)傳導(dǎo)。p-ERK的激活又可以反饋調(diào)節(jié)STAT3的活性，形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[3，11-13]。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，ED可能通過(guò)抑制STAT3的磷酸化和活化，減少VEGFA的表達(dá)，進(jìn)而阻斷p-ERK的激活，從而在多個(gè)層面上減輕疼痛信號(hào)的傳導(dǎo)和放大，實(shí)現(xiàn)其鎮(zhèn)痛效果。因此，深入研究這3個(gè)蛋白之間的相互作用及其在疼痛信號(hào)通路中的具體作用機(jī)制，對(duì)于闡明ED的鎮(zhèn)痛作用具有重要意義。

本研究結(jié)果表明，ED對(duì)CCD小鼠模型的機(jī)械痛敏、熱輻射痛敏在最佳藥效點(diǎn)閾值較模型組顯著降低；通過(guò)小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)ED對(duì)CCD小鼠的鎮(zhèn)痛作用，且與普瑞巴林（陽(yáng)性對(duì)照藥物）的效果相當(dāng)，證實(shí)了ED作為一種潛在的鎮(zhèn)痛劑的可行性。CD18是黏附分子成員β2整合素中的一種，主要分布于單核-巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等，在白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附中起重要作用，參與炎癥的發(fā)生[23]。IL-6和TNF-α是參與炎癥反應(yīng)的炎性介質(zhì)，在疼痛的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到重要作用[24]。本研究表明，ED可降低CCD小鼠模型中脊髓背角組織IL-6、TNF-α和CD18的含量，提示ED發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用可能與抑制細(xì)胞釋放炎癥因子有關(guān)。CCD小鼠疼痛模型誘導(dǎo)疼痛的產(chǎn)生與主要誘導(dǎo)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化、STAT3激活、炎癥因子表達(dá)等相關(guān)[3-4]。脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)炎癥誘導(dǎo)的疼痛發(fā)生中起關(guān)鍵作用，本研究通過(guò)標(biāo)記IBA-1對(duì)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了研究。在分子層面，我們觀(guān)察到CCD模型中STAT3、VEGFA和p-ERK的表達(dá)水平顯著上調(diào)，這與文獻(xiàn)[3，4]中關(guān)于這些分子在神經(jīng)病理性疼痛中的作用相一致。本研究證實(shí)ED可抑制STAT3、VEGFA、p-ERK在小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)、同時(shí)抑制脊髓炎癥因子水平，提示ED抑制神經(jīng)炎癥誘導(dǎo)的疼痛可能與小膠質(zhì)細(xì)胞STAT3、VEGFA、p-ERK等信號(hào)調(diào)控有關(guān)。

綜上，本研究表明，ED具有良好的鎮(zhèn)痛作用，可降低CCD小鼠模型中脊髓背角組織中與疼痛發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的炎癥因子IL-6、TNF-α和CD18表達(dá)，其鎮(zhèn)痛機(jī)制與抑制STAT3、VEGFA、p-ERK介導(dǎo)的脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化相關(guān)。

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本文引用： 曾錦明， 范成龍， 鄧 姣， 屈戰(zhàn)利， 李 剛. 大黃素抑制背根神經(jīng)節(jié)壓迫小鼠模型STAT3、VEGFA、p-ERK蛋白表達(dá)及其鎮(zhèn)痛作用研究[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2024， 44（9）： 1583-1591.

〔收稿日期〕2024-02-07

〔基金項(xiàng)目〕四川省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2022NSFSC0756）。

〔通信作者〕*李 剛，男，碩士，碩士研究生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，E-mail：ligang39074@126.com。