實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展

“民以食為天，食以安為先”。近年來(lái)，食品安全事件時(shí)有發(fā)生，泰國(guó)假香米、阿斯巴甜致癌疑云、“鼠頭鴨脖”等事件不斷被曝光，公眾對(duì)食品安全的關(guān)注度日益提高。為了保障食品安全，監(jiān)管部門加強(qiáng)了對(duì)食品檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用。在各種檢測(cè)技術(shù)中，PCR技術(shù)尤其是實(shí)時(shí)熒光定量PCR，因具有更靈敏、更省時(shí)、更特異等優(yōu)點(diǎn)，在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。本文綜述了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理，及其在食品中植物源性成分、轉(zhuǎn)基因成分、過(guò)敏原、動(dòng)物源成分和微生物等檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展，并對(duì)該技術(shù)未來(lái)的發(fā)展方向進(jìn)行了展望，以期該技術(shù)未來(lái)在食品檢測(cè)領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用。

一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)原理

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是1983年美國(guó)科學(xué)家Kary B.Mullis發(fā)明的一種在體外快速擴(kuò)增特定DNA的分子生物學(xué)技術(shù)，其基本原理類似于DNA的天然半保留復(fù)制，反應(yīng)過(guò)程包括“變性、退火、延伸”三個(gè)階段。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的具體過(guò)程如圖1所示，雙鏈DNA在高溫條件下變性解旋為單鏈DNA，然后引物與模板DNA互補(bǔ)區(qū)結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，引物沿著5’→3’的方向合成新的DNA鏈，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA的擴(kuò)增。理論上講，如果PCR反應(yīng)體系中酶與底物充足，即可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，再通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳等方法觀察擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小，進(jìn)而達(dá)到檢測(cè)目的。

圖1：PCR擴(kuò)增過(guò)程示意圖

（①：變性；②：退火；③：延伸）

經(jīng)過(guò)40余年的發(fā)展，PCR檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)非常成熟，在生物、食品、藥品、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。通過(guò)不斷改良或與其他技術(shù)相結(jié)合，已衍生出多種PCR技術(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR即是其中的一種。

二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR概述

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）被稱為第二代PCR，是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的一種核酸定量檢測(cè)技術(shù)，其原理是將熒光標(biāo)記物加入PCR反應(yīng)體系中，隨著PCR反應(yīng)產(chǎn)物的增加，熒光信號(hào)不斷增強(qiáng)，利用檢測(cè)設(shè)備收集熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，最后通過(guò)熒光擴(kuò)增曲線分析擴(kuò)增結(jié)果。根據(jù)加入的熒光標(biāo)記物的不同，該技術(shù)分為熒光染料法和熒光探針?lè)▋煞N。

（一）熒光染料法

qPCR常用的熒光染料是SYBR Green I。在qPCR反應(yīng)體系中加入過(guò)量的熒光染料，一般情況下，熒光染料在游離狀態(tài)下幾乎不發(fā)出熒光信號(hào)，反應(yīng)開(kāi)始后，熒光染料可與雙鏈DNA小溝區(qū)域非特異性結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號(hào)。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，熒光信號(hào)不斷增強(qiáng)，此時(shí)可利用檢測(cè)設(shè)備收集熒光信號(hào)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程（圖2）。

圖2：熒光染料法qPCR原理示意圖

（二）熒光探針?lè)?/p>

qPCR常用的熒光探針為TaqMan，探針的5’端和3’端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)。完整的探針中，報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)會(huì)被淬滅基團(tuán)淬滅，不產(chǎn)生熒光，探針?biāo)夂?，?bào)告基團(tuán)逃離淬滅基團(tuán)的淬滅范圍，發(fā)出熒光信號(hào)。PCR擴(kuò)增時(shí)，引物和探針同時(shí)與模板DNA結(jié)合，當(dāng)延伸到探針與模板結(jié)合位置時(shí)，Taq DNA聚合酶利用5’-3’外切酶活性將探針?biāo)馇懈?，?bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，釋放熒光信號(hào)（圖3）。PCR過(guò)程中，每形成一條DNA雙鏈，就會(huì)釋放一種熒光信號(hào)，信號(hào)強(qiáng)度也相應(yīng)增加，隨著PCR產(chǎn)物的積累，檢測(cè)到的熒光信號(hào)強(qiáng)度也不斷增加。

圖3：熒光探針?lè)╭PCR原理示意圖

三、qPCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用

qPCR與常規(guī)PCR相比，擴(kuò)增片段相對(duì)較短，利用熒光信號(hào)可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程，且不需要PCR后再處理，有效預(yù)防PCR產(chǎn)物潛在的污染，具有特異性好、靈敏度高、快速、交叉污染風(fēng)險(xiǎn)低等優(yōu)點(diǎn)，在食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

（一）植物源性成分檢測(cè)

2023年6月，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管總局發(fā)布補(bǔ)充檢驗(yàn)方法《果汁中植物源性成分的測(cè)定》（BJS 202304），對(duì)果汁、果漿以及果肉飲料等樣品中黑加侖、藍(lán)莓、樹(shù)莓、木瓜、桑葚、椰子、獼猴桃、杏、山楂、蔓越莓、芒果、梨、桃、蘋果等植物源性成分采用qPCR方法進(jìn)行定性檢測(cè)。Elisa等以醇溶蛋白基因?yàn)榘谢颍O(shè)計(jì)了雙重qPCR引物探針，很好地區(qū)分出普通小麥和硬質(zhì)小麥，首次利用分子生物學(xué)方法實(shí)現(xiàn)了面粉中摻雜摻偽的分析。

