基于JNK通路探討補(bǔ)腎活血方對(duì)大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的影響

〔摘要〕 目的 探討補(bǔ)腎活血方（Bushen Huoxue Formula， BSHXF）通過c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）信號(hào)通路對(duì)大鼠骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis， OA）軟骨細(xì)胞凋亡的影響。方法 采用白細(xì)胞介素-1β （interleukin-1β， IL-1β）誘導(dǎo)體外分離培養(yǎng)的大鼠軟骨細(xì)胞構(gòu)建體外OA模型，并使用不同濃度的BSHXF干預(yù)處理。使用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力；CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞凋亡情況；Western bolt檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白裂解的胱天蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma 2， Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein， Bax）水平和JNK、磷酸化c-Jun 氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase， p-JNK）蛋白水平。試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中活性氧（reactive oxygen species， ROS）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）、谷胱甘肽（Glutathione， GSH）水平；ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中促炎因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6， IL-6）含量。結(jié)果 （1）與對(duì)照組相比，模型組軟骨細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.01）；模型組Cleaved Caspase-3、Bax、p-JNK蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。與模型組相比，BSHXF治療組軟骨細(xì)胞活力升高（P<0.05），凋亡率顯著降低（P<0.01）；BSHXF治療組Cleaved Caspase-3、Bax、p-JNK蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高（P<0.01）。（2）與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞中ROS和MDA的相對(duì)含量顯著升高（P<0.01），GSH的相對(duì)含量顯著降低（P<0.01）；模型組細(xì)胞中TNF-α和IL-6的含量均顯著升高（P<0.01）。與模型組相比，BSHXF治療組細(xì)胞中ROS和MDA的相對(duì)含量顯著降低（P<0.01），GSH的相對(duì)含量顯著升高（P<0.01）；BSHXF治療組細(xì)胞中TNF-α和IL-6的含量均顯著降低（P<0.01）。（3）與溶劑對(duì)照組相比，激活劑對(duì)照組的p-JNK、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平顯著上調(diào)（P<0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），細(xì)胞增殖能力下降（P<0.05），細(xì)胞凋亡率顯著增加（P<0.01）；BSHXF治療組和溶劑對(duì)照組兩組間細(xì)胞增殖、凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)（Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2）情況差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（4）與溶劑對(duì)照組相比，激活劑對(duì)照組的ROS和MDA水平顯著升高（P<0.01），而GSH水平顯著降低（P<0.01），TNF-α、IL-6含量升高（P<0.05）；BSHXF治療組和溶劑對(duì)照組兩組間ROS相對(duì)含量、MDA、GSH水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 BSHXF通過抑制JNK信號(hào)通路激活抑制IL-1β誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞凋亡，改善氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。

〔關(guān)鍵詞〕 骨關(guān)節(jié)炎；補(bǔ)腎活血方；JNK信號(hào)通路；軟骨細(xì)胞凋亡；氧化應(yīng)激；炎癥反應(yīng)

〔中圖分類號(hào)〕R274.9 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.09.004

Effects of Bushen Huoxue Formula on chondrocyte apoptosis in rats with osteoarthritis based on JNK pathway

