低共熔溶劑提取綠茶中茶多酚工藝優(yōu)化及茶多酚提取液的抗氧化活性分析

摘要：低共熔溶劑（Deep eutectic solvents，DES）作為一種綠色環(huán)保、高效無(wú)毒溶劑而被廣泛應(yīng)用在生物提取和化學(xué)制備領(lǐng)域。本研究擬采用DES提取綠茶中多酚類物質(zhì)，首先合成5種不同類型的DES，進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）與黏度值的物理表征，并與以傳統(tǒng)水溶液、70%甲醇作為溶劑所得茶多酚提取率進(jìn)行比較，獲得最佳DES類型。然后，通過(guò)單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化用DES提取綠茶中茶多酚的工藝，并對(duì)提取前后的綠茶粉進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示，在提取過(guò)程中，當(dāng)氯化膽堿與乳酸（DES-2）的含水率為30%、提取溫度為75 ℃、提取時(shí)間29 min、料液比為1 g∶35 mL時(shí)，茶多酚提取率達(dá)25.16%，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果相符。掃描電子顯微鏡（SEM）和X射線衍射（XRD）結(jié)果顯示，在提取過(guò)程中茶粉的晶體結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化，但DES使茶粉表面形貌發(fā)生改變，使褶皺面增多，從而使茶粉與溶劑有更多接觸面積，有利于多酚類物質(zhì)的溶出。此外，將DES提取法與常用的超聲波乙醇提取法、微波水提取法、熱回流水提取法的結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，DES提取法在茶多酚提取率、部分兒茶素組分提取率上均具有顯著優(yōu)勢(shì)（P<0.05）。用不同提取方法所得茶多酚提取液進(jìn)行體外還原能力、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除活性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不同方法所得茶多酚提取液均表現(xiàn)出抗氧化活性并且其抗氧化活性呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，以DES法獲得的茶多酚提取液的抗氧化性最強(qiáng)，研究結(jié)果可為茶多酚提取及開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：低共熔溶劑；茶多酚；提取工藝；響應(yīng)面法；抗氧化活性

中圖分類號(hào)：S571.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2024）07-1330-13Process optimization of tea polyphenols extraction from green tea by deep eutectic solvents and analysis of antioxidant activityGAO Ziwen，JIA Zhitong，WANG Lihui，LIU Yuyan，XIE Zijing，LIU Yang，TENG Jie

（School of Agricultural Sciences， Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045， China）

Abstract：Deep eutectic solvents （DES） are widely used in biological and chemical fields as green， environmentally friendly， non-toxic and highly efficient solvents. In this study， deep eutectic solvents were used to extract polyphenols from green tea. Firstly， five different types of natural deep eutectic solvents were synthesized， and physical properties such as Fourier transform infrared spectroscopy （FT-IR） and viscosity values were characterized. Compared with extraction rates of tea polyphenols obtaining by using traditional water solution and 70% methanol organic solvent， the best DES type was acquired. Then， the single factor test and response surface Box-Behnken design test were used to optimize the extraction of green tea polyphenols based on DES， and the structure of green tea powder before and after extraction was analyzed. The results showed that when the moisture content of choline chloride and lactic acid （DES-2） was 30%， extraction temperature was 75 ℃， extraction time was 29 min， and solid-liquid ratio was 1∶35 （g/mL）， the extraction rate of tea polyphenols was 25.16%， which was consistent with the prediction of the model. The results of scanning electron microscopy （SEM） and X-ray diffraction （XRD） showed that the crystal structure of tea powder did not change significantly during the extraction process， but WC9IeqOsw1EQVT1x9L7MIDQToGL996BbCBvGrMHrwlw=the surface morphology of tea powder was changed greatly by DES， and more folds were formed on the surface of the tea powder， so that the tea powder had a larger contact area with the solvent， which was conducive to the dissolution of polyphenols. In addition， the DES extraction method was compared with the commonly used ultrasonic ethanol extraction method， microwave water extraction method， and hot reflux water extraction method. It was found that the DES extraction method had significant advantages in the extraction rates of tea polyphenols and some catechin components （P<0.05）. The tea polyphenol extracts obtained by different extraction methods were tested for in vitro reducing power and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） free radical scavenging activity. It was found that the tea polyphenol extracts obtained by different methods showed antioxidant activity and the antioxidant activity was dose-dependent. The tea polyphenol extract obtained by DES method had the strongest antioxidant activity. The results of this study can provide a theoretical basis for the extraction and development of tea polyphenols.

Key words：deep eutectic solvents （DES）;tea polyphenols;extraction technology;response surface methodology；antioxidant activity

綠茶中富含茶多酚、茶氨酸、黃酮類、生物堿等活性成分及其他微量元素，其中茶多酚是一種天然的抗氧化劑，具有抗氧化、抗輻射、抗菌、清除自由基等多種生物活性[1-2]，可用于果蔬保鮮[3]、調(diào)節(jié)人體腸道菌群、抑制肥胖[4]、消炎[5]、抗腫瘤[6]、干預(yù)阿爾茲海默病的發(fā)生[7]等。兒茶素類化合物（Catechins）作為茶多酚的主體成分，占其總量的50%～70%，包括兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、沒(méi)食子兒茶素（GC）、兒茶素沒(méi)食子酸酯（CG）、表沒(méi)食子兒茶素（EGC）、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（GCG）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）等，但是不同兒茶素組分之間的生物活性存在差異[8]。將茶多酚運(yùn)用到食品添加、醫(yī)療保健、日化用品等領(lǐng)域是當(dāng)前解決茶葉資源利用率低的問(wèn)題及提高茶葉附加價(jià)值的重要方式之一。

