綿羊基質Gla蛋白基因克隆、表達譜及其在卵巢組織的定位

摘要：本研究旨在克隆綿羊基質Gla蛋白（MGP）基因的蛋白質編碼序列（CDS），制備特異抗體，并檢測該基因在綿羊卵巢組織中的表達分布。以卵泡總cDNA為模板，擴增獲得綿羊MGP基因CDS區(qū)全長序列;合成綿羊MGP蛋白C末端15個氨基酸長度的多肽，免疫小鼠，制備抗血清;利用實時熒光定量PCR（qPCR）和免疫印跡技術分析其在不同組織和不同大小的卵泡中的表達水平;通過免疫組織化學方法分析其在卵巢組織中的表達分布特征。結果表明，成功獲得綿羊MGP基因的CDS區(qū)全長片段（467 bp），編碼103個氨基酸，理論相對分子量為12 230.96，等電點為9.27;N末端19個氨基酸序列被預測為信號肽序列，成熟肽有84個氨基酸，為外泌性蛋白質，無胞內(nèi)區(qū); MGP總蛋白質氨基酸序列與山羊、牛的同源蛋白質相似性分別為100.0%、99.0%，與人、小鼠的相似性均為85.4%。MGP mRNA和蛋白質在綿羊心、肝、脾、肺、腎等組織中的相對表達量較低，在卵巢、輸卵管、子宮等生殖系統(tǒng)或組織中的相對表達量較高，在黃體中的相對表達量也較高;MGP在卵巢組織顆粒細胞、卵丘細胞中均有表達，但在閉鎖卵泡中不表達。本研究結果可為進一步研究MGP在卵巢組織中的生物學功能提供參考。

關鍵詞：基質Gla蛋白;綿羊;卵巢;顆粒細胞;黃體

中圖分類號：S826.2文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2024）07-1276-09Cloning， expression profile and ovarian localization of sheep matrix Gla protein geneZHANG Xinru Gulimire·Abudureyimu CHEN Ying MA Xiuling LIN Jiapeng WANG Liqin HUANG Juncheng WU Yangsheng

（1.Key Laboratory of Genetics Breeding and Reproduction of Grass Feeding Livestock， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Key Laboratory of Animal Biotechnology of Xinjiang/ Institute of Biotechnology， Xinjiang Academy of Animal Science， Urumqi 830011， China;2.College of Animal Science， Xinjiang Agriculture University， Urumqi 830052， China）

Abstract：The aim of this study was to clone the protein coding sequence （CDS） of sheep matrix Gla protein （MGP） gene to prepare specific antibody and to detect the expression distribution of the gene in sheep ovarian tissues. Total sheep follicle cDNA was used as the template to amplify and obtain the full-length sequence of the CDS region of sheep MGP gene. Peptide with a length of 15 amino acids from the C-terminal end of the sheep MGP protein was synthesized and was used to immunize mouse and perpare antiserum. Expression levels of MGP in different tissues and follicles of varying sizes were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR （qPCR） and immunoblotting technology. Immunohistochemistry method was used to analyze the expression and distribution characteristics of MGP in ovarian tissue. The results revealed that the overall fragment （467 bp） of sheep MGP gene CDS region was obtained successfully， and the fragment encoded 103 amino acids， with a theoretical relative molecular weight of 12 230.96 and an isoelectric point of 9.27. Sequence composed of 19 amino acids from the N-terminal was predicted as the signal peptide sequence， and the mature peptide contained 84 amino acids， which was extra-membranous domain protein without intracellular region. The total protein amino acid sequences of MGP shared similarities with those of the homologous proteins from goats and cows of 100.0% and 99.0% respectively， and the similarity with human and mouse was 85.4%. The relative expression levels of MGP mRNA and protein were low in sheep tissues such as heart， liver， spleen， lung and kidney， but were high in reproductive systems or tissues， such as ovary， fallopian tube and uterus， and the relative expression level was also high in corpus luteum. The expression levels of MGP granulosa cells and cumulus cells were high， whereas it didn’t expressed in atresia follicles. The study result can provide a basis for further investigation of the biological role of MGP in ovarian tissues.

