水芹SSR分子標記開發(fā)與遺傳多樣性分析

摘要：水芹是傘形科水芹屬多年生草本植物，是一種重要的藥食兩用蔬菜作物。在中國，水芹的種植區(qū)域十分廣泛，然而目前對其種質資源的鑒定、培育及遺傳信息的研究較少。本研究利用溧陽白芹基因組開發(fā)水芹簡單重復序列（SSR）分子標記，分析55份水芹的遺傳多樣性并用非加權組平均法（UPGMA）構建系統(tǒng)進化樹，同時用SSR擴增條帶數(shù)據(jù)構建DNA指紋圖譜。結果顯示，共鑒定到325 699個SSR位點，其中單核苷酸SSR重復單元、二核苷酸SSR重復單元、三核苷酸SSR重復單元、四核苷酸SSR重復單元、五核苷酸SSR重復單元、六核苷酸SSR重復單元的出現(xiàn)頻率分別為33.94%、54.62%、9.31%、1.66%、0.17%、0.29%，其中二核苷酸SSR重復單元數(shù)最多，有177 887個，且A/T（占比為29.98%）和AT/AT（占比為35.70%）是較豐富的重復類型。UPGMA分析結果表明，33對高多態(tài)性引物[多態(tài)信息含量（PIC）>0.25]可將55份水芹材料分為4組。利用篩選出的4對引物（Oj-084、Oj-110、Oj-112、Oj-156）可以將55份水芹材料完全區(qū)分開，并且可構建指紋圖譜。研究結果可為水芹種質資源鑒定、保護及分子遺傳育種提供有力依據(jù)。

關鍵詞：水芹；簡單重復序列（SSR）分子標記；聚類分析；遺傳多樣性

中圖分類號：S645.901文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2024）07-1285-12Development of SSR molecular markers and genetic diversity analysis of Oenanthe javanicaXING Xiaolin1，CHEN Dan1，KUANG Yong1，XU Wenjuan1，HUANG Ran2，GAN Defang1

（1.School of Horticulture， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China;2.Anhui Zhengze Ecological Agriculture Science and Technology Development Co.， Ltd.， Dingyuan 233230， China）

Abstract：Dropwort is a perennial herbaceous plant of Oenanthe genus in the Apiaceae family， which is an important vegetable crop for both food and medicine. In China， the planting area of dropwort is very extensive. However， there are few studies on the identification and cultivation of its germplasm resources and the genetic information. In this study， we used the genome of Liyang Baiqin to develop simple sequence repeat （SSR） molecular markers for dropwort， and analyzed the genetic diversity of 55 samples. The phylogenetic tree was constructed by unweighted pair group method with arithmetic means （UPGMA）， and the DNA fingerprint was constructed with SSR amplified band data. The results showed that a total of 325 699 SSR loci were identified. The frequencies of single nucleotide SSR repeat units， dinucleotide SSR repeat units， trinucleotide SSR repeat units， tetranucleotide SSR repeat units， pentanucleotide SSR repeat units and hexanucleotide SSR repeat units were 33.94%， 54.62%， 9.31%， 1.66%， 0.17% and 0.29%， respectively. Among them， the number of dinucleotide SSR repeat units was the largest （177 887）， and A/T （29.98%） and AT/AT （35.70%） were the more abundant repeat types. The results of UPGMA analysis indicated that 55 Oenanthe javanica materials could be divided into four groups by 33 pairs of highly polymorphic primers （polymorphic information content>0.25）. Four pairs of primers （Oj-084， Oj-110， Oj-112， Oj-156） were used to completely distinguish 55 Oenanthe javanica materials， and the fingerprint could be constructed. The results can provide a strong basis for the identification， protection and molecular genetic breeding of Oenanthe javanica germplasm resources.