目前，茶多酚的提取方法主要是有機(jī)溶劑提取法、離子沉淀法、超聲波提取法等。溶劑提取法主要利用茶多酚易溶于水和醇類、酚類、酮類及酯類等的特性，可分為水浸提法和有機(jī)溶劑萃取法[9]。離子沉淀法主要利用茶多酚能夠與無(wú)機(jī)堿、鹽中的離子形成沉淀的特性[10]。超聲波提取法利用的是機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)，通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放量、擴(kuò)散速度及溶解性，從而高效提取綠茶中的多酚類物質(zhì)[11]。

低共熔溶劑（Deep eutectic solvents，DES）是由糖類、有機(jī)酸、氨基酸和膽堿衍生物等天然化合物按一定摩爾配比后在特定條件下形成的低熔點(diǎn)液態(tài)混合物[12]，具有低毒、提取目標(biāo)性明確、極性范圍廣、環(huán)境友好等特點(diǎn)，可作為許多天然活性成分的綠色萃取溶劑[13-14]。例如，王曉藝等[15]使用氯化膽堿-乳酸作為DES試劑，采用超聲輔助低共熔溶劑法提取玫瑰中的多酚，結(jié)果顯示，最佳多酚提取量為（136.20±1.23） mg/g，與乙醇提取法相比，多酚提取率提高了24%。古麗菲熱·伊力哈木等[16]采用氯化膽堿-蘋果酸提取新疆大果沙棗中的多酚類化合物，提取率為63.378 mg/g；倪玉嬌等[17]用氯化膽堿-草酸提取沙棘籽中的多酚類物質(zhì)，提取率為3.310%±0.008%；汪濤等[18]用氯化膽堿-草酸提取核桃青皮多酚，提取量為50.87 mg/g，比水溶液提取法、乙醇溶液提取法的效果好。在現(xiàn)階段低端茶尤其是綠茶產(chǎn)量相對(duì)過(guò)剩的情況下，為推動(dòng)茶葉深加工及茶多酚的開(kāi)發(fā)利用、減少資源浪費(fèi)，本研究擬利用DES替代傳統(tǒng)方法提取綠茶中的茶多酚，以獲得較佳提取工藝，同時(shí)擬通過(guò)比較常用茶多酚提取方法的提取率及兒茶素的穩(wěn)定性，為茶多酚的開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

本研究所用綠茶于2022年6月產(chǎn)自江西省婺源縣正稀茗茶有限公司，原料為一芽二葉。

福林酚、沒(méi)食子酸、氯化膽堿、甜菜堿、乙二醇、L-（+）-乳酸、甘油、檸檬酸、甲醇、三氯化鐵、鐵氰化鉀等，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；8個(gè)兒茶素組分原料（>99%），購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

Nicolet iS50型傅里葉變換紅外光譜儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；SmartLab型X射線衍射儀（XRD），購(gòu)自日本Rigaku公司；JSM-6010LA掃描電子顯微鏡，購(gòu)自日本電子株式會(huì)社；LC-16高效液相色譜儀，購(gòu)自日本島津公司；UV1901PCS紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DES體系的制備在DES體系中，氫鍵的受體、供體組合如下：氯化膽堿（ChCl）為氫鍵受體，乙二醇、乳酸、甘油為氫鍵供體；甜菜堿（Bet）為氫鍵受體，檸檬酸、乳酸為氫鍵供體。按照上述組合合成5種體系的DES。將經(jīng)過(guò)真空干燥的各組分按照氫鍵受體∶氫鍵供體=1∶2的摩爾比混合，在加熱條件下用磁力攪拌至形成均勻的混合液，將混合液在干燥器中儲(chǔ)存?zhèn)溆茫唧w配制體系及常溫下的熔融狀態(tài)見(jiàn)表1。

1.2.2DES的表征（1）傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）的測(cè)定。將 DES 用少許無(wú)水乙醇稀釋，然后滴加適量稀釋液于溴化鉀壓片上，干燥后用傅里葉變換紅外光譜儀在400～4 000 cm-1 范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，以溴化鉀作為空白對(duì)照。

（2）黏度的測(cè)定。用黏度計(jì)測(cè)定黏度，首先選擇合適的轉(zhuǎn)子，將待測(cè)低共熔溶劑在不同溫度（80 ℃、70 ℃、60 ℃、50 ℃、40 ℃、30 ℃）的水浴鍋中放置10 min后，趁熱倒入樣品器中，確保溶劑完全浸沒(méi)轉(zhuǎn)子后進(jìn)行測(cè)試并讀取數(shù)值，測(cè)量重復(fù)3次。

1.2.3DES類型的篩選稱取0.5 g綠茶粉置于試管中，分別加入15 mL制備的5種含水率為30%的低共熔溶劑，混勻后置于水浴鍋中進(jìn)行提取。提取條件如下：溫度70 ℃，時(shí)間60 min，料液比1 g∶30 mL，將提取液于4 500 r/min離心10 min后取上清液。

1.2.4單因素試驗(yàn)稱取0.25 g綠茶粉加入方法1.2.3篩選到的最佳類型DES中，分別考察單因素試驗(yàn)的含水率（10%、20%、30%、40%、50%）、提取溫度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃）、提取時(shí)間（20 min、40 min、60 min、80 min、100 min）、料液比（1 g∶20 mL、1 g∶30 mL、1 g∶40 mL、1 g∶50 mL）對(duì)綠茶中茶多酚提取率的影響。