Key words：matrix Gla protein;sheep;ovary;granular cell;corpus luteum

基質Gla蛋白（Matrix Gla protein， MGP）是一種由血管平滑肌和內(nèi)皮細胞分泌的、非膠原細胞外基質蛋白質，主要存在于骨、軟骨、腎、肺、心臟和血管平滑肌細胞等部位[1-3]。MGP是人體內(nèi)最有效的天然鈣化抑制劑[4-5]，是維生素K依賴的血管鈣化抑制因子，通過影響細胞分化抑制組織鈣化過程[6-7]。MGP還具有促進局部腫瘤細胞發(fā)生及血管發(fā)生異常的作用[8-10]，在卵巢癌等不同類型癌癥發(fā)生過程中異常表達[11-12]，其表達水平通常與腫瘤侵襲性相關[10， 13-15]。除病理性之外，MGP基因在正常發(fā)育的大鼠附睪分化期和成年大鼠附睪體部及尾部細胞中均高表達[16]，雌激素可提高去卵巢大鼠MGP的表達水平[17]。補充生理劑量的雌激素有利于摘除卵巢的小鼠骨折部位愈合[18]。這些結果暗示了MGP基因可能在哺乳動物中具有生殖功能，目前仍不清楚其在哺乳動物生殖系統(tǒng)尤其是卵巢中的表達特征。

本研究擬針對綿羊MGP基因進行分子克隆，并對MGP蛋白氨基酸序列進行生物信息學分析，合成MGP多肽以制備特異鼠抗血清，利用實時熒光定量PCR（Real-time qPCR）、蛋白質印跡（Western Blot）及免疫組織化學技術分析MGP在綿羊卵巢及卵泡中的表達特征，為探索該基因在綿羊卵泡發(fā)育中的功能提供參考。

1材料與方法

1.1綿羊組織來源與處理

綿羊組織樣品均來自烏魯木齊華凌屠宰場，取健康母羊的心、肝、脾、肺、腎、肌肉、子宮、輸卵管和卵巢等組織，將組織剪切成長、寬、高均不大于0.5 cm的組織塊，迅速將組織塊完全浸泡于5～10倍體積的AllProtectTM試劑（碧云天生物技術股份有限公司產(chǎn)品）中保存，卵巢在1～2 h內(nèi)運抵實驗室，用眼科鑷子手工剝離卵泡（直徑<3 mm的為小卵泡;直徑 3～5 mm的為中卵泡;直徑>5 mm的為大卵泡）后置于AllProtectTM試劑中保存，用于提取RNA和蛋白質。用于組織學分析的卵巢置于波恩（Bouin）固定液中固定，用常規(guī)方法進行石蠟包埋和石蠟切片。

1.2引物設計及合成

根據(jù)美國國家生物技術信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫綿羊MGP基因（GenBank ID：XM_004006833.4）的蛋白質編碼區(qū)域（CDS）設計克隆引物和定量引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3MGP基因CDS區(qū)的克隆

用RNA提取試劑TRIzol（白鯊生物科技有限公司產(chǎn)品）提取卵泡總RNA，利用反轉錄試劑盒（成都福際生物技術有限公司產(chǎn)品）合成cDNA。以卵泡總cDNA為模板，以MGP-F/MGP-R為引物PCR擴增MGP的開放閱讀框序列。PCR的程序：95 ℃ 5 min;94 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán);72 ℃ 1 min。采用凝膠電泳分析，回收467 bp預期大小的目的條帶?；厥誔CR片段與pMD19 T載體[寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司產(chǎn)品]連接，轉化DH5α，挑取單克隆，菌落通過PCR擴增驗證，選陽性克隆測序。將測序結果與NCBI數(shù)據(jù)庫中綿羊MGP序列進行對比分析。