YANG Jun， PENG Litian， MAO Tao， PENG Wen*

The Second Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects of Bushen Huoxue Formula （BSHXF） on chondrocyte apoptosis in rats with osteoarthritis （OA） through the c-Jun N-terminal kinase （JNK） signaling pathway. Methods An in vitro OA model was constructed using interleukin-1β （IL-1β） to induce apoptosis in rat chondrocytes cultured ex vivo. Different concentrations of BSHXF were used for intervention. Cell viability was determined using MTT assay; CCK-8 assay was used to examine cell proliferation ability; flow cytometry was employed to assess cell apoptosis; Western blot was used to check the levels of apoptosis-related proteins， including cleaved cysteine protease-3 （Cleaved Caspase-3）， B-cell lymphoma 2 （Bcl-2）， and Bcl-2 associated X protein （Bax）， as well as the levels of JNK and phosphorylated c-Jun N-terminal kinase （p-JNK） proteins. The reagent kit was used to measure the levels of reactive oxygen species （ROS）， malondialdehyde （MDA）， and glutathione （GSH） in cells; ELISA was used to check the content of pro-inflammatory factor of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and IL-6 in the cell supernatant. Results （1） Compared with the control group， the model group showed a significant decrease in chondrocyte viability and a significant increase in cell apoptosis rate （P<0.01）; the protein expression levels of Cleaved Caspase-3， Bax， and p-JNK in the model group significantly increased （P<0.01）， while the expression of Bcl-2 significantly decreased （P<0.01）. Compared with the model group， the BSHXF treatment group showed an increase in chondrocyte viability （P<0.05） and a significant decrease in apoptosis rate （P<0.01）; the protein expression levels of Cleaved Caspase-3， Bax， and p-JNK were significantly reduced （P<0.01） and the protein expression level of Bcl-2 increased （P<0.01） in the BSHXF treatment group. （2） Compared with the control group， the relative content of ROS and MDA in the model group cells significantly increased （P<0.01）， while the relative content of GSH significantly decreased （P<0.01）; the content of TNF-α and IL-6 in the model group cells significantly increased （P<0.01）. Compared with the model group， the BSHXF treatment group showed a significant decrease in the relative content of ROS and MDA （P<0.01） and a significant increase in the relative content of GSH （P<0.01）; the content of TNF-α and IL-6 in cells treated with BSHXF was significantly reduced （P<0.01）. （3） Compared with the solvent control group， the activator control group showed a significant upregulation of p-JNK， Cleaved Caspase-3， and Bax protein levels （P<0.05）， a significant reduction in Bcl-2 protein expression （P<0.01）， a decrease in cell proliferation ability （P<0.05）， and a significant increase in cell apoptosis rate （P<0.01）; there were no significant differences in cell proliferation， apoptosis rate， and expressions of apoptosis-related proteins （Cleaved Caspase-3， Bax， and Bcl-2） between the BSHXF treatment group and the solvent control group （P>0.05）. （4） Compared with the solvent control group， the activator control group exhibited a significant increase in ROS and MDA levels （P<0.01） and a significant decrease in GSH level （P<0.01）， with increased content of TNF-α and IL-6 （P<0.05）; there were no significant differences in the relative content of ROS and the levels of MDA and GSH between the BSHXF treatment group and the solvent control group （P>0.05）. Conclusion BSHXF inhibits IL-1β-induced apoptosis in OA chondrocytes by suppressing the activation of JNK signaling pathway， thereby relieving oxidative stress and inflammatory responses.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 osteoarthritis; Bushen Huoxue Formula; JNK signaling pathway; chondrocyte apoptosis; oxidative stress; inflammatory response

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解、關(guān)節(jié)軟骨退行性破壞、骨贅形成和關(guān)節(jié)疼痛為主要特征的慢性關(guān)節(jié)疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-2]。該病主要發(fā)生在膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)、脊柱和遠(yuǎn)側(cè)指間關(guān)節(jié)等承受較大負(fù)重的關(guān)節(jié)，常見于中老年人群[3]。盡管對(duì)OA的治療已有一定進(jìn)展，但有效延緩或逆轉(zhuǎn)其病程仍是當(dāng)前臨床研究的重點(diǎn)[4-5]。補(bǔ)腎活血方（Bushen Huoxue Formula，BSHXF）是一種傳統(tǒng)中藥復(fù)方，由多種中草藥組成，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、活血止痛等功效，歷史上用于治療腎虛血瘀導(dǎo)致的病癥，包括中醫(yī)學(xué)中的“膝痛”“骨痹”[6]。然而，BSHXF對(duì)OA的具體作用機(jī)制尚待明確。已有研究表明，c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）信號(hào)通路在細(xì)胞應(yīng)答，特別是炎癥和細(xì)胞凋亡過程中扮演重要角色[7]。JNK激活導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子釋放增多，加劇關(guān)節(jié)炎癥和軟骨破壞[8]。同時(shí)，氧化應(yīng)激激活JNK通路，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，損害關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞[9]。此外，JNK通路的激活促進(jìn)細(xì)胞凋亡信號(hào)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞過度凋亡，是OA進(jìn)展的一個(gè)重要機(jī)制[10-11]。因此，針對(duì)這些相關(guān)信號(hào)通路的藥理學(xué)調(diào)節(jié)可能是治療OA的一個(gè)潛在策略。本研究旨在探索BSHXF對(duì)OA的治療作用及其潛在的分子機(jī)制，為OA治療提供新策略和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar 3天齡大鼠40只，體質(zhì)量（10±3） g，均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物資格證書編號(hào)：SCXK（京）2021-0011；室溫 24～26 ℃，濕度65%～70%，光照時(shí)間 12 h/d，提供水和營(yíng)養(yǎng)均衡的飲食。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批準(zhǔn)號(hào)：LL2022111702。