1.2.5響應(yīng)面優(yōu)化茶多酚提取工藝以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取影響較大的提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）為響應(yīng)因子，用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行擬合，以優(yōu)化綠茶中茶多酚的提取工藝，因素和水平的設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

1.2.6不同茶多酚提取方法的比較參照綠茶中茶多酚的不同提取方法，使用微波水浸提法[19]、超聲波乙醇提取法[20]和熱回流水提取法[21]中的最佳提取工藝參數(shù)，比較綠茶粉中茶多酚、兒茶素的組分含量。

1.2.7茶多酚、兒茶素組分含量的測(cè)定方法茶多酚含量的測(cè)定使用福林酚比色法，以沒(méi)食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品[22]。兒茶素組分含量使用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定，流動(dòng)相A為含0.5%三氟乙酸的水溶液，B相為甲醇。采用梯度洗脫，B相參數(shù)：8.00%，0～8.00 min；8.01%～13.00%，8.01～20.00 min；13.01%～34.99%，20.01～40.00 min；35.00%，40.01～45.00 min。柱溫為35 ℃，上樣量為10 μL，于278 nm進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積計(jì)算各兒茶素組分的含量。

1.2.8茶多酚提取液抗氧化活性的測(cè)定

1.2.8.1還原能力的測(cè)定配制10～120 μg/mL系列質(zhì)量濃度的茶多酚提取物，分別用0.1 mL pH值為6.5、濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液和0.1 mL 1％ K3Fe（CN）6。將反應(yīng)液于50 ℃孵育20 min后加入0.1 mL三氯乙酸中，于4 500 r/min離心10 min。取0.1 mL上清液，用0.1 mL純水稀釋，再向稀釋液中添加25 μL 0.1% FeCl3。以維生素C溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，記錄700 nm處的吸光度[23]。

1.2.8.2清除DPPH自由基活性的測(cè)定配制10～120 μg/mL系列質(zhì)量濃度的茶多酚提取溶液，分別添加到2.9 mL DPPH自由基溶液中。將反應(yīng)混合物于室溫避光孵育30 min后在517 nm處測(cè)定吸光度。以等質(zhì)量濃度的維生素C溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，按照如下公式計(jì)算茶多酚提取溶液對(duì)DPPH自由基的清除活性[24]：

DPPH自由基清除率=（1-A）／A×100% （1）

式中：A表示DPPH自由基溶液在乙醇中的吸光度；A表示DPPH自由基溶液在測(cè)試樣品中的吸光度。

2結(jié)果與分析

2.1低共熔溶劑（DES）的表征

2.1.1傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析如圖1a所示，氯化膽堿、乙二醇分別在FT-IR圖譜的3 249 cm^-1、3 297 cm-1處有吸收谷，這些吸收谷主要是由羥基振動(dòng)產(chǎn)生的，DES-1中由O-H振動(dòng)產(chǎn)生的吸收谷移動(dòng)至3 300 cm-1處，表明氯化膽堿與乙二醇之間形成了O-H…O（羥基…氧離子）、O-H…Cl（羥基…氯離子）等氫鍵結(jié)構(gòu)。如圖1b所示，乳酸在3 403 cm^-1處出現(xiàn)較弱的O-H 伸縮振動(dòng)吸收帶，在1 719 cm^-1處出現(xiàn)C=O（羰基）的伸縮振動(dòng)吸收谷，在DES-2中上述吸收谷分別紅移至3 302 cm-1、1 731 cm-1處，說(shuō)明ChCl和乳酸之間有氫鍵締合作用。如圖1c所示，甘油在3 285 cm^-1處存在由O-H振動(dòng)產(chǎn)生的吸收谷，在DES-3中此峰移至3 309 cm^-1處，說(shuō)明在DES-3中氯化膽堿與甘油之間存在氫鍵締合作用。如圖1d所示，甜菜堿、檸檬酸分別在3 368 cm^-1、3 495 cm^-1處存在O-H伸縮振動(dòng)吸收帶，檸檬酸在1 696 cm-1處有1個(gè)較強(qiáng)烈的羰基伸縮振動(dòng)區(qū)；此外，檸檬酸在3 294 cm^-1、2 560 cm^-1處各有1個(gè)較寬的吸收谷，可能由于檸檬酸形成二聚體后，羥基的伸縮振動(dòng)向低波數(shù)方向位移；在DES-4中，O-H的伸縮振動(dòng)吸收帶紅移至2 954 cm-1處，且吸收谷變?nèi)?，羰基伸縮振動(dòng)帶紅移至1 713 cm^-1處，表明在DES-4中甜菜堿與檸檬酸之間有氫鍵締合作用。如圖1e所示，乳酸在3 403 cm-1附近有較弱的O-H 伸縮振動(dòng)吸收帶，在1 719 cm-1處有C=O（羰基）的伸縮振動(dòng)吸收谷，而在DES-5中上述吸收區(qū)及吸收谷分別紅移至3 358 cm^-1、1 723 cm^-1處，說(shuō)明甜菜堿和乳酸之間形成了氫鍵。上述結(jié)果表明，本試驗(yàn)選取的5種DES均制備成功。

