百香果SPL轉(zhuǎn)錄因子家族成員鑒定及其對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)

摘要：SPL（SQUAMOSA啟動(dòng)子結(jié)合類(lèi)蛋白質(zhì)）是一類(lèi)特異存在于植物中的轉(zhuǎn)錄因子，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)過(guò)程。為明確百香果SPL轉(zhuǎn)錄因子家族成員特征及其對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)，本研究利用生物信息學(xué)方法和百香果基因組數(shù)據(jù)，對(duì)百香果SPL家族基因的結(jié)構(gòu)、染色體分布、共線性關(guān)系及其編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，并通過(guò)低溫和常溫處理明確了百香果幼苗葉片SPL家族基因的相對(duì)表達(dá)量差異。結(jié)果表明，從百香果基因組中鑒定出19個(gè)SPL家族成員，分布于7條染色體上，其中包含3對(duì)共線性基因?qū)?。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示該家族分為9個(gè)亞族。百香果PeSPL基因啟動(dòng)子區(qū)域存在大量激素響應(yīng)元件和逆境脅迫響應(yīng)元件。低溫脅迫下，百香果PeSPL2、 PeSPL3、 PeSPL6、 PeSPL7、PeSPL8和PeSPL9 6個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著上升，PeSPL13和PeSPL18 2個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量顯著下降。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步揭示百香果SPL基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)機(jī)制提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：百香果；SPL基因家族；低溫脅迫；表達(dá)分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S667.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2024）07-1320-10Identification of SPL transcription factor gene family members and their response to cold stress in passion fruitREN Rui，ZHANG Han，JIANG Wenjie，PAN Jiayi，F(xiàn)ANG Ting

（College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University/Institute of Horticultural Plant Genetics and Breeding， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China）

Abstract：SPL （SQUAMOSA promoter-binding protein-like） is a plant-specific transcription factor that participates in many processes of plant growth and development. In order to clarify the characteristics of SPL transcription factor family members and their response to low temperature stress in passion fruit， bioinformatics methods and genome data of passion fruit were used to analyze the structure， chromosome distribution， collinear relationship of SPL family genes in passion fruit， as well as the physicochemical properties and evolutionary relationship of SPL family genes encoded proteins. The relative expression differences of SPL family genes in the leaves of passion fruit seedlings were clarified by low temperature treatment and normal temperature treatment. The results showed that 19 SPL family members were identified from the genome of passion fruit， which were distributed on seven chromosomes， including three pairs of collinear gene pairs. SPL gene family of passion fruit was divided into nine branches according to results of phylogenetic tree. There were many cis-acting elements in the promoter region of PeSPL genes of passion fruit， which responsed to hormones and stress. Under low temperature stress， the relative expression levels of PeSPL2， PeSPL3， PeSPL6， PeSPL7， PeSPL8 and PeSPL9 were extremely significantly increased， and the relative expression levels of PeSPL13 and PeSPL18 were significantly decreased. The results of this study can provide a basis for further revealing the response mechanism of passion fruit SPL gene to low temperature stress.

Key words：passion fruit;SPL gene family;cold stress;expression analysis

SPL（SQUAMOSA啟動(dòng)子結(jié)合類(lèi)蛋白質(zhì)）又稱為SBP-box蛋白 （SQUAMOSA promoter binding protein），是綠色植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素響應(yīng)、光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用[1-2]。1996年，Klein等[3]從金魚(yú)草中發(fā)現(xiàn)并首先分離出SPL基因AmSBP1和AmSBP2，因其編碼蛋白質(zhì)可與花發(fā)育基因SQUAMOSA的啟動(dòng)子結(jié)合，因此被命名為SQUAMOSA啟動(dòng)子結(jié)合類(lèi)蛋白質(zhì)（SBP）[4]。

目前，擬南芥[5]、水稻[6]、馬尾松[7]、番茄[8]、蘋(píng)果[9]、草莓[10]和甜橙[11]等植物中SPL家族基因的成員已經(jīng)得到鑒定，并分別鑒定出17個(gè)、19個(gè)、11個(gè)、15個(gè)、27個(gè)、14個(gè)、15個(gè)SPL成員。SPL基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起重要的調(diào)控作用[12-18]。AtSPL8通過(guò)影響赤霉素（GA）合成和花藥發(fā)育來(lái)調(diào)節(jié)擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[16]。AtSPL3基因的組成型表達(dá)會(huì)導(dǎo)致擬南芥植株的花期提前[5]。AtSPL2和AtSPL11基因能調(diào)控?cái)M南芥的開(kāi)花過(guò)程[19]。Stone等[18]研究發(fā)現(xiàn)，AtSPL14不僅能調(diào)控植物對(duì)伏馬菌素B1的抗性，還能影響到擬南芥的株型結(jié)構(gòu)。此外，SPL基因在植物響應(yīng)非生物脅迫方面也發(fā)揮著重要作用。在擬南芥中過(guò)表達(dá)中國(guó)野生葡萄資源的VpSBP16基因可提高其耐鹽和抗干旱能力[20]；擬南芥中miR156-SPL9-DFR通路協(xié)同調(diào)控植物生長(zhǎng)與非生物脅迫響應(yīng)之間的關(guān)系[19]；茶樹(shù)中多個(gè)SBP基因的表達(dá)量在低溫處理后呈現(xiàn)顯著上調(diào)[21]。