1.2 主要試劑及儀器

二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）（批號(hào)：ST038）、CCK-8試劑盒（批號(hào)：C0037）、細(xì)胞凋亡試劑盒（批號(hào)：C1052）、放射免疫沉淀法裂解緩沖液（radio immunoprecipitation assay lysis buffer， RIPA）裂解液（批號(hào)：P0013B）、脫脂奶粉（批號(hào)：P0216）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid， BCA）蛋白定量試劑盒（批號(hào)：P0010）、GSH檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：S0053）、活性氧（reactive oxygen species， ROS）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：S0033S）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：S0131S）、TNF-α ELISA試劑盒（批號(hào)：PT516）、IL-6 ELISA試劑盒（批號(hào)：PI328）均購(gòu)自北京碧云天生物技術(shù)有限公司；Ⅱ型膠原酶（批號(hào)：C8150）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；凋亡相關(guān)蛋白裂解的胱天蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）（批號(hào)：ab214430）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma 2， Bcl-2）（批號(hào)：ab196495）、Bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì)（Bcl-2-associated X protein，Bax）（批號(hào)：ab182733）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）（批號(hào)：ab181602）、Goat Anti-Rabbit IgG H&L（HRP）（批號(hào)：ab6721）、MTT（批號(hào)：ab211091）、重組大鼠白細(xì)胞介素-1β蛋白因子（批號(hào)：ab281807）、茴香霉素（批號(hào)：ab120495）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）和磷酸化JNK（phosphorylation-JNK， p-JNK）抗體（批號(hào)：#9252）購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；TRIzol試劑盒（批號(hào)：A33254）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：4366597）、熒光定量試劑盒（批號(hào)：4349180）均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

LSM710型激光共聚焦顯微鏡（美國(guó)卡爾蔡司光學(xué)儀器有限公司）；Bio-Rad 680型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；MoFloAstrios EQ型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

使用新生鼠（3日齡），以戊巴比妥鈉（1%溶液，40 mg·kg-1）進(jìn)行腹腔麻醉，經(jīng)頸椎脫臼處死后，浸入75%乙醇消毒5 min。取胸廓組織，切碎后在0.2%Ⅱ型膠原酶溶液中37 ℃消化1.5 h。離心（1 000 r/min，10 min，37 ℃）后，再加入0.05%Ⅱ型膠原酶于37 ℃消化3 h。再次離心（1 000 r/min，10 min，37 ℃），用PBS洗滌大鼠軟骨細(xì)胞沉淀，并在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)[12]。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與處理

取傳至第2代的大鼠軟骨細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)的密度接種在24孔板中，每孔1 mL。培養(yǎng)24 h后隨機(jī)分為對(duì)照組：細(xì)胞在10%胎牛血清DMEM中正常培養(yǎng)；模型組（OA組）：使用10 ng·mL-1的IL-1β處理正常軟骨細(xì)胞24 h，建立OA模型；治療組（OA+BSHXF組）：使用10 ng·mL-1的IL-1β處理細(xì)胞24 h后，加入不同劑量（50、100、150、200、250 μg·mL-1）的BSHXF處理24 h；溶劑對(duì)照組（OA+BSHXF+DMSO組）；OA+BSHXF+Anisomycin組（激活劑對(duì)照組）：使用10 ng·mL-1的IL-1β處理細(xì)胞24 h后，加入200 μg·mL-1的BSHXF和5 μmol·L-1的JNK信號(hào)通路激活劑Anisomycin處理24 h[13]。每組細(xì)胞均在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.5 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活力

使用MTT法測(cè)定各組細(xì)胞的活力[14]。將細(xì)胞以每孔3×103個(gè)的密度接種在96孔板中，每孔添加100 μL培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，按照“1.3”分組處理細(xì)胞。處理24 h后，每孔加入10 μL的MTT溶液（5 mg·mL-1），并在37 ℃、5% CO2的條件下繼續(xù)孵育4 h。然后棄去上清液，并加入DMSO溶解結(jié)晶物。使用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以反映細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇表現(xiàn)出最高細(xì)胞活力的BSHXF濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 CCK-8法檢測(cè)各組大鼠軟骨細(xì)胞增殖情況