2.1.2黏度DES具有很高黏度，主要由于DES體系中各組分間存在較大的氫鍵作用力、范德華力及靜電作用力，因此其流動(dòng)性差，黏度較高[25]。DES的黏度與溫度、含水量有很大關(guān)系，一般離子液體黏度與溫度間存在指數(shù)關(guān)系，即黏度隨著溫度的升高呈指數(shù)性下降趨勢(shì)[26]。由于本研究已在單因素試驗(yàn)中討論了含水率對(duì)DES提取綠茶粉中茶多酚效果的影響，因此本試驗(yàn)僅在不同溫度下測(cè)定各低共熔溶劑的黏度。如圖 2所示，DES的黏度隨溫度的增高而下降，除DES-4外的所有類型DES的黏度均在250 mPa·s以下，且黏度隨溫度的變化較平緩、均勻。不同黏度值的排序?yàn)镈ES-2>DES-3>DES-1>DES-5，且DES-2與DES-3的黏度隨溫度下降的曲線相對(duì)于DES-1、DES-5的黏度隨溫度下降的曲線更陡峭，表明DES-2與DES-3的黏度受溫度影響較大。DES-4具有高黏度，其黏度與溫度間存在明顯的指數(shù)關(guān)系；在接近30 ℃的條件下，其黏度達(dá)到6 500 mPa·s，似黏稠膠水狀；當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)，其黏度急劇下降至1 757 mPa·s，隨后隨著溫度的升高，其黏度的變化趨于平緩。盡管如此，在80 ℃條件下，DES-4的黏度也高達(dá)253 mPa·s，超過(guò)30 ℃時(shí)其他4種類型溶劑的黏度。

另外，DES溶劑的黏度隨溫度的變化符合Arrhenius方程：

lnη=lnη-E／RT （2）

式中，η為黏度（mPa·s），η為指前因子（mPa·s），E為活化能（kJ/mol），R為摩爾氣體常量，T為熱力學(xué)溫度（K）。

由公式（2）可以得到如圖3所示溫度的倒數(shù)與黏度的擬合曲線。由圖3、表3可以看出，lnη與1/T呈明顯的線性相關(guān)，DES的黏度符合阿倫尼烏斯方程，且5種DES對(duì)溫度的依賴程度排序?yàn)镈ES-4>DES-2>DES-3>DES-1>DES-5。

2.2DES溶劑的篩選

以茶多酚提取率為指標(biāo)，篩選出對(duì)綠茶粉中茶多酚提取效果最好的DES。在相同提取條件（提取溫度為70 ℃，提取時(shí)間為60 min，料液比為1 g∶30 mL，含水率為30%）下，5種DES對(duì)綠茶粉中茶多酚的提取效果均優(yōu)于純水；DES-2、DES-5對(duì)綠茶粉中茶多酚的提取效果均優(yōu)于70%甲醇溶液且具有顯著差異（P<0.05），其中DES-2（氯化膽堿與乳酸構(gòu)成的低共熔溶劑體系）對(duì)綠茶粉中茶多酚的提取率最高，為25.70%，DES-2、DES-5體系對(duì)綠茶粉中茶多酚的提取率無(wú)顯著差異（圖4）?？紤]到經(jīng)濟(jì)效益，氯化膽堿較甜菜堿的價(jià)格更具優(yōu)勢(shì)，且在常溫下就可儲(chǔ)藏，因此在后續(xù)試驗(yàn)中選擇氯化膽堿-乳酸體系（DES-2）作為提取綠茶粉中茶多酚的溶劑。

2.3單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1DES-2含水率的影響由圖5可以看出，隨著DES-2含水率的提高，綠茶粉中茶多酚的提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)DES-2含水率為30%時(shí)，綠茶粉中茶多酚的提取率為26.67%；當(dāng)DES-2含水率分別為20%、40%時(shí)，綠茶粉中茶多酚的提取率分別為25.34%、25.24%，上述3個(gè)茶多酚提取率之間無(wú)顯著差異（P>0.05）。當(dāng)DES-2含水率為10%、50%時(shí)，綠茶粉中的茶多酚提取率無(wú)顯著差異（P>0.05），且DES-2含水率為10%、50%時(shí)的茶多酚提取率與DES-2含水率為30%時(shí)的茶多酚提取率之間無(wú)顯著差異（P>0.05）。當(dāng)DES-2含水率超過(guò)30%并上升至50%時(shí)，綠茶粉中茶多酚的提取率反而下降，可能由于水中的H+、OH-離子氫鍵過(guò)多，使得低共熔溶劑間的氫鍵作用逐漸減弱甚至完全消失[27]，從而導(dǎo)致綠茶粉中茶多酚從固體到液體之間的傳質(zhì)速率降低。上述結(jié)果表明，當(dāng)DES-2含水率為30%時(shí)，用于提取綠茶粉中茶多酚的效果最佳。

不同處理間標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.3.2提取溫度的影響如圖6所示，當(dāng)提取溫度為50～70 ℃時(shí)，綠茶粉中茶多酚的提取率隨提取溫度的升高而上升；隨著提取溫度繼續(xù)升高至80 ℃，綠茶粉中茶多酚的提取率下降，可能由于當(dāng)提取溫度過(guò)高時(shí)，使多酚類物質(zhì)的氧化加劇。當(dāng)提取溫度為70 ℃時(shí)，綠茶粉中茶多酚提取率最高（25.95%），并與其他提取溫度所得茶多酚提取率之間存在顯著差異（P<0.05）；當(dāng)提取溫度為40～50 ℃時(shí)，綠茶粉中茶多酚提取率隨溫度的變化不顯著（P>0.05）；當(dāng)提取溫度為80 ℃時(shí)，綠茶粉中茶多酚的提取率下降至21.80%，但仍高于提取溫度為60 ℃時(shí)的20.30%提取率（P<0.05）。綜上，以70 ℃作為DES提取綠茶粉中茶多酚的最適溫度。