1.4綿羊MGP蛋白的生物信息學分析

利用在線軟件SignalP-5.0（https：//services. healthtech.dtu. dk/service. php？ SignalP-5. 0）預測分析綿羊MGP蛋白的信號肽序列;利用TMHMM Server v. 2. 0（http：//www. cbs. dtu. dk /services/TMHMM/）預測綿羊MGP蛋白氨基酸序列跨膜結構特征。將綿羊MGP與山羊（XP_017903930.1）、牛（NP_777132.1）、人（AAH05272.1）和小鼠（AAH79478.1）的同源蛋白氨基酸序列進行比較。使用STRING（https：//cn.string-db.org/）單基因蛋白質互作網(wǎng)絡進行預測分析。

1.5實時熒光定量PCR

提取各個組織和不同直徑的卵泡的總RNA并反轉錄成cDNA。按照RT-qPCR EasyTM試劑盒（成都福際生物技術有限公司產(chǎn)品）說明書進行實時熒光定量PCR反應。反應程序：95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s， 58 ℃ 10 s， 72 ℃ 10 s， 40個循環(huán)。每個樣品設置3個生物學重復。相對表達量的計算過程如下：△Ct=Ct目的基因 -Ct內(nèi)參基因；△△Ct=△Ct試驗組樣品 -△Ct對照組樣品；相對表達量=2-△△Ct。其中，Ct表示循環(huán)閾值。

1.6MGP的原核表達

綿羊MGP開放閱讀框序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并亞克隆至pET15b多克隆酶切位點（Nde I/Bam H Ⅰ），再轉化至BL21（DE3）表達菌株，經(jīng)0.3 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導4 h重組蛋白質表達。收集誘導前和誘導后的菌體，分別制備誘導前總蛋白質、誘導后總蛋白質、超聲破碎誘導后上清液蛋白質、沉淀蛋白質樣品，經(jīng)電泳和脫色，進行重組蛋白質的表達及可溶性分析。

1.7MGP 抗體的制備

因綿羊MGP蛋白氨基酸序列與人及小鼠同源蛋白氨基酸序列有差異，對應的抗體無法用于綿羊MGP蛋白的檢測分析。經(jīng)DNAman軟件分析，選擇綿羊MGP蛋白氨基酸序列C末端89～103位包含的15個氨基酸的多肽（NAAYDRYFRQRRGAK，命名為MGP89）進行化學合成，并偶聯(lián)至血藍蛋白（KLH）分子作為抗原免疫小鼠，制備小鼠多克隆抗體?？贵w制備方法簡述如下：用生理鹽水將偶聯(lián)好的抗原稀釋至1 μg/μL;抗原和佐劑等體積迅速混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。取5只昆明白小鼠（20～25 g），第1 d每只小鼠后腿肌肉注射100 μL抗原佐劑混合物;第14 d同樣劑量重復注射1次，第21 d摘小鼠眼球放血，分離血清。

1.8Western blot分析

利用原核表達蛋白質或組織蛋白質樣品進行Western Blot分析。稱取約0.1 g組織，加500 μL裂解液[含1% PMSF（苯甲磺酰氟）]，用勻漿器勻漿以充分裂解組織，再加500 μL裂解液冰浴30 min，4 ℃離心5 min，取上清液，用二喹啉甲酸（BCA）蛋白測定試劑盒（碧云天生物技術股份有限公司產(chǎn)品）測定蛋白質濃度。