取傳至第2代的大鼠軟骨細(xì)胞，將細(xì)胞以1×103個(gè)/孔的密度接種在96孔板中，每孔100 μL。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h后，按照“1.3”中方法分組處理48 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育2 h，使用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.7 試劑盒檢測(cè)各組氧化應(yīng)激指標(biāo)水平

采用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species， ROS）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）、谷胱甘肽（glutathione， GSH）的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，所有操作及各試劑的配制均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況

取傳至第2代的大鼠軟骨細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)的密度接種在24孔板中，每孔1 mL。培養(yǎng)24 h后，按照“1.3項(xiàng)”中方法分組處理48 h，收集各組細(xì)胞沉淀，以PBS洗滌后計(jì)數(shù)；每組取2×105個(gè)細(xì)胞，采用ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行ANNEXIN V-FITC/PI雙染，然后采用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率[12]。

1.9 ELISA試劑盒檢測(cè)各組炎癥因子水平

收集各組干預(yù)后的細(xì)胞培養(yǎng)液，離心（3 000 r/min，20 min，4 ℃）后收集上清液，按照ELISA試劑盒說明檢測(cè)細(xì)胞上清中炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)水平，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm時(shí)的吸光值，進(jìn)行后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析[16]。

1.10 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白表達(dá)水平

取出“1.6項(xiàng)”中存于-80 ℃的大鼠軟骨細(xì)胞樣品液，于冰水浴中解凍。隨后將樣品進(jìn)行煮沸變性處理。每組取30 μg總蛋白的樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳完成后，樣品通過濕轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到膜上。使用5%脫脂奶粉對(duì)膜進(jìn)行1.5 h的封閉處理。加入一抗，包括Cleaved Caspase-3（稀釋比1∶5 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、JNK和p-JNK（1∶1 000），并在4 ℃下過夜孵育。次日，使用TBST洗滌膜以去除未結(jié)合的一抗。加入二抗：Goat Anti-Rabbit IgG H&L（HRP）（1∶2 000），在室溫下孵育1.5 h。再次洗滌膜后，使用ECL顯色劑進(jìn)行顯色，并在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下進(jìn)行蛋白條帶檢測(cè)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程重復(fù)3次[12]。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以“ｘ±s”表示。多個(gè)樣本均采用單因素方差分析，組間數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)方法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BSHXF對(duì)各組OA軟骨細(xì)胞凋亡的影響

50、100、150、200、250 μg·mL-1的BSHXF對(duì)正常軟骨細(xì)胞活力無影響（P>0.05，圖1A），各濃度的BSHXF均可提高IL-1β誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞活力，且呈劑量依賴性（均P<0.05，圖1A）。200 μg·mL-1組細(xì)胞活力最高，250 μg·mL-1組細(xì)胞活力有所下降（P>0.05，圖1A）?？赡苁怯捎谶^高濃度的BSHXF產(chǎn)生了輕微的細(xì)胞毒性。因而選擇200 μg·mL-1的BSHXF進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組軟骨細(xì)胞活力顯著降低、細(xì)胞凋亡率顯著升高（均P<0.01，圖1B—C）。與模型組相比，治療組軟骨細(xì)胞活力升高、凋亡率顯著降低（均P<0.01，圖1B—C）。與空白組相比，OA組Cleaved

Caspase-3、Bax的表達(dá)顯著升高，Bcl-2的表達(dá)顯著降低（均P<0.01，圖1D）；與模型組相比，治療組處理顯著降低了Cleaved Caspase-3、Bax的表達(dá)，并增加了Bcl-2的表達(dá)（均P<0.01，圖1D）。這表明BSHXF抑制IL-1β誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞凋亡。

2.2 BSHXF對(duì)各組OA軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎癥因子水平的影響

與空白組相比，模型組細(xì)胞中ROS和MDA的相對(duì)含量顯著升高（P<0.01），GSH的相對(duì)含量顯著降低（P<0.01，圖2A）；相較于模型組，治療組細(xì)胞中ROS和MDA的相對(duì)含量顯著降低（P<0.01），GSH的相對(duì)含量顯著升高（P<0.01，圖2A）。ELISA結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組細(xì)胞中TNF-α和IL-6的含量均顯著升高（均P<0.01，圖2B）；相較于模型組，治療組細(xì)胞中TNF-α和IL-6的含量均顯著降低（均P<0.01，圖2B）。這表明，BSHXF能改善IL-1β誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。