Key words：dropwort;simple sequence repeat （SSR） molecular markers;cluster analysis;genetic diversity

水芹[Oenanthe javanica （Bl.） DC.]別稱水芹菜、水英、蜀芹、野芹菜等，是傘形科水芹屬多年生濕生草本蔬菜[1]。長期以來，水芹一直被視為藥食同源的保健蔬菜，其富含蛋白質、維生素、纖維素等營養(yǎng)物質及鉀、鈣、硒等多種礦質元素[2-3]，并且含有類黃酮、多酚、香豆素等功能活性物質[4-5]，具有清熱、利尿、降血脂和血壓、抗炎、抗氧化等功效[6-7]，深受人們的喜愛。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，對水芹的需求量也不斷增加。水芹的種植方式多種多樣，有深水栽培、淺水栽培、濕潤栽培等，其軟化方式也呈現(xiàn)多樣化，有培土軟化、深栽軟化、深水軟化、覆蓋軟化等。近年來，研究者培育出一些耐高溫的水芹品種，配合夏季遮陽網(wǎng)進行覆蓋栽培，可以實現(xiàn)水芹的周年生產(chǎn)和均衡供應[8]。

水芹種質資源十分豐富，在世界各地均有種植，目前主要分布于中國長江流域、日本北海道、印度尼西亞爪畦島及菲律賓等地區(qū)，多分布在沼澤地帶[9-10]。目前，有關水芹的研究主要集中在栽培技術[11]、凈化水體的作用[12-13]、藥理活性及功能研究等方面[14-16]。近年來，科研工作者也開始對水芹進行基因組學及功能基因的研究[17-18]，而有關水芹種質資源分類的研究較少[1，19-20]。目前，水芹資源大多以產(chǎn)地命名，如江蘇的常熟白芹、玉祁紅芹、宜興圓葉芹、溧陽白芹、丹陽水芹，安徽的桐城水芹、廬江的高梗水芹等。由于品種間的形態(tài)差異較大，加上各地間的互相引種，使得水芹品種的命名比較混亂，亟需一種快速準確鑒定水芹品種的方法，用于水芹資源的遺傳多樣性分析，對于水芹種質資源的鑒定保護、有效利用和創(chuàng)新具有十分重要的意義。趙書花[19]利用隨機擴增多態(tài)性DNA標記（RAPD）技術對中國的20份水芹種質資源進行了親緣關系分析，認為地理因素對水芹品種的影響較大，但也有來自不同地區(qū)的材料的遺傳距離相近，說明遺傳距離相近的材料可能具有相同的起源或相近的環(huán)境條件亦或受到相似的人工選擇。傅劭[20]采用DNA測序技術及光學顯微鏡及掃描電鏡對170份東亞水芹野生種質資源進行了分子系統(tǒng)學、微形態(tài)及孢粉學等研究，認為東亞水芹野生種質資源的物種分類與傳統(tǒng)菜用水芹資源的物種認定結果不相符。此外有研究者認為，同一物種內不同區(qū)域的水芹品種的孢粉學形態(tài)差別很大。王月等[21]利用低拷貝核基因AOX1、MCM5對太湖地區(qū)6個水芹地方品種進行了遺傳多樣性分析，并結合簡單重復序列區(qū)間和特定序列擴增（ISSR-SCAR）技術，開發(fā)了玉祁水芹特異性分子標記，為水芹的遺傳育種提供了分子基礎。

簡單重復序列（SSR）是一類以1～6個核苷酸為基本單元的1段DNA序列，在基因組中串聯(lián)重復出現(xiàn)，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重復[22-24]。由于SSR分子標記具有數(shù)量多、多態(tài)性好、使用成本低及操作簡單等特點，已經(jīng)在植物遺傳圖譜構建、遺傳多樣性分析、基因定位與克隆等方面得到廣泛應用[25-26]，也是目前常用的分子標記之一。

本研究擬利用溧陽白芹基因組開發(fā)SSR多態(tài)性分子標記，借助瓊脂糖凝膠電泳檢測技術，對55份來源不同的水芹自然材料進行遺傳多樣性分析，分析其遺傳差異及親緣關系，以期為水芹種質資源鑒定、圖譜構建及分子標記輔助育種等研究提供理論支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

以收集的55份水芹資源為試驗材料，其中13份由揚州大學李良俊教授課題組提供。已知水芹品種為玉祁紅芹（編號為SQ008，序號為1）、春暉（編號為SQ024，序號為10）、秋芹1號（編號為SQ026，序號為11）、伏芹1號（編號為FQ1H，序號為12）、揚州長白芹（編號為YZCBQ，序號為13）、鄂水芹1號（編號為ESQ1H，序號為20），其余材料為從不同地區(qū)采集的自然材料（表1）。

1.2DNA的提取

用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[27]提取55份水芹葉片的基因組DNA，用Nanodrop 2000檢測DNA的質量和濃度，并將DNA原液質量濃度稀釋到50 ng/μL，再將稀釋液于-20 ℃冰箱保存。

