具有莢膜的白色念珠菌轉(zhuǎn)錄組學分析

摘""要：目的：探討具有莢膜的白色念珠菌轉(zhuǎn)錄組學特征。方法：⑴采用feature Counts（1.5.0-p3）獲得基因或轉(zhuǎn)錄本的表達量，通過DESeq2軟件（1.20.0）篩選出具有莢膜的白色念珠菌的差異表達基因（Different Express Gene，DEG），使用“clusterProfiler”R包對差異表達基因進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，并篩選關(guān)鍵基因。⑵RT-PCR驗證白色念珠菌無莢膜菌株與莢膜菌株部分差異表達基因mRNA表達。結(jié)果：C1-1與SC5314相比，差異表達基因達到2 586個，其中顯著上調(diào)的有1 184個，顯著下調(diào)的有1 402個。對差異表達基因進行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，DEGs主要富集在蛋白質(zhì)代謝過程、膜的構(gòu)成和膜的固有成分及結(jié)構(gòu)分子活性和核糖體結(jié)構(gòu)性成分。對差異表達基因進行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，DEGs富集在核糖體、丙酮酸鹽代謝、過氧化物酶體、細胞周期、氨基糖和核苷酸糖代謝等通路。對新轉(zhuǎn)錄本進行GO、KEGG、Pfam等數(shù)據(jù)庫注釋，共預測關(guān)鍵基因113個，其中GO數(shù)據(jù)庫注釋關(guān)鍵基因1個，具有氧化還原酶活性，可能參與莢膜的生物代謝過程；KEGG數(shù)據(jù)庫注釋關(guān)鍵基因3個，參與白色念珠菌的氧代羧酸、檸檬酸鹽循環(huán)、氨基酸等代謝活動。與白色念珠菌無莢膜菌株相比，莢膜菌株Efg1、Thr1 mRNA表達均降低。結(jié)論：白色念珠菌莢膜菌株與無莢膜菌株在基因表達總體水平和相關(guān)代謝通路基因表達水平上存在明顯的差異。

關(guān)鍵詞：白色念珠菌；莢膜；轉(zhuǎn)錄組學；基因

中圖分類號：R379 """文獻標志碼：A """文章編號：1001-5779（2024）08-0795-05

DOI ： 10.3969/j.issn.1001-5779.2024.08.007

Transcriptomics analysis of Candida albicans"with capsule

TANG Xiao-yuan CHEN Ya-yun CHEN Ling-xia LIU Zhi-ping LIU Zhi-chun

（1.Department of Respirotory and Critical Care Medicine，"The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University；"2.School of Basic Medicine，"Gannan Medical University，"Ganzhou，"Jiangxi 341000）

Abstract "："Objective "："To study the transcriptomic characteristics of Candida albicans"with capsules."Methods："⑴feature Counts （1.5.0-p3）"were used to obtain the expression levels of genes or transcripts，"and DESeq2"software （1.20.0）"was used to screen out different express genes （DEG）"of Candida albicans"with capsules. The gene ontology （GO）"enrichment analysis and the kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG）"enrichment analysis were conducted using the \"clusterProfiler\" R package. And screen for key genes. ⑵"RT-PCR verified the mRNA expression of some differentially expressed genes between uncapsulated strains and capsulated strains of Candida albicans. Results："Compared with SC5314，"C1-1"had 2"586"differentially expressed genes，"of which 1"184"were significantly up-regulated and 1"402"were significantly down-regulated. GO enrichment analysis of differentially expressed genes showed that DEGs was mainly enriched in protein metabolism，"membrane composition，"membrane intrinsic components and structural molecular activity，"and ribosome structural components. KEGG analysis of differentially expressed genes showed that DEGs was enriched in ribosome，"pyruvate metabolism，"peroxisome，"cell cycle，"amino sugar and nucleotide sugar metabolism. The new transcript was annotated by GO，"KEGG，"Pfam and other databases，"and a total of 113"key genes were predicted，"among which 1"key gene was annotated by GO database，"which had oxidoreductase activity and might participate in the biological metabolic process of the capsule. KEGG database annotated 3"key genes involved in the metabolic activities of oxycarboxylic acid，"citrate cycle and amino acid of Candida albicans. Compared with uncapsulated strains of Candida albicans，"Efg1"and Thr1"mRNA expressions of capsulated strains decreased. Conclusion："There are significant differences in gene expression levels and related metabolic pathways between capsulated and uncapsulated strains of Candida albicans.