2.3 BSHXF對(duì)各組OA軟骨細(xì)胞JNK、p-JNK蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，3組細(xì)胞間JNK蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而與空白組相比，模型組細(xì)胞中p-JNK蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01）；相較于模型組，治療組細(xì)胞中p-JNK蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01）。這表明BSHXF抑制JNK信號(hào)通路激活。詳見圖3。

2.4 JNK信號(hào)通路激活后BSHXF對(duì)各組 OA軟骨細(xì)胞凋亡蛋白的影響

在IL-1β誘導(dǎo)細(xì)胞中同時(shí)加入BSHXF和JNK信號(hào)通路激活劑Anisomycin處理24 h。Western bolt結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組相比，激活劑對(duì)照組的p-JNK蛋白水平顯著上調(diào)（P<0.05，圖4A），這表明成功激活了JNK信號(hào)通路。隨后，通過CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)和Western bolt檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，OA+BSHXF和OA+BSHXF+DMSO兩組間細(xì)胞增殖、凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)（Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2）情況差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖4B-D）。而與溶劑對(duì)照組相比，激活劑對(duì)照組細(xì)胞增殖能力顯著下降（均P<0.05，圖4B），細(xì)胞凋亡率顯著增加（P<0.01，圖4C），Cleaved Caspase-3、Bax水平顯著升高，Bcl-2水平顯著降低（均P<0.01，圖4D）。這表明激活JNK信號(hào)通路部分逆轉(zhuǎn)BSHXF對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞凋亡的抑制作用。

2.5 激活JNK信號(hào)通路后BSHXF對(duì)各組OA軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響

OA+BSHXF和OA+BSHXF+DMSO兩組間ROS相對(duì)含量、MDA、GSH水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05，圖5A-B）。而與溶劑對(duì)照組相比，激活劑對(duì)照組的ROS和MDA水平顯著升高，而GSH水平顯著降低，TNF-α、IL-6含量顯著升高（均P<0.05，圖5A—B）。這表明激活JNK信號(hào)通路部分逆轉(zhuǎn)BSHXF對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的改善作用。

3 討論

BSHXF是一種源自傳統(tǒng)中醫(yī)理論的中藥復(fù)方，傳統(tǒng)上用于治療多種疾病。根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論，它可能對(duì)OA等疾病具有治療潛力[1，5]。在OA的病理機(jī)制中，細(xì)胞凋亡起著關(guān)鍵作用[17]。Caspase-3作為細(xì)胞凋亡過程中的主要執(zhí)行酶，通常以非活化的前體形式存在。細(xì)胞在接收到凋亡信號(hào)后，會(huì)將Caspase-3裂解成活化形式，進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞死亡。Cleaved

Caspase-3的表達(dá)增加通常與OA中軟骨細(xì)胞的損傷和凋亡相關(guān)[18]。細(xì)胞凋亡的另一關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素是Bcl-2和Bax蛋白。其中，Bcl-2通過阻止細(xì)胞色素C的釋放和Caspase的激活來防止細(xì)胞凋亡，而Bax通過促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放和Caspase酶激活推動(dòng)細(xì)胞凋亡。在OA中，上調(diào)Bcl-2或下調(diào)Bax的表達(dá)可能有助于保護(hù)軟骨細(xì)胞，減少軟骨細(xì)胞的凋亡，延緩疾病的發(fā)展[19-20]。JNK在調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，尤其是細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[21]。研究表明，抑制JNK信號(hào)通路的激活有助于減少軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥，減緩OA的進(jìn)展[22-23]。本研究重點(diǎn)關(guān)注了BSHXF對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，以及這些作用是否通過JNK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，為OA治療提供新的策略。