（二）轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展為解決全球糧食問(wèn)題起到了關(guān)鍵作用，然而轉(zhuǎn)基因食品的安全性一直備受爭(zhēng)議，關(guān)于建立轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)制度，世界各國(guó)仍未達(dá)成共識(shí)。我國(guó)食品安全法第六十九條規(guī)定，生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)轉(zhuǎn)基因食品應(yīng)當(dāng)按照規(guī)定顯著標(biāo)示。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管總局及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)等均發(fā)布了轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，主要針對(duì)的是轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品，如轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、大豆、番茄、油菜及其相應(yīng)的產(chǎn)品等，其中絕大多數(shù)采用的檢測(cè)方法是實(shí)時(shí)熒光定量PCR熒光探針?lè)?。溫洪濤等?duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)耐除草劑MZIＲ098基因的5’端旁側(cè)序列信息進(jìn)行分析并設(shè)計(jì)引物探針，建立了特異性針對(duì)玉米中MZIＲ098轉(zhuǎn)化體的qPCR定量檢測(cè)方法，檢出限達(dá)0.05%。

（三）過(guò)敏原檢測(cè)

海鮮類、豆類、乳制品、果蔬類等多種食品中存在的過(guò)敏成分，會(huì)導(dǎo)致部分易敏體質(zhì)人群產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。原衛(wèi)生部發(fā)布的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》（GB 7718-2011）要求，在食品配料中對(duì)致敏物質(zhì)進(jìn)行推薦性標(biāo)識(shí)。SN/T 1961系列方法提出了利用qPCR法測(cè)定食品中花生、大豆、胡桃、杏仁、麩質(zhì)、蝦蟹等過(guò)敏原的檢測(cè)方法。Madrid等利用qPCR法成功檢測(cè)出100個(gè)樣品中的致敏成分。

（四）動(dòng)物源性成分檢測(cè)

畜肉產(chǎn)品摻雜摻假的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，媒體曾曝光稱，市場(chǎng)上流通的所謂“驢肉”很大一部分是豬肉和馬肉偽裝而成，因此，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物源性成分的快速、準(zhǔn)確鑒定尤為重要。2019年，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)和國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局發(fā)布國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《常見(jiàn)畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》（GB/T 38164-2019），可利用實(shí)時(shí)熒光PCR法，對(duì)肉及加工品、內(nèi)臟、乳、動(dòng)物飼料中黃牛、牦牛、水牛、綿羊、山羊、豬等多種動(dòng)物源性成分進(jìn)行定性檢測(cè)。Li等在檢測(cè)羊肉摻假時(shí)，通過(guò)分析16S rRNA和12S rRNA序列，設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，成功鑒別出綿羊、狗、雞鴨等成分。

（五）微生物檢測(cè)

因qPCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，其在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789系列中，已經(jīng)實(shí)施的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》（GB 4789.35-2023）和剛剛實(shí)施的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 克羅諾桿菌檢驗(yàn)》（GB 4789.40-2024）均增加了PCR方法。大量研究也發(fā)現(xiàn)，qPCR應(yīng)用于食品微生物的檢測(cè)，確實(shí)提高了檢測(cè)效率。Kumar等建立了海鮮中沙門氏菌的qPCR檢測(cè)方法，縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。李丹丹等針對(duì)金黃色葡萄球菌Sa442基因設(shè)計(jì)引物和探針，建立了金黃色葡萄球菌的qPCR檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度達(dá)7.5CFU/mL。

此外，qPCR技術(shù)也是檢測(cè)非洲豬瘟病毒、諾如病毒的重要手段。賈云飛等利用非洲豬瘟病毒P72基因，建立了非洲豬瘟病毒SYBR Green I qPCR檢測(cè)方法?！妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 諾如病毒檢驗(yàn)》（GB 4789.42-2016）中建立了食品中諾如病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了貝類、生食蔬菜、胡蘿卜、瓜、堅(jiān)果等硬質(zhì)表面食品，草莓、西紅柿、葡萄等軟質(zhì)水果等食品中諾如病毒核酸的檢測(cè)。

綜上，食品安全是關(guān)乎人民群眾身體健康的重大問(wèn)題，而食品檢測(cè)是保障食品安全的重要防線。qPCR技術(shù)的發(fā)展為實(shí)現(xiàn)食品的快速、高效、高靈敏度檢測(cè)提供了可能，但也存在一定的局限，如引物設(shè)計(jì)復(fù)雜、難以實(shí)現(xiàn)定量分析、易受污染、容易產(chǎn)生假陽(yáng)性等，因此，進(jìn)一步優(yōu)化引物設(shè)計(jì)、提高引物的特異性、避免不同引物間的相互干擾、避免假陽(yáng)性的出現(xiàn)是未來(lái)研發(fā)的方向。另外，將該技術(shù)與免疫技術(shù)、電化學(xué)技術(shù)、光學(xué)技術(shù)、生物傳感技術(shù)等結(jié)合，進(jìn)而開(kāi)發(fā)出更高靈敏度、更強(qiáng)特異性、更高準(zhǔn)確性、更高通量、更廣適用范圍、更快速度的檢測(cè)技術(shù)，也是未來(lái)食品檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)。