豬TGF-βⅡ型受體胞外域的表達(dá)及生物活性驗(yàn)證

摘要：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1Ⅱ型受體（TGFⅡR）是TGF-β家族的主要受體?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在家畜繁殖活動(dòng)中起著負(fù)調(diào)控作用，因此我們提出通過(guò)重組TGFⅡR胞外域蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合體內(nèi)TGF-β1以改善家畜繁殖性能的新思路。首先，對(duì)豬TGFⅡR胞外域蛋白質(zhì)編碼序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化并進(jìn)行人工合成，將合成的基因片段插入原核表達(dá)載體pET-32a（+）中。然后，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入BL21（DE3）表達(dá)菌株中，并篩選合適的乳糖誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)時(shí)間，以獲得最高表達(dá)效率。再然后，對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行純化、復(fù)性及質(zhì)譜鑒定。最后，通過(guò)體外細(xì)胞試驗(yàn)對(duì)重組蛋白質(zhì)的生物活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，在培養(yǎng)溫度為37 ℃、培養(yǎng)時(shí)間為8 h、乳糖誘導(dǎo)質(zhì)量濃度為2.0 g/L的條件下，可以誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的高表達(dá)，用8 mol/L尿素對(duì)包涵體蛋白質(zhì)進(jìn)行溶解，再以生理鹽水為透析液透析24 h后，可以獲得純度達(dá)80％以上的重組豬TGFⅡR胞外域蛋白，用該重組蛋白質(zhì)處理豬顆粒細(xì)胞后，可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的信號(hào)分子Smad3的磷酸化水平。可以看出，本研究中表達(dá)的重組豬TGFⅡ R胞外域蛋白質(zhì)具有較好的生物活性。研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)有利于提高豬繁殖效率的產(chǎn)品奠定工作基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1Ⅱ型受體（TGFⅡR）；原核表達(dá)；TGF-β1；生物活性

中圖分類(lèi)號(hào)：S828.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2024）07-1268-08Expression of porcine TGF-β type Ⅱ receptor in extracellular domain and validation of its biological activityZHAO Lei1，LI Hui2，QIN Shuiping3，LI Bixia2，DAI Chaohui2，ZHAO Weimin2，F(xiàn)U Yanfeng2，DENG Yanfei1，CHENG Jinhua2

（1.College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning 530005， China；2.Key Laboratory of Crop and Animal Integrated Farming， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Institute of Animal Science， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Protection and Utilization Platform of Agricultural Germplasm Resources in Jiangsu Province， Nanjing 210014， China；3.Guangxi Zhuang Autonomous Region Huanjiang Maonan Autonomous County Dongxing Town Agricultural Technology Extension Station， Huanjiang 547117， China）

Abstract：Transforming growth factor-β1 type Ⅱ receptor （TGFⅡR） is the main receptor of TGF-β family. Existing studies have shown that TGF-β1 plays a negative regulatory role in livestock reproduction activities. Therefore， we proposed a new idea to improve the reproductive performance of livestock by competitively binding TGF-β1 in vivo with recombinant TGFⅡR extracellular domain protein. In order to verify it， this study first optimized the codon of porcine TGFⅡ R extracellular domain and synthesized it artificially. The synthesized gene fragment was inserted into the prokaryotic expression vector pET-32a（+）. Then， the recombinant expression vector was transferred into BL21（DE3） expression strain， and suitable lactose induction concentration and induction time were screened to obtain the highest expression efficiency. The recombinant protein was purified， regenerated and identified by mass spectrometry. Finally， the bioactivity of the recombinant protein was determined by in vitro cell experiment. The results showed that the high expression of recombinant protein was induced at 37 ℃， 6 h， 2.0 g/L lactose， the inclusion body protein was dissolved by 8 mol/L urea， and the recombinant porcine TGFⅡR protein with a purity of more than 80% was obtained after dialysis with normal saline for 24 h. After treatment of porcine granulosa cells with the recombinant protein， the phosphorylation level of Smad3 induced by TGF-β1 was significantly inhibited， which indicated that the recombinant porcine TGFⅡR protein expressed in this study had good biological activity. In conclusion， this study lays a foundation for further research and development of products suitable for improving the reproductive efficiency of pigs.