百香果（Passiflora edulis Sims）是西番蓮科西番蓮屬藤本植物，又被稱作雞蛋果和西番蓮等，其果實(shí)香氣濃郁且富含多酚類(lèi)化合物、生物堿以及黃酮類(lèi)化合物等多種對(duì)人體有益的活性成分，具有較高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值[22-24]。由于百香果原產(chǎn)于南美洲的熱帶地區(qū)，抗寒能力較差，低溫冷害已成為世界各國(guó)百香果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要限制因子[25-26]。因此，對(duì)百香果SPL基因家族成員進(jìn)行鑒定及對(duì)其低溫脅迫下的表達(dá)特征進(jìn)行分析，可為百香果SPL基因的抗寒功能研究及耐低溫百香果品種選育提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1植物材料

2023年5月20日在福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室選取6株長(zhǎng)勢(shì)基本一致的3個(gè)月苗齡臺(tái)農(nóng)百香果幼苗作為試驗(yàn)材料，其中3株放入人工氣候箱進(jìn)行4 ℃低溫脅迫處理8 h，另外3株置于25 ℃環(huán)境下培養(yǎng)，其他條件與低溫處理組一致，8 h后取各植株中上部葉片，迅速置于液氮中冷凍，于-80 ℃冰箱保存，用于基因表達(dá)模式分析。

1.2百香果SPL基因家族成員的鑒定

擬南芥SPL蛋白序列下載自擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR（https ：//www.arabidopsis.org/），百香果基因組序列下載自國(guó)家基因庫(kù)生命大數(shù)據(jù)平臺(tái)（CNGBdb）[24]。以模式植物擬南芥的SPL基因的編碼蛋白序列為模板，利用Tbtools軟件設(shè)定E值<1×10-5，在百香果的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)[24]中進(jìn)行同源對(duì)比，得到百香果SPL基因家族候選序列，進(jìn)一步利用NCBI-CCD和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)候選序列進(jìn)行SBP-box結(jié)構(gòu)域完整性的鑒定。

1.3百香果SPL家族基因編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位利用TBtools軟件進(jìn)行百香果SPL家族基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)。利用在線網(wǎng)站W(wǎng)oLFPSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp）進(jìn)行百香果SPL家族基因編碼蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。

1.4百香果SPL基因家族成員基因結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)保守基序分析利用在線網(wǎng)站GSDS2.0（http：//gsds.gao-lab.org/）分析百香果SPL家族基因的結(jié)構(gòu)。利用MEME網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）分析百香果SPL家族成員編碼蛋白質(zhì)的保守基序，并利用TBtools軟件進(jìn)行結(jié)果的可視化表達(dá)。

1.5百香果SPL家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建及分析

設(shè)置自展系數(shù)（Booststrap）為1 000次，利用MEGA7軟件采用鄰近法（Neighbor-joining method）進(jìn)行百香果和擬南芥的SPL家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

1.6百香果SPL家族基因染色體定位及共線性分析

利用TBtools軟件進(jìn)行百香果SPL基因的染色體定位和基因共線性分析。

1.7百香果SPL家族基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

提取百香果SPL基因起始密碼子前2 000 bp片段作為啟動(dòng)子序列，利用PlantCARE在線網(wǎng)站 （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)分析，并利用TBtools軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化表達(dá)。