本研究結(jié)果表明，BSHXF對(duì)正常軟骨細(xì)胞無明顯毒害作用，且可顯著提高IL-1β誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞活力。特別是在200 μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞活力達(dá)到最高。然而，250 μg·mL-1濃度的BSHXF導(dǎo)致細(xì)胞活力降低，這可能是由于較高濃度的BSHXF產(chǎn)生輕微的細(xì)胞毒性，也可能是由于中藥復(fù)方通常包含多種成分，這些成分可能在較高濃度下相互作用產(chǎn)生未預(yù)期的效果[24]。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，BSHXF顯著提高了OA軟骨細(xì)胞的活力，同時(shí)降低了凋亡率和Cleaved Caspase-3、Bax的表達(dá)，增加了Bcl-2的表達(dá)。提示BSHXF通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞的存活和增殖，這與他人研究結(jié)果相似。在氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)方面，研究發(fā)現(xiàn)BSHXF顯著降低了模型組細(xì)胞中的ROS和MDA水平，同時(shí)提高了GSH水平，這與王柯等[25]的研究結(jié)果相似。此外，BSHXF還顯著降低了促炎因子TNF-α、IL-6的含量，這表明BSHXF可能通過降低氧化應(yīng)激和抑制炎癥因子的釋放來改善OA癥狀，這與陳宇等[26]的研究結(jié)果相似。研究表明，BSHXF能顯著抑制p-JNK的表達(dá)。當(dāng)使用Anisomycin時(shí)，部分逆轉(zhuǎn)BSHXF對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響，從而進(jìn)一步證實(shí)了JNK信號(hào)通路在BSHXF改善OA軟骨細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的重要作用。

盡管本研究突出了BSHXF在抑制OA軟骨細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)中的潛在作用，但研究存在一些局限性。首先，研究基于體外實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果可能無法完全代表體內(nèi)情況。此外，研究中未能完全揭示BSHXF的全部作用機(jī)制。同時(shí)，BSHXF為復(fù)方中藥，具有多靶點(diǎn)、多途徑等特性。未來研究需進(jìn)一步探索BSHXF的分子靶點(diǎn)和作用機(jī)制，并通過動(dòng)物模型來進(jìn)一步驗(yàn)證本文的研究結(jié)果。綜上所述，BSHXF通過抑制JNK信號(hào)通路的激活進(jìn)而抑制IL-1β誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞凋亡，改善氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，為治療OA提供了新的理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉驍東， 陳 貝， 楊 杰. 膝關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)后輔助關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PRP治療對(duì)OA患者Lysholm膝關(guān)節(jié)評(píng)分、VAS評(píng)分及并發(fā)癥的影響[J]. 分子診斷與治療雜志， 2023， 15（3）： 463-467.

[2] 陳 凡， 周富麗， 陳 勇， 等. 姜黃素可能通過上調(diào)Prdx6蛋白表達(dá)抑制軟骨細(xì)胞鐵死亡[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2023， 58（12）： 2106-2112.

[3] 鄭守超， 石 晶， 王 峰， 等. 關(guān)節(jié)鏡下半月板成形術(shù)治療膝關(guān)節(jié)半月板損傷患者的效果觀察及對(duì)Lysholm評(píng)分、關(guān)節(jié)生理功能的影響[J]. 解放軍醫(yī)藥雜志， 2021， 33（3）： 82-86.

[4] GR？魧SSEL S， MUSCHTER D. Recent advances in the treatment of osteoarthritis[J]. F1000Research， 2020， 9： F1000 Faculty Rev-325.

[5] MAQBOOL M， FEKADU G， JIANG X C， et al. An up to date on clinical prospects and management of osteoarthritis[J]. Annals of Medicine and Surgery （2012）， 2021， 72： 103077.

[6] 陳浩明， 葉阮炷， 李富東， 等. 補(bǔ)腎活血法聯(lián)合溫針灸治療膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床療效觀察[J]. 按摩與康復(fù)醫(yī)學(xué)， 2021， 12（22）： 45-47.

[7] CHEN J， YE C， WAN C， et al. The roles of c-Jun N-terminal kinase （JNK） in infectious diseases[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2021， 22（17）： 9640.

[8] LAI B， WU C H， LAI J H. Activation of c-Jun N-terminal kinase， a potential therapeutic target in autoimmune arthritis[J]. Cells， 2020， 9（11）： 2466.

[9] ZHANG Y B， ZHOU S Q， CAI W S， et al. Hypoxia/reoxygenation activates the JNK pathway and accelerates synovial senescence[J]. Molecular Medicine Reports， 2020， 22（1）： 265-276.

[10] HWANG H S， KIM H A. Chondrocyte apoptosis in the pathogenesis of osteoarthritis[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2015， 16（113c010bd1856463007cfe2937c73abb27fbbbbfb9391965f1cfe92b18851eb1ba）： 26035-26054.