Key words：transforming growth factor-β1 type Ⅱ receptor （TGFⅡR）;prokaryotic expression;TGF-β1;biological activity

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）是TGF-β家族的重要成員之一[1]。在動(dòng)物體內(nèi)，TGF-β1可通過(guò)自分泌、旁分泌及內(nèi)分泌等方式來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖分化及凋亡[2-3]，因此它在維持機(jī)體正常發(fā)育和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。此外，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1也在調(diào)控家畜的繁殖活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。

TGF-β1調(diào)控家畜的繁殖活動(dòng)可從多個(gè)方面得到體現(xiàn)。首先，TGF-β1可以調(diào)控類(lèi)固醇激素的分泌。前人研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1濃度在卵泡液中與雌二醇濃度呈負(fù)相關(guān)，表明TGF-β1可以抑制卵泡顆粒細(xì)胞產(chǎn)生雌激素；體外試驗(yàn)也取得了類(lèi)似結(jié)果，即用TGF-β1處理體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞可顯著抑制雌二醇的分泌[4]；TGF-β1還可抑制黃體細(xì)胞、孕酮合成主要相關(guān)基因的表達(dá)，并抑制孕酮合成[5]。其次，TGF-β1可通過(guò)抑制顆粒細(xì)胞黃體化及胞外基質(zhì)的重構(gòu)、抑制黃體血管形成等方式影響黃體發(fā)育[6-7]。再次，TGF-β1可以通過(guò)降低細(xì)胞活力、誘導(dǎo)促凋亡因子的表達(dá)來(lái)影響卵泡發(fā)育及顆粒細(xì)胞的增殖與凋亡[8]。最后，TGF-β1還可以通過(guò)抑制胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移和侵襲，使胚胎著床失敗或流產(chǎn)[9-11]。綜上所述，機(jī)體內(nèi)TGF-β1的水平受到嚴(yán)格的調(diào)控，一旦失調(diào)會(huì)造成繁殖障礙。受到上述研究結(jié)果的啟發(fā)，我們認(rèn)為T(mén)GF-β1可能是一種抑制家畜繁殖活動(dòng)的因子，并提出通過(guò)抑制TGF-β1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)改善家畜繁殖性能的新思路。

TGF-β的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴(lài)其分布于細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白受體[12]。TGF-β受體分為3種（TGFBⅠ R、TGFBⅡ R和TGFBⅢ R），其中TGF-β1Ⅱ型受體（TGFⅡR）在TGF-β1信號(hào)的接收和產(chǎn)生中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，即TGF-β家族配體與膜上相應(yīng)的Ⅱ型受體結(jié)合并誘導(dǎo)其磷酸化，隨后募集I型受體形成復(fù)合物，并催化其激酶活性，隨后I型受體招募并活化下游的Smad2/3?；罨腟mad2/3與Smad4結(jié)合后形成異聚復(fù)合物并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，該異聚復(fù)合物在其他輔因子的幫助下與靶基因的啟動(dòng)子結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，最終調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)[13-14]。因此，TGFⅡR是TGF-β配體的主要接收元件和信號(hào)產(chǎn)生元件，對(duì)TGF-β家族功能的發(fā)揮起著關(guān)鍵作用。