1.8百香果SPL家族基因低溫脅迫響應(yīng)分析

參照Redzol試劑盒[賽百盛（北京）基因技術(shù)有限公司]說(shuō)明書(shū)提取臺(tái)農(nóng)百香果葉片的總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量。使用Code AH341-01反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品）將臺(tái)農(nóng)百香果RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。以Pe60S基因[27]為內(nèi)參基因，SYBR Green I Master Mix 為PCR擴(kuò)增預(yù)混液[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司產(chǎn)品]，利用LightCycler 96 實(shí)時(shí)定量PCR 系統(tǒng)（瑞士Hoffmann-La Roche 有限公司產(chǎn)品）檢測(cè)常溫和低溫處理下百香果葉SPL基因的表達(dá)水平，所用引物序列見(jiàn)表1。使用2-△△Ct方法[28]計(jì)算SPL基因的相對(duì)表達(dá)量，利用SPSS軟件中的Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行不同處理SPL基因相對(duì)表達(dá)量的差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1百香果SPL基因家族成員的鑒定

在百香果基因組中共篩選得到19個(gè)SPL家族基因，根據(jù)其在染色體上的排列順序分別命名為PeSPL1～PeSPL19（表2）。百香果SPL家族基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)量為141～1 078個(gè)，相對(duì)分子量和等電點(diǎn)分別為1.613×104～11.971×104和5.32～9.40，不穩(wěn)定系數(shù)為41.03～66.19，脂溶指數(shù)和親水性指數(shù)分別為40.14～89.89和-1.211～-0.046。除PeSPL10蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，PeSPL12蛋白定位于葉綠體，其他百香果SPL家族蛋白均定位于細(xì)胞核。

2.2百香果SPL家族基因結(jié)構(gòu)和保守基序（Motif）分析PeSPL家族基因的結(jié)構(gòu)如圖1所示。從圖中可以看出，PeSPL所有成員均含有內(nèi)含子和外顯子，但內(nèi)含子和外顯子數(shù)量存在較大的差異。PeSPL3、PeSPL14、PeSPL15、PeSPL19基因各有1個(gè)內(nèi)含子，PeSPL5、PeSPL6、PeSPL7、PeSPL13、PeSPL17基因各有2個(gè)內(nèi)含子，PeSPL4、PeSPL9、PeSPL11、PeSPL16基因各有3個(gè)內(nèi)含子，PeSPL10、PeSPL12基因各有5個(gè)內(nèi)含子，PeSPL8、PeSPL18、PeSPL1、PeSPL2基因分別有4個(gè)、6個(gè)、9個(gè)和10個(gè)內(nèi)含子。PeSPL1和PeSPL2基因分別含有10個(gè)和11個(gè)外顯子，PeSPL8、PeSPL10、PeSPL12和PeSPL18基因含有5～7個(gè)外顯子，其他13個(gè)基因含有2～4個(gè)外顯子。PeSPL基因編碼蛋白質(zhì)含有2～10個(gè)保守基序（Motif1～Motif10），其中PeSPL11和PeSPL12含有全部10個(gè)保守基序，而PeSPL17蛋白僅有2個(gè)保守基序（Motif1和Motif3），所有基因編碼蛋白質(zhì)均包含保守基序Motif1和Motif3（圖2）。

2.3百香果SPL家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建及分析

擬南芥和百香果SPL家族基因編碼蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖3所示。從圖中可以看出，整個(gè)進(jìn)化樹(shù)被分為9個(gè)亞族。除Ⅶ亞族之外，其余8個(gè)亞族都含有百香果SPL家族成員。其中，Ⅰ、Ⅴ、Ⅷ和Ⅸ亞族中均含有3個(gè)百香果SPL家族成員，數(shù)量最多；其次是Ⅱ、Ⅳ和Ⅵ亞族，均含有2個(gè)百香果SPL家族成員；Ⅲ亞族中僅含有1個(gè)百香果SPL家族成員。

2.4百香果SPL家族基因的染色體定位與共線性分析百香果SPL家族基因的染色體定位和共線性關(guān)系如圖4所示。19個(gè)PeSPL基因定位在百香果的7條染色體上。其中，1號(hào)染色體上分布得最多，有12個(gè)成員，2號(hào)染色體上有2個(gè)成員，3號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)和9號(hào)染色體上各有1個(gè)成員。19個(gè)PeSPL基因間存在3對(duì)共線性基因?qū)Γ≒eSPL16與PeSPL18、PeSPL6與PeSPL9、PeSPL7與PeSPL8）。上述共線性關(guān)系說(shuō)明百香果SPL基因家族在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了基因復(fù)制，從而導(dǎo)致百香果SPL家族基因的多樣性。