1.3SSR分子標記的開發(fā)

本研究所用溧陽白芹基因組序列由南京農(nóng)業(yè)大學熊愛生教授課題組提供。用TBtools[28]中的SSRminer對水芹全基因組序列進行SSR位點搜索。用TBtools中的插件Batch Target Region Primer Design進行引物的批量設計，再用TBtools中的插件Primer Check進行引物的特異性檢測，最后對特異性引物進行篩選。隨機選取160對篩選到的引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴增體系如下：10 μL 2×PCR Mix，1 μL正向引物，1 μL反向引物，1 μL稀釋的DNA工作液，7 μL ddHO，總體積為20 μL。PCR反應程序如下：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸6 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行有效性驗證。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

對凝膠電泳檢測結果進行帶型統(tǒng)計，根據(jù)擴增條帶的大小，從上往下讀取條帶，有條帶的記為1，無條帶的記為0，缺失條帶的記為9，用Excel 2019對獲得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和作圖。用Power Marker、GenAlEx軟件分析SSR擴增數(shù)據(jù)，計算多態(tài)性信息含量（PIC）、次等位基因頻率（MAF）、等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、遺傳多樣性系數(shù)（GD）、期望雜合度（He）等數(shù)據(jù)；用NTsys-pc計算供試材料之間的遺傳距離、遺傳相似系數(shù)，用非加權組平均法（UPGMA）構建系統(tǒng)進化樹。

1.5SSR指紋圖譜的構建

根據(jù)擴增條帶的位置，從上往下讀取條帶，有條帶的記為1，無條帶的記為0，缺失條帶的記為9，再根據(jù)引物多態(tài)性信息含量從大到小進行排序，用十進制數(shù)字對材料進行編碼，構建55份水芹材料的SSR指紋圖譜。

2結果與分析

2.1水芹基因組SSR位點的鑒定與分析

在Linux服務器上對溧陽白芹的基因組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)基因組數(shù)據(jù)大小為1.23 Gb，共有199 035條Scaffolds（序列總長度為1 325 692 593 bp）。用TBtools軟件在溧陽白芹基因組序列中鑒定到325 699個SSR位點，平均每3.97 kb就有1個SSR位點。統(tǒng)計單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復序列的分布狀況和數(shù)量特征發(fā)現(xiàn)，各類型SSR出現(xiàn)的頻率依次如下：單核苷酸為33.94%，二核苷酸為54.62%，三核苷酸為9.31%，四核苷酸為1.66%，五核苷酸為0.17%，六核苷酸為0.29%。其中，二核苷酸SSR重復單元數(shù)量最多，有177 887個（表2）。另外，重復次數(shù)為5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、≥14次的SSR出現(xiàn)頻率分別為6.70%、16.71%、10.27%、7.88%、5.61%、3.82%、21.84%、8.63%、4.76%、13.78%。

2.2不同類型SSR重復出現(xiàn)的頻率及分布特征

溧陽白芹基因組統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，SSR位點的重復基序類型有1 112種。在考慮序列互補的情況下，SSR重復基序類型有598種，其中（AT/AT）n重復基序類型最豐富，約占總SSR位點數(shù)的35.70%；其次是A/T重復基序，約占總SSR位點數(shù)的29.98%；（AC/GT）n約占總SSR位點數(shù)的10.23%，（AG/CT）n約占總SSR位點數(shù)的8.41%，C/G約占總SSR位點數(shù)的3.99%，（AAT/ATT）n約占總SSR位點數(shù)的3.80%，其他各類型SSR占總SSR位點數(shù)的比例大多低于1.00%（表3）。

2.3SSR引物篩選

選擇二堿基重復10次、三堿基重復6次的SSR位點，用TBtools中的插件Batch Target Region Primer Design進行引物的批量設計，再用TBtools中的插件Primer Check進行引物的特異性檢測，最后對特異性引物進篩選，篩選條件如下：PCR產(chǎn)物預期大小為100～350 bp，引物退火溫度（Tm）為58～61 ℃，且正向引物（F）和反向引物（R）的Tm相差1 ℃；引物長度為18～22 bp，引物5’端最好是G/C，3’端最好避免出現(xiàn)A；引物序列中的堿基重復次數(shù)少于4次，G/C的單堿基重復次數(shù)少于3次。為了保證引物的特異性，用于設計引物的保守側翼序列與SSR位點間至少間隔20～23個堿基。從篩選后的引物中隨機選取160對引物進行合成。用6份不同來源地、性狀差異較大的樣品進行PCR擴增，根據(jù)條帶清晰、多態(tài)性豐富的原則，最終篩選到33對多態(tài)性SSR引物（表4）。