Key words "："Candida albicans；"Capsule；"Transcriptomics；"Gene

白色念珠菌（Candida albicans）為人類十分常見的機會致病性真菌，其毒力包括黏附、形態(tài)轉(zhuǎn)換、分泌水解酶、形成生物膜等^［1-2］。馬廉蘭等^［3-4］從性病患者分泌物分離及鑒定了多株具有莢膜的白色念珠菌，且具有莢膜的白色念珠菌與無莢膜的白色念珠菌在致病性、藥物敏感性等方面存在明顯差異^［5-6］，采用蛋白質(zhì)組學技術(shù)發(fā)現(xiàn)具有莢膜的白色念珠菌和無莢膜的白色念珠菌蛋白質(zhì)表達水平也存在明顯差異^［7］。這些研究結(jié)果提示莢膜與白色念珠菌的致病性密切相關(guān)，是白色念珠菌新的毒力，并且莢膜致病力可能與多種蛋白質(zhì)相互作用有關(guān)，但具體作用機制及基因是如何調(diào)控這些蛋白質(zhì)表達影響莢膜的形成并不清楚，需要進一步研究。本文采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析白色念珠菌莢膜菌株與無莢膜菌株在基因表達總體水平和相關(guān)代謝通路上基因表達水平，探討白色念珠菌莢膜形成可能涉及的基因及形成機制，為進一步研究白色念珠菌的致病機理提供理論依據(jù)和開發(fā)抗真菌藥物提供新思路。

1""材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株""白色念珠菌標準株（SC5314）購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC），具有莢膜的白色念珠菌由本課題組從臨床分離與鑒定，自行編號為C1-1。

1.1.2 試劑與儀器""多糖多酚試劑盒購自TIANGEN，SybrGreen Ⅰ試劑盒購自TransGen Biotech，RNA Nano 6000 Assay Kit of the Bioanalyzer 2100 system購自Agilent Technologies，NEBNext^?"Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina^?購自NEB，AMPure XP system購自Beckman Coulter，q-PCR system CFX96購自BIO-RAD，PCR儀ABI2720購自Applied Biosystems，NovaSeq 6000購自Illumina。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 文庫構(gòu)建及測序

1.2.1.1 cDNA文庫構(gòu)建""采用多糖多酚試劑盒分別提取C1-1菌株和SC5314菌株的總RNA并使用Agilent 2100 bioanalyzer精確檢測RNA質(zhì)量。本實驗采用NEB普通建庫方式，即以Oligo（dT）磁珠富集到的片段化mRNA為模板，依次在M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系、DNA polymerase Ⅰ體系雙鏈cDNA，隨后經(jīng)末端修復、加A尾、連接測序接頭、篩選、純化、文庫質(zhì)量檢測等程序后最終獲得合格文庫。

1.2.1.2 測序""對文庫集中混合后采用Illumina NovaSeq 6000進行測序。測序擴增體系中加入接頭引物、DNA聚合酶、熒光標記的dNTP，在合成過程中測序儀捕獲加入的dNTP釋放的相對應熒光信號，進一步將熒光信號利用計算機軟件轉(zhuǎn)化為測序峰，最終獲得相應待測片段的序列信息。

1.2.2 基因轉(zhuǎn)錄組分析

1.2.2.1 數(shù)據(jù)處理""將圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化的原始序列數(shù)據(jù)（reads）做過濾處理，去除帶有測序接頭或測序質(zhì)量較低的reads，并進行測序錯誤率檢查、GC含量分布檢查。

1.2.2.2 參考基因組比對""使用HISAT2（v2.0.5）作為工具，構(gòu)建參考基因組的索引，將配對末端經(jīng)過質(zhì)控處理后的干凈序列數(shù)據(jù)（clean reads）與基因組網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載參考基因組和基因模型注釋文件作比對。

1.2.2.3 差異表達分析""利用feature Counts（1.5.0-p3）獲得基因或轉(zhuǎn)錄本的表達量，通過DESeq2軟件（1.20.0）篩選出具有莢膜的白色念珠菌的差異表達基因（Different Express Gene，DEG），調(diào)整P值（padj）控制錯誤發(fā)現(xiàn)率。

1.2.2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析""使用“clusterProfiler”R包對差異表達基因進行GO富集分析和KEGG富集分析，篩選標準設定為P＜0.05。

1.2.2.5 關(guān)鍵基因預測分析""使用StringTie軟件組裝新轉(zhuǎn)錄本并進行GO、KEGG、Pfam、SUPERFAMILY等數(shù)據(jù)庫注釋，預測分析編碼莢膜的基因。

1.2.3 RT-PCR "選擇了2個顯著性變化基因Efg1和Thr1進行RT-PCR驗證，利用多糖多酚試劑盒分別從C1-1菌株和SC5314菌株中提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后根據(jù)SybrGreen Ⅰ試劑盒說明使用基因特異性引物進行實時PCR。使用Actin作為管家基因，并計算靶基因的相對表達。引物序列見表1。

2""結(jié)果

2.1 文庫測序結(jié)果""對C1-1和SC5314菌株分別進行了轉(zhuǎn)錄組學測序并進行了質(zhì)量控制，結(jié)果顯示，C1-1菌株和SC5314菌株Q20分別為96.73%和97.12%，GC含量超過20（表2）。說明此次測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，達到后續(xù)分析要求。