[11] LIU L， ZHANG W Y， LIU T H， et al. The physiological metabolite α-ketoglutarate ameliorates osteoarthritis by regulating mitophagy and oxidative stress[J]. Redox Biology， 2023， 62： 102663.

[12] 陳 晨， 鄭潤(rùn)泉， 張貴春. 大黃素對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖、凋亡和氧化應(yīng)激的影響[J]. 中國(guó)組織工程研究， 2024， 28（28）： 4528-4534.

[13] ZHOU Y， MING J H， LI Y M， et al. Ligustilide attenuates nitric oxide-induced apoptosis in rat chondrocytes and cartilage degradation via inhibiting JNK and p38 MAPK pathways[J]. Journal of Cellular and Molecular Medicine， 2019， 23（5）： 3357-3368.

[14] 胡 志， 付 橋， 張 煒， 等. 自噬調(diào)控對(duì)小鼠精原細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的影響研究[J]. 重慶醫(yī)學(xué)， 2023， 52（23）： 3527-3532.

[15] 賀自克， 王上增. 杜仲水提物上調(diào)Nur77表達(dá)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化[J]. 中國(guó)組織工程研究， 2023， 27（15）： 2371-2378.

[16] 許 奇， 張洪榕， 許煒民， 等. 基于HMGB1/NF-κB通路探討溫經(jīng)通絡(luò)湯對(duì)IL-1β誘導(dǎo)小鼠原代軟骨細(xì)胞炎癥的影響[J]. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2023， 39（11）： 1095-1101.

[17] XIAO S Q， CHENG M， WANG L， et al. The role of apoptosis in the pathogenesis of osteoarthritis[J]. International Orthopaedics， 2023， 47（8）： 1895-1919.

[18] SHARIF M， WHITEHOUSE A， SHARMAN P， et al. Increased apoptosis in human osteoarthritic cartilage corresponds to reduced cell density and expression of caspase-3[J]. Arthritis and Rheumatism， 2004， 50（2）： 507-515.

[19] KARALIOTAS G I， MAVRIDIS K， SCORILAS A， et al. Quantitative analysis of the mRNA expression levels of BCL2 and BAX genes in human osteoarthritis and normal articular cartilage： An investigation into their differential expression[J]. Molecular Medicine Reports， 2015， 12（3）： 4514-4521.

[20] XIONG W， ZHAO J Z， MA X W， et al. Mechanisms and molecular targets of BuShenHuoXue formula for osteoarthritis[J]. ACS Omega， 2022， 7（5）： 4703-4713.

[21] DHANASEKARAN D N， REDDY E P. JNK signaling in apoptosis[J]. Oncogene， 2008， 27（48）： 6245-6251.

[22] MIN R W M， AUNG F W M， LIU B， et al. Mechanism and therapeutic targets of c-Jun-N-terminal kinases activation in nonalcoholic fatty liver disease[J]. Biomedicines， 2022， 10（8）： 2035.

[23] SAHANA T G， CHASE K J， LIU F L， et al. C-Jun N-terminal kinase promotes stress granule assembly and neurodegeneration in C9orf72-mediated ALS and FTD[J]. The Journal of Neuroscience， 2023， 43（17）： 3186-3197.

[24] LI Y B， DENG X Y， XIONG H L， et al. Deciphering the toxicity-effect relationship and action patterns of traditional Chinese medicines from a smart data perspective： A comprehensive review[J]. Frontiers in Pharmacology， 2023， 14： 1278014.

[25] 王 柯， 葉寒露. 大黃素對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞鐵死亡的影響及機(jī)制研究[J]. 天津醫(yī)藥， 2023， 51（10）： 1090-1097.

[26] 陳 宇， 黃亞麗， 金雪芬. 補(bǔ)腎活血方聯(lián)合雙氯芬酸鈉治療膝骨關(guān)節(jié)炎伴關(guān)節(jié)積液臨床研究[J]. 新中醫(yī)， 2022， 54（12）： 127-131.

本文引用： 楊 軍， 彭力田， 毛 滔， 彭 文. 基于JNK通路探討補(bǔ)腎活血方對(duì)大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的影響[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2024， 44（9）： 1575-1582.

〔收稿日期〕2024-01-14

〔基金項(xiàng)目〕湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目（E2022114）。

〔通信作者〕*彭 文，男，副主任醫(yī)師，E-mail：1965067@qq.com。