2.4SSR引物多態(tài)性分析

用篩選到的33對SSR引物對55份水芹材料進行PCR擴增，共檢測出164個等位基因，平均每對引物擴增得到的等位基因數(shù)為5個；有效等位基因數(shù)為1.556 8～5.434 0個，平均每個位點的有效等位基因數(shù)為3.052 3個；Shannon’s指數(shù)為0.595 4～2.004 3，平均值為1.225 5；多態(tài)性信息含量（PIC）為0.323 3～0.791 2，平均值為0.541 8，33對引物均具有較高的多態(tài)性信息含量（PIC>0.250 0）（表5），且擴增條帶清晰，圖1為引物Oj-125對55份水芹材料的擴增結果。上述結果說明，本研究所用引物的多態(tài)性較高，可用于水芹品種的鑒定和遺傳多樣性分析等。

2.5水芹材料聚類分析

根據(jù)33對引物的遺傳信息數(shù)據(jù)，用軟件NTSYS-PC計算遺傳距離系數(shù)，構建55份水芹材料的UPMGA聚類圖。結果（圖2）表明，55份水芹材料的遺傳距離系數(shù)為0.42～0.95，當遺傳距離系數(shù)為0.56時，55份水芹材料可聚為4組。第Ⅰ組包括編號為1、18、21、40、48等50份材料；第Ⅱ組包括編號為24、42的2份材料，其中編號為24的材料來源于安徽省六安市，編號為42的材料來自安徽省合肥市；第Ⅲ組包括編號為15、49的2份材料，其中編號為15的材料來自安徽舒城縣，編號為49的材料來自安徽省池州市；第Ⅳ組中僅聚類了1份材料，該材料來自安徽省安慶市，與其他水芹材料相比，該水芹與其他水芹間的親緣關系較遠（圖2）。當遺傳距離系數(shù)為0.63時，第Ⅰ組中的50份材料被劃分為6個亞群，編號為1、2、3、6、11、18、7、9、10、8、12、13、4、5、21的材料屬于第Ⅰ亞類，除了編號為18、21的材料外，其余材料均來自江蘇省水生作物資源圃；編號為25、27、28、33、34、29、30、50等材料屬于第Ⅱ亞類，其中多數(shù)材料的來源地均為安徽省合肥市的不同區(qū)域；編號為14、19、20、22的材料屬于第Ⅲ亞類，其中編號為19、20的材料的來源地為安徽省舒城縣農(nóng)業(yè)科學研究所；編號為23、17、16的材料分別屬于第Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ亞類。綜上所述，用33對引物可以將取自不同地區(qū)的水芹材料完全區(qū)分開。通過UPMGA聚類圖可以明確不同地區(qū)的水芹材料與已知水芹材料間的親緣關系，此外還可以發(fā)現(xiàn)，來自相同區(qū)域的多數(shù)水芹材料被聚類在一起，表明水芹群體中遺傳差異與地理來源間的關系較為密切。

2.6DNA指紋圖譜構建

用33對多態(tài)性引物得到擴增結果后，從上往下讀取條帶，有條帶的記為1，無條帶的記為0，缺失條帶的記為9，準確讀出條帶數(shù)據(jù)。通過在線工具（http：//cloud.genepioneer.com：9929）計算最小標記組合。結果表明，最少可用4對引物（Oj-084、Oj-110、Oj-112、Oj-156）將55份水芹材料完全區(qū)分開，其中引物Oj-112的多態(tài)性位點數(shù)達12個。根據(jù)上述4對引物的條帶數(shù)據(jù)，以十進制數(shù)字構建55份水芹材料的DNA指紋圖譜（表6）。