根據(jù)蛋白質濃度加入5×上樣緩沖液，混勻后在沸水中煮10 min，使蛋白質變性。將變性蛋白質溶液保存于-80 ℃?zhèn)溆?。制備聚丙烯酰胺凝膠，將蛋白質Marker、蛋白質樣品加入凝膠中，80 V電壓2 h;60 V電壓1 h將蛋白質轉到PVDF（聚偏二氟乙烯膜）上;在室溫下用封閉液[含5%脫脂奶粉的PBS（磷酸緩沖鹽溶液）]孵育2 h;將膜浸泡于自制小鼠MGP抗血清稀釋液中，室溫孵育1 h，用PBST（含0.05% Tween20的PBS）洗膜，3次×5 min;再將膜室溫孵育在辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗鼠（碧云天生物技術股份有限公司產(chǎn)品）二抗稀釋液中1 h，用PBST洗膜，5次×5 min;膜上點ECL（增強型化學發(fā)光試劑）化學發(fā)光底物工作液（白鯊生物科技有限公司產(chǎn)品），置于凝膠成像系統(tǒng)（Amersham Imager 600，GE，美國）中進行發(fā)光顯影。取出曝光后的膜，用PBST清洗2次×5 min，用抗體洗脫液在室溫下孵育15 min，再用PBST清洗3次×5 min。封閉后將膜置于HRP標記的內(nèi)參蛋白抗體（β-actin）工作液中，室溫孵育1 h，用PBST洗膜4次×5 min。用ECL發(fā)光液處理后使用凝膠成像系統(tǒng)檢測、拍照。最后使用Image J軟件對蛋白質條帶進行灰度分析，并用β-actin進行均一化處理。使用Image J軟件對蛋白質條帶的化學發(fā)光強度進行定量分析。

1.9免疫組織化學分析

將石蠟切片上的蠟脫盡，進行復水，用PBS浸洗;進行抗原熱修復，用PBS清洗3次;用3% H2O2封閉，用PBS清洗3次;用5% BSA室溫封閉1 h;加MGP自制鼠抗，室溫孵育60 min，用PBS清洗3次;加HRP標記山羊抗兔IgG二抗（碧云天生物技術股份有限公司產(chǎn)品）。室溫孵育40 min，用PBS清洗3次;加入二氨基聯(lián)苯胺（DAB）（白鯊生物科技有限公司產(chǎn)品）顯色試劑，用自來水沖洗;放入蘇木素染劑進行復染，用自來水清洗;用0.5%鹽酸乙醇（1 mL 36%濃鹽酸與7 mL 75%乙醇混合）進行分化，用自來水浸洗，然后進行脫水和透明處理;用樹膠進行封片。用光學顯微鏡觀察并拍照。

1.10統(tǒng)計分析

本研究使用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用獨立樣本T檢驗和One-way方差分析（ANOVA）進行顯著性分析，每個試驗設3個獨立的樣本，并重復3次。數(shù)據(jù)結果用平均值±標準差表示，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2結果與分析

2.1MGP基因序列分析

以卵泡cDNA為模板，用引物MGP-F和MGP-R PCR擴增MGP基因獲得467 bp單一條帶產(chǎn)物（圖1A），克隆測序結果表明該片段為綿羊MGP基因，開放閱讀框（ORF）共編碼103個氨基酸（圖1B），理論相對分子量為12 230.96，等電點為9.27。預測信號肽為N末端19個氨基酸（圖1C），成熟肽有84個氨基酸，為外泌性蛋白質，無胞內(nèi)區(qū)（圖1D）。同其他物種MGP氨基酸序列比對結果顯示，MGP蛋白氨基酸序列與山羊、牛的同源蛋白質相似性分別為100.0%、99.0%，與人、小鼠的同源蛋白質相似性均為85.4%（88/103）。蛋白質相互作用功能預測結果表明，MGP蛋白與BMP2（骨形態(tài)發(fā)生蛋白2）、SPP1（巨噬細胞源性骨橋蛋白）、VTN（玻連蛋白）、RUNX2（Runt相關轉錄因子2）、BGLAP（骨γ-羧基谷氨酸蛋白）、FN1（纖連蛋白）、TNFRSF11B（重組人骨保護素）、GGCX（人源重組蛋白）、ABCC6（ATP結合盒轉運蛋白）和AHSG（α2-HS糖蛋白）等10種蛋白質存在相互作用（圖1E）。