不同處理間標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.3.3提取時(shí)間的影響如圖7所示，隨著提取時(shí)間的增加，綠茶粉中茶多酚的提取率呈現(xiàn)先顯著升高后緩慢降低的趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí)，綠茶粉中的茶多酚提取率達(dá)到最高值26.10%；當(dāng)提取時(shí)間為20 min時(shí)，綠茶粉中茶多酚的提取率最低，為21.58%，但是當(dāng)提取時(shí)間延長(zhǎng)至80 min、100 min時(shí)，綠茶粉中茶多酚的提取率與提取時(shí)間為20 min相比并無(wú)顯著變化（P>0.05）。上述結(jié)果表明，延長(zhǎng)提取時(shí)間對(duì)提高綠茶粉中茶多酚的提取率并不能起到顯著的促進(jìn)作用，綜合比較后選擇40 min作為綠茶粉中茶多酚的最適提取時(shí)間。

不同處理間標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.3.4料液比的影響由圖8可知，當(dāng)料液比為1 g∶30 mL時(shí)，綠茶粉中茶多酚的提取率最高，達(dá)26.57%（P<0.05）；隨著料液比由1 g∶30 mL減小至1 g∶40 mL，提取率顯著下降；當(dāng)料液比為1 g∶50 mL時(shí)，綠茶粉中的茶多酚提取率最低（23.17%），但與料液比為1 g∶20 mL、1 g∶40 mL時(shí)的提取率相比無(wú)顯著差異，可能由于當(dāng)料液比減小時(shí)，綠茶粉未得到完全浸提，但當(dāng)料液比較高時(shí)，綠茶粉中的茶多酚提取率較低是由于DES對(duì)綠茶粉中茶多酚的提取達(dá)到飽和狀態(tài)，繼續(xù)提高料液比會(huì)導(dǎo)致從綠茶粉中提取的茶多酚從DES中凝聚到待提取物中[28]。綜上，料液比1 g∶30 mL最合適。不同處理間標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.4響應(yīng)面模型的建立與分析

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合原理研究提取溫度、提取時(shí)間、料液比等獨(dú)立變量對(duì)綠茶粉中茶多酚提取率的影響。為了驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。完整的試驗(yàn)設(shè)計(jì)由17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)組成，包括5組中心點(diǎn)的驗(yàn)證，并按隨機(jī)順序?qū)λ性O(shè)計(jì)點(diǎn)進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)后取均值。綠茶粉中的茶多酚提取率用二階多項(xiàng)式表達(dá)如下：

Y=β+ΣβX+ΣβX²+ΣΣβXX （3）

式中：Y為綠茶粉中茶多酚提取率的預(yù)測(cè)值；β為常數(shù)；β為線性系數(shù)；β為二次系數(shù)；β為交互式術(shù)語(yǔ)系數(shù)；X、X表示2個(gè)獨(dú)立變量。試驗(yàn)運(yùn)行結(jié)果如表4所示。

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到綠茶粉中茶多酚提取率與各試驗(yàn)因子編碼值的回歸模型方程為：

Y=25.50+0.46A-0.84B+0.49C-0.26AB-0.01AC+0.27BC-0.63A²-1.29B²-0.49C² （4）

式中：Y為茶多酚提取率；A為提取溫度編碼值；B為提取時(shí)間編碼值；C為料液比編碼值。方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。

如表5所示，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腜<0.000 1，具有極顯著影響；失擬項(xiàng)的P=0.681 1>0.050 0，影響不顯著，說(shuō)明該模型具有很高的可信度[29]。所有響應(yīng)變量的模型的決定系數(shù)（R2）均超過(guò)0.900 0，表明模型的擬合性良好[30]。本試驗(yàn)中選擇的3個(gè)因子對(duì)綠茶粉中茶多酚提取率的影響程度排序?yàn)椋築（提取時(shí)間）>C（料液比）>A（提取溫度）。一次項(xiàng)（A、B、C）在統(tǒng)計(jì)學(xué)上表現(xiàn)出極顯著影響；二次項(xiàng)（A2、B2、C2）也表現(xiàn)出極顯著影響；交互項(xiàng)AB、BC之間呈顯著影響。決定系數(shù)（R2）為0.987 3，表明響應(yīng)值的變化98.73%來(lái)源于所選取的變量。校正后的決定系數(shù)（R2adj）為0.970 9，表明97.09%的響應(yīng)值變化可以用該模型解釋；變異系數(shù)為0.79>0.05，表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)無(wú)顯著性差異，其精確性、重復(fù)性均較好。上述結(jié)論均表明，本試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臄M合程度高，可用于分析并預(yù)測(cè)DES-2提取綠茶粉中茶多酚的提取率。

2.5響應(yīng)面圖分析與回歸模型的驗(yàn)證

2.5.1響應(yīng)面圖分析響應(yīng)面的等高線形狀能顯示2個(gè)交互因素之間的相互作用情況。若等高線呈橢圓形或馬鞍形，說(shuō)明2個(gè)因素間的交互作用明顯；若等高線呈圓形，說(shuō)明2個(gè)因素之間的交互作用不明顯[31]。由圖9a可知，提取溫度、提取時(shí)間對(duì)綠茶粉中茶多酚提取率影響的響應(yīng)面表現(xiàn)為曲度陡峭度大，且等高線呈橢圓形，說(shuō)明二者間交互作用明顯，提取溫度的曲面陡峭度比提取時(shí)間的曲面陡峭度大，說(shuō)明提取溫度對(duì)綠茶粉中茶多酚提取率的影響更大。由圖9b可知，提取溫度與料液比間的等高線近似圓形，表明二者之間的交互作用并不明顯。由圖9c可知，提取時(shí)間、料液比對(duì)綠茶粉中茶多酚提取率影響的響應(yīng)面表現(xiàn)為曲面陡峭度大，且等高線呈橢圓形，說(shuō)明二者的交互作用明顯，并且料液比曲面更陡峭，表明料液比對(duì)綠茶粉中茶多酚提取率的影響較提取時(shí)間明顯。