2.2 clean reads與參考基因組比對分析""將質(zhì)控后的clean reads與參考基因組比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C1-1、SC5314菌株clean reads與參考基因組的匹配率分別為88.15%和92.39%。說明后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果可靠。

2.3 基因差異表達分析與聚類分析""測序結(jié)果根據(jù)padj＞0.05和|log2（FoldChange）|＞1原則篩選C1-1與SC5314菌株的差異表達基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C1-1菌株與SC5314菌株相比，共有2 586個DEGs，其中顯著上調(diào)的1 184個，顯著下調(diào)的1 402個（圖1）。進一步對差異基因表達值進行聚類分析及數(shù)據(jù)均一化處理，結(jié)果顯示，C1-1菌株與SC5314菌株基因表達差異顯著（圖2）。

2.4 差異表達基因GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 對差異表達基因進行GO富集分析發(fā)現(xiàn)：⑴生物學過程（Biological Process，BP），DEGs主要富集在蛋白質(zhì)代謝過程。⑵細胞學組分（Cytological Components，CC），DEGs主要富集在膜的構(gòu)成和膜的固有成分。⑶分子生物學功能（Molecular Biological Functions，MF），DEGs富集在結(jié)構(gòu)分子活性和核糖體結(jié)構(gòu)性成分（圖3）。對差異表達基因進行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)：DEGs富集在核糖體、丙酮酸鹽代謝、過氧化物酶體、細胞周期、氨基糖和核苷酸糖代謝等通路（圖4）。

2.5 關(guān)鍵基因預測分析""使用StringTie軟件進行新轉(zhuǎn)錄本組裝，預測的新轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)注釋共計361個，其中轉(zhuǎn)錄本145個，外顯子216個。對新轉(zhuǎn)錄本進行GO、KEGG、Pfam等數(shù)據(jù)庫注釋，共預測關(guān)鍵基因113個，其中GO數(shù)據(jù)庫注釋關(guān)鍵基因1個，具有氧化還原酶活性，可能參與莢膜的生物代謝過程；KEGG數(shù)據(jù)庫注釋關(guān)鍵基因3個，參與白色念珠菌的氧代羧酸、檸檬酸鹽循環(huán)、氨基酸等代謝活動。

2.6 白色念珠菌無莢膜菌株與莢膜菌株Efg1、Thr1"mRNA表達""與白色念珠菌無莢膜菌株相比，莢膜菌株Efg1、Thr1 mRNA表達均降低（圖5）。

3""討論

轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)有助于了解病原體與宿主的相互作用過程中基因的表達情況及調(diào)控機制，該技術(shù)已應用于白色念珠菌與宿主的相互作用、致病機制、耐藥性、生物膜形成等研究^［8-11］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)部分白色念珠菌具有莢膜結(jié)構(gòu)，并鑒定了可能與莢膜結(jié)構(gòu)有關(guān)的蛋白質(zhì)^{［3-4，7］}。本研究利用轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)發(fā)現(xiàn)具有莢膜的白色念珠菌與沒有莢膜的白色念珠菌有顯著差異表達基因，說明白色念珠菌莢膜的形成可能由部分基因控制。

為進一步了解白色念珠菌莢膜的形成機制，對差異表達基因進行GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因與蛋白質(zhì)代謝過程關(guān)系密切，其中與肽的生物學合成相關(guān)的差異表達基因數(shù)量最多^［7］，提示多肽為白色念珠菌莢膜的主要成分。為進一步探索白色念珠菌莢膜可能的代謝過程，從系統(tǒng)水平分析白色念珠菌莢膜的形成機制，對差異表達基因進行了KEGG富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DEGs富集在核糖體、丙酮酸鹽代謝、過氧化物酶體、細胞周期、氨基糖和核苷酸糖代謝等通路。

白色念珠菌的毒力因子有很多，其中在非生物介質(zhì)和宿主黏膜表面形成生物膜是十分重要的致病因素。微生物產(chǎn)生的多糖是參與生物膜組成的重要成分，起到保護、黏附的作用，而參與生物膜形成與成熟的多糖主要為莢膜多糖和脂多糖^［12-13］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)多株具有莢膜的白色念珠菌，致病力明顯增強^{［3-4，7］}，提示白色念珠菌可能通過莢膜結(jié)構(gòu)參與生物膜形成，從而進一步發(fā)揮致病作用。與白色念珠菌生物膜形成及調(diào)控的基因有很多，包括Als3、Hwp1、Sfp1、Arc18、Erg3、Erg11、Csa2、Efg1等^［14-15］。本研究結(jié)果顯示與白色念珠菌無莢膜菌株相比，莢膜菌株Efg1、Thr1 mRNA表達均降低，提示白色念珠菌莢膜形成與Efg1、Thr1基因的低水平表達有關(guān)，但該基因是如何調(diào)控白色念珠菌莢膜及生物膜的形成有待進一步研究。

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（收稿：2023 - 10 - 10）"（修回：2024 - 02 - 26）

（責任編輯：尹丹）