2.2綿羊MGP重組蛋白質表達及抗體制備

由于綿羊與人MGP蛋白序列103個氨基酸中存在15個氨基酸的差異且差異序列不連續(xù)分布（圖2A），因此人源MGP抗體不適用于綿羊MGP的免疫學檢測。為驗證抗體特異性，合成綿羊MGP編碼序列并亞克隆至pET15b原核細胞，經(jīng)誘導表達分析，在相對分子量10 000附近有重組蛋白質表達（圖2B），且以包涵體形式存在。重組蛋白質可被合成的用MGP89多肽免疫小鼠制備的抗血清所特異識別（圖2C），表明該抗體可用于綿羊MGP蛋白的Western Blot檢測分析。

2.3綿羊MGP基因在不同組織及大小不同的卵泡中的表達特征利用Real-time qPCR和Western Blot分析綿羊心、肝、脾、肺、腎、子宮、卵巢、輸卵管和睪丸等9個器官或組織中MGP基因及蛋白質的表達情況。PCR定量分析結果（圖3A）顯示，MGP在各組織中均有表達，mRNA相對表達量大小依次為卵巢、輸卵管、子宮、脾、肺、睪丸、腎、心、肝。Western Blot檢測結果表明，各組織中蛋白質表達水平與基因表達趨勢基本一致，在生殖系統(tǒng)的子宮、輸卵管、卵巢及睪丸組織中均有高含量的MGP蛋白，其他組織中MGP的表達水平很低甚至檢測不到（圖3B）。

在綿羊卵巢、小卵泡、大卵泡及黃體中MGP的表達情況見圖3C，MGP基因在黃體中的相對表達量最高（圖3C），極顯著高于小卵泡（P<0.01），其次是卵巢、大卵泡，在小卵泡中相對表達量最低。Western Blot分析結果與PCR定量分析結果基本一致（圖3D）。

2.4MGP在卵巢中的表達定位特征

利用免疫組化方法檢測MGP蛋白在卵巢中不同時期卵泡中的表達情況。結果表明，MGP蛋白在發(fā)育的有腔卵泡的顆粒細胞、卵丘細胞中均有表達（圖4A～圖4E），在閉鎖卵泡中不表達（圖4F），在黃體細胞中有高表達（圖4G）。

3討論

MGP蛋白是最早在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的血管鈣化抑制劑，不僅影響細胞分化和鈣磷離子復合物形成等途徑，還影響多種致瘤過程。但關于該基因對哺乳動物卵巢正常生理功能影響的研究還未見報道，本研究首次利用綿羊卵巢組織克隆了MGP基因編碼序列，并對其在卵巢中的表達特征進行了初步分析。

哺乳動物MGP蛋白長度通常為103個氨基酸，由4個外顯子組成，在基因組中大多數(shù)是單拷貝形式。綿羊MGP序列與山羊一致，與牛相差1個氨基酸，與人相比存在15個氨基酸的差異，與人同源蛋白質的抗體通用性不高。我們利用多肽合成制備了小鼠抗綿羊MGP抗血清，并經(jīng)原核表達重組MGP蛋白驗證抗體，表明其特異性，然后進行Western Blot和免疫組化分析MGP蛋白的表達情況。本研究利用STRING數(shù)據(jù)庫，對蛋白質的相互作用情況進行預測分析，結果顯示，與MGP相互作用的有10種蛋白質，包括BMP2、SPP1、VTN、RUNX2、BGLAP、FN1、TNFRSF11B、GGCX、ABCC6和AHSG。其中BMP2、SPP1、AHSG、VTN等都與卵泡的發(fā)育及卵母細胞的質量有關[19-21]。