2.5.2回歸模型的驗(yàn)證通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到DES提取綠茶粉中茶多酚的最佳工藝參數(shù)如下：提取溫度74.64 ℃，提取時(shí)間 28.775 min，料液比1 g∶34.85 mL。在最佳工藝參數(shù)條件下，綠茶粉中茶多酚的提取率為25.498%。為了便于實(shí)際操作，優(yōu)化后的工藝技術(shù)參數(shù)如下：提取溫度75.00 ℃，提取時(shí)間29.000 min，料液比1 g∶35.00 mL，在此參數(shù)下進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證，得到綠茶粉中茶多酚的平均提取率為25.160%，與理論值接近，表明基于Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化低共熔溶劑提取綠茶粉中茶多酚的工藝可靠。

2.6用DES提取茶多酚前后綠茶粉樣品的結(jié)構(gòu)分析2.6.1XRD分析如圖10所示，用70%甲醇溶液、DES-2處理綠茶粉后，各晶體的XRD結(jié)構(gòu)與原茶粉基本相同，表明在提取過(guò)程中綠茶粉的晶體結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化。但是研究發(fā)現(xiàn)，用70%甲醇溶液、DES-2處理后，綠茶粉的結(jié)晶度略高于未處理的綠茶粉，且用DES-2處理的綠茶粉的結(jié)晶度高于用70%甲醇溶液處理的綠茶粉的結(jié)晶度，原因可能是DES對(duì)綠茶粉有一定的凝結(jié)作用[32]。

2.6.2SEM分析用SEM對(duì)用70%甲醇溶液及用DES-2提取后的綠茶粉樣品進(jìn)行表征分析，觀察提取前后綠茶粉外形結(jié)構(gòu)的變化。如圖11所示，在未經(jīng)處理的條件下，綠茶粉呈現(xiàn)團(tuán)粒結(jié)構(gòu)且表面光滑；用70%甲醇溶液處理后，綠茶粉的團(tuán)聚程度降低，表面松散粘連；用DES-2處理后，綠茶粉的團(tuán)粒結(jié)構(gòu)幾乎消失且顆粒表面有類似腸壁的褶皺，該結(jié)構(gòu)可增加茶樣與DES間的接觸面積，有利于綠茶粉中茶多酚被浸提溶出。

2.7不同提取方法所得綠茶粉中茶多酚、兒茶素組分提取率在DES提取法與其他提取方法均采用最佳參數(shù)的條件下，用相同綠茶原料進(jìn)行試驗(yàn)并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。如圖12所示，不同提取方法所得綠茶粉中茶多酚提取率的整體排序如下：氯化膽堿+乳酸（DES-2）提取法>超聲波乙醇提取法>微波水提取法>熱回流水提取法。用DES-2提取法所得綠茶粉中茶多酚的提取率最高，為25.16％，而用熱回流水提取法所得綠茶粉中茶多酚的提取率最低，為18.74％。在各提取方法中，以DES-2提取法對(duì)有效成分兒茶素的提取量最多，可為有效成分的溶出提供良好的溶劑體系。此外研究發(fā)現(xiàn)，在高溫長(zhǎng)時(shí)間提取條件下，茶多酚尤其是兒茶素類容易被氧化，并可能產(chǎn)生咖啡因和蛋白質(zhì)的絡(luò)合物，從而降低茶多酚的得率、生物活性。

2.8綠茶中茶多酚的抗氧化活性

2.8.1相對(duì)還原能力如圖13a所示，各提取方法所得綠茶中茶多酚提取液和維生素C的相對(duì)還原力（OD700）與測(cè)試質(zhì)量濃度之間遵循劑量依賴關(guān)系，且相對(duì)還原能力隨著綠茶中茶多酚提取物質(zhì)量濃度的增加而遞增，但以DES提取方法所得綠茶中茶多酚的相對(duì)還原能力最強(qiáng)，接近對(duì)照（維生素C）的相對(duì)還原能力。

同一類物質(zhì)的不同處理間標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。EC：表兒茶素；EGC：表沒(méi)食子兒茶素；ECG：表兒茶素沒(méi)食子酸酯；EGCG：表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯；GCG：沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯；CG：兒茶素沒(méi)食子酸酯；C：兒茶素；GC：沒(méi)食子兒茶素。

2.8.2對(duì)DPPH自由基的清除活性如圖13b所示，茶多酚對(duì)DPPH自由基的清除率先隨樣品質(zhì)量濃度的增加而增大，隨后趨于平衡。茶多酚質(zhì)量濃度與對(duì)DPPH自由基的清除率間呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。當(dāng)茶多酚質(zhì)量濃度為120 μg/mL時(shí)，DES提取液、超聲波乙醇提取液、微波水提取液和熱回流水提取液對(duì)DPPH自由基的清除活性分別為94.03%、79.63%、73.66%、63.58%。IC50 值表示對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到一半時(shí)抗氧化劑的質(zhì)量濃度，其值越小，表明其抗氧化能力越強(qiáng)，在本研究中，IC50 值的排序如下：維生素C<DES<超聲波乙醇提取法<微波水提取法<熱回流水提取法，可見(jiàn)以DES提取法得到的綠茶中茶多酚提取液的活性最強(qiáng)。