3討論與結論

近年來，隨著分子標記技術的發(fā)展，DNA指紋技術在農(nóng)作物品種鑒定領域的優(yōu)勢與潛力越發(fā)明顯[29-31]，并且彌補了形態(tài)學鑒定的不足而成為品種鑒定的重要方法。SSR分子標記被認為是研究植物遺傳多樣性較有效的標記[32]，在水稻[33]、小麥[34]、玉米[35]及傘形科植物如芹菜[36]、胡蘿卜[37]等作物上均有應用。中國水芹種質資源豐富，分布較廣，為了充分利用水芹種質資源，就需要對水芹種質資源的遺傳多樣性進行全面分析。本研究首次基于溧陽白芹基因組數(shù)據(jù)挖掘SSR位點，隨機抽取并合成160對引物進行篩選，利用篩選到的33對SSR引物對55份水芹材料進行遺傳多樣性分析，為水芹種質資源遺傳鑒定奠定了基礎。

基于溧陽白芹基因組數(shù)據(jù)，本研究共得到1 112種類型的SSR，其中二核苷酸重復單元占比最高，達到54.62%。Feng等[38]構建了水芹長/短讀轉錄組，從57 743個非冗余高質量轉錄本中鑒定出28 514個SSR，且單核苷酸重復序列是最豐富的SSR。本研究結果則顯示，二核苷酸重復序列是最豐富的類型。在重復單元類型中，（AT/AT）n重復基序類型最豐富，約占總SSR位點數(shù)的35.70%；其次是A/T重復基序，約占總SSR位點數(shù)的29.98%，說明溧陽白芹基因組中富含A、T堿基，這與對苦蕎[24]、芹菜[39]等植物中SSR基序的研究結果一致。

目前，SSR分子標記被廣泛應用于種質資源親緣關系區(qū)分、品種鑒定及遺傳多樣性分析[32]，本研究開發(fā)的33對多態(tài)性SSR引物（PIC>0.250 0）可用于55份水芹材料的遺傳多樣性分析，且本研究共檢測出164個等位基因，遺傳距離系數(shù)為0.42～0.95，平均遺傳距離系數(shù)為0.68。由UPGMA聚類分析結果可知，當遺傳距離系數(shù)為0.56時，55份水芹材料可聚為Ⅳ組，其中Ⅰ組有50份材料，且6份屬于已知水芹材料，說明第Ⅰ組50份水芹材料間的親緣關系較近；位于第Ⅱ組的24號（舒城縣張母橋鎮(zhèn)）和42號（合肥市廬陽區(qū)淝河西）以及第Ⅲ組的15號（舒城縣農(nóng)業(yè)科學研究所）和49號（池州市牌樓鎮(zhèn)）水芹材料之間的親緣關系較近；遺傳差異最大的是位于第Ⅳ組來自安慶市的水芹材料。對聚類結果進一步分析可知，本研究所用水芹材料的遺傳背景較為單一，多數(shù)來源于相同區(qū)域的材料被聚集在一起，可能由于地區(qū)之間引種頻繁，基因交流密切，導致水芹的遺傳多樣性降低。因此，為了改善水芹遺傳背景的狹隘性，應該開發(fā)更多分子標記，對水芹種質資源進行鑒定與保護，并加大種質創(chuàng)新、品種改良的力度。

中國水芹資源分布較廣，品種差異較大。水芹主要是按地域命名，由于各地間相互引種，導致水芹同種異名和同名異種的現(xiàn)象普遍存在。目前，有關水芹種質資源的研究相對較少，趙書花[19]利用RAPD標記對20份水芹材料進行了聚類分析，認為地理因素對水芹品種的影響很大，但是也有來自不同地區(qū)水芹材料間的遺傳距離相近，這與本研究UPGMA聚類分析結果一致。本研究以最少的4對引物（Oj-084、Oj-110、Oj-112、Oj-156）將55份水芹材料完全區(qū)分開，并根據(jù)這4對引物的條帶數(shù)據(jù)，用十進制數(shù)字構建了55份水芹材料的DNA指紋圖譜。

綜上所述，本研究利用水芹全基因組開發(fā)了33對高多態(tài)性SSR分子標記，并用這些標記成功鑒定6份已知水芹材料和49份來自不同地區(qū)的自然水芹材料，并對55份水芹材料進行遺傳多樣性分析和DNA指紋圖譜構建。但是，水芹種質資源豐富，品種間的形態(tài)差異較大，加上各地的相互引種，使得水芹品種的命名比較混亂，還需要進一步對其遺傳多樣性進行分析，相關工作對于水芹種質資源的鑒定保護、利用和創(chuàng)新具有十分重要的意義，也可為水芹的分子育種提供重要理論參考。

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（責任編輯：徐艷）