MGP與BMP2共定位在人小梁網(wǎng)細胞[22]，前者是后者的調節(jié)蛋白質[23-24]。卵泡液中BMP2的含量與卵母細胞受精能力呈正相關[19]，有研究結果表明MGP是BMP2的結合蛋白質[25]。MGP是否通過BMP2直接或間接影響卵泡的發(fā)育進程，還有待進一步驗證。關于人卵泡轉錄組學的研究結果表明，在排卵前卵泡顆粒細胞（GCs）中表達的VTN可能是排卵前卵泡細胞和卵丘細胞擴展的關鍵調控因子[21]。SPP1和MGP是參與骨形成和鈣化的蛋白質，SPP1同MGP類似，也具有抑制鈣化作用[26]。SPP1可減少豬卵母細胞體外受精過程中的多精現(xiàn)象[27]，也可促進豬胚胎體外發(fā)育，減少細胞凋亡[20]。MGP是否通過SPP1影響卵母細胞功能，目前仍不清楚。

Li等[28]報道，MGP定位于血管平滑肌細胞、軟骨、骨和心臟的細胞外基質中。關于MGP在卵巢中表達的研究主要與卵巢癌相關[12]，關于其在正常生殖生理方面的生物學功能研究尚未見報道。我們研究發(fā)現(xiàn)，MGP基因的相對表達量在黃體中顯著高于小卵泡、大卵泡，在小卵泡中相對表達量最低。免疫組化檢測結果表明，MGP在卵丘細胞、顆粒細胞中均有表達，在黃體細胞中高表達。上述結果表明，MGP可能影響綿羊卵泡的發(fā)育及黃體的生成過程。

在卵巢發(fā)育過程中鈣離子至關重要，Li等[28]認為MGP可以上調胞內(nèi)游離鈣離子濃度，并在調節(jié)下游細胞信號通路的過程中發(fā)揮關鍵作用。Udagawa等[29]研究發(fā)現(xiàn)，調控線粒體分裂的相關基因Drp1參與調控卵泡發(fā)育進而影響卵子質量。缺乏Drp1的卵細胞線粒體、內(nèi)質網(wǎng)和分泌泡等鈣信號通路受損，導致卵子成熟出現(xiàn)異常。上述結果說明，Drp1通過調節(jié)鈣離子濃度影響卵泡發(fā)育。通常認為MGP由血管平滑肌和內(nèi)皮細胞分泌而來，而血管系統(tǒng)在成人卵巢的卵泡群中分布并不均勻，原始卵泡和生長緩慢的腔前卵泡本身并不存在血管，而是依賴于周圍間質中的血管[30]。Jiang等[31]的研究結果表明，在中間毛囊，新生血管出現(xiàn)在毛細血管層的頂端;在優(yōu)勢毛囊，新生血管出現(xiàn)在毛細血管層的中部或下部。我們的研究發(fā)現(xiàn)，閉鎖的卵泡中并無MGP的顯著表達，而在健康的卵泡及黃體細胞中MGP則高表達，這表明MGP的存在可能對卵泡的正常發(fā)育以及黃體的生成具有重要的作用。我們推測，在卵泡發(fā)育過程中MGP可能從多方面影響著卵泡的發(fā)育與成熟，甚至是黃體的發(fā)育，但其具體作用機制以及調控機制還需進一步的試驗驗證。

4結論

本研究成功獲得綿羊MGP基因的CDS區(qū)全長片段（467 bp）。對MGP基因及其編碼的蛋白質進行了生物信息學分析，推測MGP是一種外泌性蛋白質。MGP基因在綿羊生殖系統(tǒng)組織中高表達，在卵泡的卵丘細胞、顆粒細胞中均有表達，在黃體細胞中高表達，但在閉鎖卵泡中不表達。本研究結果表明，MGP在卵泡的發(fā)育、成熟及黃體的生成過程中可能起著重要的作用，在生殖系統(tǒng)中的具體功能和分子機制還有待于進一步研究和驗證。

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（責任編輯：陳海霞）