2.5百香果SPL家族基因啟動(dòng)子順式作用元件分析百香果SPL家族基因啟動(dòng)子順式作用元件如圖5所示。從圖中可以看出，19個(gè)PeSPL基因啟動(dòng)子均具有光響應(yīng)元件。大多數(shù)PeSPL基因啟動(dòng)子具有激素響應(yīng)元件，如生長(zhǎng)素響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、脫落酸（ABA）響應(yīng)元件等，PeSPL10基因啟動(dòng)子具有5個(gè)生長(zhǎng)素響應(yīng)元件和12個(gè)茉莉酸甲酯響應(yīng)元件，PeSPL11基因啟動(dòng)子上含有7個(gè)脫落酸響應(yīng)元件。百香果SPL基因的啟動(dòng)子中，還存在大量與逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件，如低溫響應(yīng)元件、干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件等。除PeSPL14基因外，其他PeSPL基因啟動(dòng)子均具有厭氧誘導(dǎo)元件，PeSPL4基因啟動(dòng)子中有4個(gè)低溫響應(yīng)元件，PeSPL8基因啟動(dòng)子中有3個(gè)干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件。

2.6百香果SPL基因家族在低溫脅迫條件下的表達(dá)分析低溫脅迫下，百香果SPL家族基因的相對(duì)表達(dá)量如圖6所示。從圖中可以看出，8個(gè)PeSPL基因的相對(duì)表達(dá)量在低溫處理后呈現(xiàn)顯著或極顯著變化，其中PeSPL2、 PeSPL3、 PeSPL6、 PeSPL7、 PeSPL8 和PeSPL9 6個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著上升，PeSPL13 和PeSPL18 2個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量顯著下降，說(shuō)明這些基因可能參與了百香果響應(yīng)低溫的過(guò)程。*和**分別表示處理間差異顯著（P<0.05）和差異極顯著（P<0.01）。

3結(jié)論與討論

SPL基因家族已經(jīng)被證明在植物胚胎發(fā)育[29]、果實(shí)成熟[30]以及逆境脅迫響應(yīng)[19-21]中發(fā)揮重要作用。本研究利用同源比對(duì)與結(jié)構(gòu)域篩選相結(jié)合的方法從百香果基因組中鑒定出19個(gè)PeSPL家族基因。19個(gè)PeSPL的外顯子數(shù)目為2～11個(gè)，差異較大，這與蘋(píng)果[9]和甜橙[11]等作物中SPL家族成員外顯子數(shù)目差異大的特征一致。本研究還發(fā)現(xiàn)部分同屬于一個(gè)進(jìn)化亞族的PeSPL基因的結(jié)構(gòu)亦存在差異，例如PeSPL2和PeSPL4、PeSPL10和PeSPL14、PeSPL16和PeSPL18，原因可能是同一亞族內(nèi)的不同基因在進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)了外顯子的丟失或增加。此外，PeSPL蛋白的氨基酸長(zhǎng)度差異也較大，這可能會(huì)導(dǎo)致該基因家族成員的功能多樣性。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示百香果和擬南芥SPL家族成員可以分為9個(gè)亞族，與甜橙一致[11]。部分百香果SPL成員與擬南芥SPL成員親緣關(guān)系較近，例如PeSPL5、PeSPL11和PeSPL12與AtSPL6聚為1類(lèi)。Padmanabhan等[31]的研究結(jié)果表明，擬南芥AtSPL7基因在植物抗病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，推測(cè)與AtSPL7位于進(jìn)化樹(shù)同一亞族的PeSPL10也有類(lèi)似功能。對(duì)百香果SPL家族成員的染色體定位發(fā)現(xiàn)，除4號(hào)和8號(hào)染色體外，其余7條染色體上均有PeSPL基因，其中1號(hào)染色體上最多，共有12個(gè)。進(jìn)一步的共線性分析結(jié)果表明，PeSPL家族基因存在3對(duì)共線性基因，表明該家族在物種進(jìn)化中存在基因復(fù)制現(xiàn)象。本研究結(jié)果可為深入理解百香果SPL家族基因的進(jìn)化過(guò)程提供理論參考。

SPL基因家族在響應(yīng)植物逆境脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要功能。如水稻的OsSPL3基因通過(guò)正向調(diào)控OsWRKY71基因的表達(dá)進(jìn)而響應(yīng)低溫脅迫[32]，SPL9基因的過(guò)表達(dá)可提高CBF2基因的表達(dá)量進(jìn)而增強(qiáng)擬南芥植株的抗寒性[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，百香果SPL家族基因啟動(dòng)子上存在大量低溫、干旱等逆境響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件；實(shí)時(shí)定量PCR分析亦發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下有8個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量發(fā)生了顯著或極顯著變化，推測(cè)這些基因可能參與了百香果低溫響應(yīng)過(guò)程。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步解析百香果SPL基因的功能和作用機(jī)制、明確百香果SPL基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)機(jī)制提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：石春林）