3討論

目前，常用的茶多酚提取方法有溶劑提取法、超聲波提取法、離子沉淀法等，其中溶劑提取法工藝簡(jiǎn)便、成本低廉，但茶多酚的萃取率較低。盡管利用有機(jī)溶劑萃取可以提高茶多酚的提取率，但提純程度不高，需要進(jìn)行多次分離，且步驟較繁瑣，存在一定的安全隱患[9]。離子沉淀法具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，但在生產(chǎn)過(guò)程中容易殘留金屬離子，提取出的茶多酚制成品易造成安全隱患[10]。超聲波提取法具有快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，但多酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)容易在浸提過(guò)程中被破壞[11]。相比于傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑，DES可與酚類物質(zhì)形成氫鍵，從而獲得更高提取量，并能保持酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性[33]。

DES含水率對(duì)提取效果影響的原理主要是離子水之間可以形成氫鍵，從而降低溶劑的黏度，進(jìn)而提高茶多酚從茶樣中到低共熔溶液中的傳質(zhì)速率[34]。此外，多酚類物質(zhì)具有多個(gè)羥基，屬于極性物質(zhì)，水可增加DES的極性，從而促進(jìn)生物資源中極性化合物的溶解[16]。提取條件對(duì)提取率的影響也很大，提高提取溫度可以促進(jìn)物質(zhì)的熱運(yùn)動(dòng)，使多酚類物質(zhì)更快、更多地析出，但是溫度過(guò)高會(huì)使茶多酚的提取率下降，因?yàn)楦邷貢?huì)使多酚類物質(zhì)氧化加劇，從而使其失去活性。料液比也對(duì)提取率有影響，合適的料液比不僅能夠提高茶多酚的有效提取率，還能促進(jìn)溶劑的最大化利用。XRD分析、SEM分析結(jié)果均表明，DES-2對(duì)茶粉表面結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定影響，使綠茶粉更易與溶劑接觸，從而使其有效成分能夠更好地浸提析出。此外，在抗氧化活性方面，利用DES提取所得茶多酚的還原能力較好且對(duì)DPPH自由基的清除活性也很高，具有Qk6+dsalZvmb75SWKuRL5g==很強(qiáng)的抗氧化性，原因是由于DES內(nèi)產(chǎn)生的氫鍵對(duì)茶多酚具有保護(hù)作用，使其在提取過(guò)程中不被氧化破壞，從而保持較高的生物活性。

4結(jié)論

本研究建立了一種從綠茶中高效提取茶多酚的工藝方法。制備的5種DES經(jīng)過(guò)FT-IR分析證實(shí)被成功合成。通過(guò)比較用純水、70%甲醇溶液和不同DES提取綠茶中茶多酚的提取率發(fā)現(xiàn)，由ChCl-乳酸合成的DES的提取效果較好，在含水率為30%、提取溫度為75 ℃、提取時(shí)間為29 min、料液比為1 g∶35 mL的條件下，茶多酚的提取率為25.16%。提取前后綠茶粉的XRD圖、SEM圖結(jié)果表明，與傳統(tǒng)溶劑相比，DES作為溶劑提取綠茶中的多酚類化合物時(shí)，茶粉的晶體結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生明顯變化，但表面形貌特征發(fā)生褶皺，表面積增大，從而有利于茶多酚類物質(zhì)的溶出，提高提取率。同時(shí)，與常用的超聲波提取法、微波提取法、熱回流提取法相比，DES提取法在茶多酚提取率、兒茶素組分穩(wěn)定性上均具有顯著優(yōu)勢(shì)，且該提取法獲得的茶多酚體外還原能力、對(duì)DPPH自由基的清除活性均較好。由研究結(jié)果可知，DES提取法避免了使用傳統(tǒng)有毒有害溶劑，且提取效果遠(yuǎn)優(yōu)于常用提取方法，具有綠色、便捷、高效等優(yōu)點(diǎn)，可為DES代替?zhèn)鹘y(tǒng)有機(jī)溶劑進(jìn)行天然產(chǎn)物的提取研究提供可行性依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]曠春桃，李湘洲，汪玉霞，等. 大葉冬青葉中總黃酮測(cè)定方法和提取工藝研究[J]. 食品科學(xué)，2009，30（6）：49-51.

[2]HONG M Y， YU J， WANG X P， et al. Tea polyphenols as prospective natural attenuators of brain aging[J]. Nutrients，2022，14（15）：3012.

[3]李振，張秀玲，張文濤，等. 1-甲基環(huán)丙烯熏蒸結(jié)合茶多酚涂膜處理對(duì)蕨菜保鮮效果的影響[J]. 食品科學(xué)，2021，42（19）：218-225.

[4]張志勇，李婷，朱慧芳，等. 茶多酚調(diào)節(jié)腸道菌群及抗肥胖作用研究進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2023，14（2）：161-167.

[5]林德，吳寧俊，劉五高，等. 亞抑菌濃度茶多酚對(duì)肺炎克雷伯菌的影響[J]. 中國(guó)消毒學(xué)雜志，2023，40（1）：18-20.

[6]李光達(dá)，王婧，許晶，等. 基于免疫調(diào)節(jié)探討茶多酚及表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯的抗腫瘤機(jī)制[J]. 中國(guó)藥房，2022，33（24）：3067-3072.

[7]WANG M， YANG X T， GAO Y L， et al. Computer-aided screening and revealing action mechanism of green tea polyphenols intervention in Alzheimer’s disease[J]. Foods，2023，12（3）：635.

[8]ZHANG X N， LI J， LI Y H， et al. Anti-melanogenic effects of epigallocatechin-3-gallate （EGCG），epicatechin-3-gallate （ECG） and gallocatechin-3-gallate （GCG） via down-regulation of cAMP/CREB/MITF signaling pathway in B16F10 melanoma cells[J]. Fitoterapia，2020，145：104634.

[9]王玉春. 茶多酚的提取方法及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 甘肅聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，22（3）：51-55.

[10]胡玲玲，張超霞，韓麗麗，等. 沉淀法提取茶葉廢料中茶多酚的工藝研究[J]. 廣州化工，2011，39（11）：64-65.

[11]宋傳奎，肖斌，王艷麗，等. 超聲波輔助提取茶多酚工藝條件的優(yōu)化[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，39（5）：133-139，146.

[12]宣婧婧，武喜營(yíng)，戚建平，等. 天然低共熔溶劑在藥劑學(xué)中的應(yīng)用[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2021，56（1）：146-157.

[13]屠羽佳，李林楠，范文翔，等. 基于機(jī)械化學(xué)輔助-低共熔溶劑的人參皂苷綠色提取新方法研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，2022，47（23）：6409-6416.

[14]馮智翱，楊丹，薄彧坤，等. 天然低共熔溶劑提取梔子中活性成分的工藝研究[J]. 現(xiàn)代化工，2022，42（增刊2）：258-262，268.

[15]王曉藝，李培坤，李錦紅，等. 超聲輔助低共熔溶劑提取玫瑰多酚及其抗氧化活性[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)，2022，43（8）：98-105.

[16]古麗菲熱·伊力哈木，馬夢(mèng)亞，艾斯卡爾·吐?tīng)栠d，等. 超聲輔助低共熔溶劑法提取新疆大果沙棗多酚類化合物及其抗氧化活性研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2023，49（18）：186-194.

[17]倪玉嬌，趙春建，李春英，等. 超聲輔助低共熔溶劑提取沙棘籽粕多酚的工藝優(yōu)化[J]. 植物研究，2017，37（3）：474-480.

[18]汪濤，梁亮，李旭銳，等. 低共熔溶劑提取核桃青皮多酚工藝優(yōu)化及其抑菌活性[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2021，37（5）：317-323.

[19]NKHILI E， TOMAO V， EL HAJJI H， et al. Microwave-assisted water extraction of green tea polyphenols[J]. Phytochemical Analysis，2009，20（5）：408-415.

[20]都昌樂(lè)，楊紫雨，陳貝言，等. 超聲波輔助乙醇提取茶多酚工藝的正交優(yōu)化研究[J]. 安徽理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2022，42（4）：29-34.

[21]蔣麗，王雪梅，全學(xué)軍，等. 不同提取方法對(duì)茶多酚理化性質(zhì)的影響[J]. 食品科學(xué)，2010，31（14）：136-139.

[22]楊春妹，李志明，范先婷，等. 福林酚比色法測(cè)定海藻多酚的反應(yīng)條件優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2023，39（1）：238-245.

[23]程爽，賀斐，付龍洋，等. 冬凌草硒多糖的制備及其抗氧化活性分析[J]. 精細(xì)化工，2021，38（10）：2064-2071.

[24]阮懌航，吳亮宇，魯靜，等. 低共熔溶液提取鐵觀音茶多酚工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2020，35（2）：217-225.

[25]唐超凡. 氯化膽堿低共熔溶劑理化性質(zhì)及其在預(yù)處理纖維素和黃酮提取應(yīng)用中的研究[D]. 鎮(zhèn)江：江蘇大學(xué)，2021.

[26]張歡歡，劉玉婷，李戎，等. 新型低共熔溶劑的制備、表征及物性研究[J]. 化學(xué)通報(bào)，2015，78（1）：73-79.

[27]DAI Y T， WITKAMP G J， VERPOORTE R， et al. Tailoring properties of natural deep eutectic solvents with water to facilitate their applications[J]. Food Chemistry，2015，187：14-19.

[28]FU X Z， BELWAL T， HE Y H， et al. UPLC-Triple-TOF/MS characterization of phenolic constituents and the influence of natural deep eutectic solvents on extraction of Carya cathayensis Sarg. peels：composition，extraction mechanism and in vitro biological activities[J]. Food Chemistry，2022，370：131042.

[29]ZHANG G W， HU M M， HE L， et al. Optimization of microwave-assisted enzymatic extraction of polyphenols from waste peanut shells and evaluation of its antioxidant and antibacterial activities in vitro[J]. Food and Bioproducts Processing，2013，91（2）：158-168.

[30]MANSUR A R， SONG N E， JANG H W， et al. Optimizing the ultrasound-assisted deep eutectic solvent extraction of flavonoids in common buckwheat sprouts[J]. Food Chemistry，2019，293：438-445.

[31]趙敏，戰(zhàn)祥，徐茜，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化五倍子多酚的提取工藝[J]. 湖北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2023，45（2）：294-300.

[32]黃文睿，唐超凡，陶雨峰，等. 綠色低共熔溶劑提取野菊花中黃酮類化合物[J]. 精細(xì)化工，2022，39（3）：569-576.

[33]FU X Z， WANG D， BELWAL T， et al. Natural deep eutectic solvent enhanced pulse-ultrasonication assisted extraction as a multi-stability protective and efficient green strategy to extract anthocyanin from blueberry pomace[J]. LWT，2021，144：111220.

[34]李海飛，楊毅，亓雨芮，等. 超聲波輔助酸性天然低共熔溶劑提取黑果腺肋花楸花青素及其穩(wěn)定性和抗氧化活性分析[J]. 食品工業(yè)科技，2023，44（8）：259-269.（責(zé)任編輯：徐艷）