鑒于TGF-β1在家畜繁殖活動(dòng)中的負(fù)調(diào)控作用，我們提出用重組TGF Ⅱ R胞外域蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合體內(nèi)TGF-β1，以達(dá)到阻斷或降低其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的目的，最終改善家畜繁殖性能。具體而言，本研究擬用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組豬TGF Ⅱ R胞外域蛋白質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行純化和生物活性驗(yàn)證，從而為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)適用于提高豬繁殖效率的新產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌株、質(zhì)粒及試劑原核表達(dá)載體pET-32a（+）、大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）菌株購(gòu)自擎科生物科技股份有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技股份有限公司，乳糖、LB液體培養(yǎng)基預(yù)混粉劑、瓊脂粉、氨芐青霉素（Amp）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液（Tris-HCl）、尿素、咪唑、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）制備試劑盒（分離膠含量為10％、12％、15％）、考馬斯亮藍(lán)染色液、生理鹽水、ddH2O、脫色液、三（2-羧乙基）膦（TCEP）、氯乙酰胺（CAA）、胰蛋白酶、肽段抽提液（ACN/formic acid）、二甲基亞砜（DMSO）、胎牛血清、75％乙醇、DMEM/F12培養(yǎng)基、抗生素、苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白抑制劑、蛋白質(zhì)裂解液、5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液、限制性?xún)?nèi)切酶Bam H I和Xho I、脫脂奶粉、一抗稀釋液、加入吐溫20的Tris緩沖鹽溶液（TBST）、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）發(fā)光液等均購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。

1.1.2Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基的配制按10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L氯化鈉的量稱(chēng)取藥品并加水溶解，調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.0，并定容至1 L，固定培養(yǎng)基需另加入瓊脂（總含量為20 g/L），配制好培養(yǎng)基后高壓滅菌。

1.1.3包涵體洗滌溶液、結(jié)合溶液按照50 mmol/L Tris-HCl、500 mmol/L NaCl、1 mol/L尿素或2 mol/L尿素或3 mol/L尿素的濃度稱(chēng)取藥品并加水溶解，調(diào)節(jié)pH值至8.0，配制包涵體洗滌緩沖液。按照20 mmol/L Tris-HCl、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑、8 mol/L尿素的濃度稱(chēng)取藥品并加水溶解，調(diào)節(jié)pH值至7.5，配制包涵體結(jié)合緩沖液。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1基因合成及重組表達(dá)載體的制備用在線(xiàn)蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)工具TMHMM 2.0對(duì)從GenBank中查詢(xún)的豬TGFⅡR氨基酸序列（編號(hào)： XP_020927152.1）進(jìn)行預(yù)測(cè)，找出蛋白質(zhì)的胞外域，并剔除信號(hào)肽序列。隨后對(duì)編碼胞外域的序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化并進(jìn)行化學(xué)合成。在5′端添加Bam H I酶切位點(diǎn)，在3′端添加終止密碼子、Xho I酶切位點(diǎn)，通Bam H I、Xho I將相應(yīng)基因克隆至載體pET-32a（+）上，并通過(guò)質(zhì)粒提取試劑盒獲得重組質(zhì)粒pET-32a（+）-TGFⅡR備用。

1.2.2重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測(cè)將重組pET-32a（+）-TGFⅡR轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）菌株中，用移液槍吸取100 μL菌液，使用涂布玻璃棒將菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。待長(zhǎng)出單菌落后，挑取單菌落接種于添加氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行過(guò)夜擴(kuò)大培養(yǎng)。當(dāng)OD600為0.6～0.8時(shí)，加入乳糖并在搖床上誘導(dǎo)重組豬TGFⅡR蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)用的乳糖質(zhì)量濃度梯度為0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L，誘導(dǎo)溫度為37 ℃。取誘導(dǎo)后的菌液，用PBS重懸后超聲破碎30 min，離心并收集上清液和沉淀。按照上清液∶沉淀=4∶1（體積比）加入5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液，在95 ℃、10 min條件下使其充分變性，取10 μL變性溶液進(jìn)行上樣電泳。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)快速染色液染色15～20 min，再用蒸餾水脫色至背景清晰。

1.2.3重組蛋白質(zhì)的純化及SDS-PAGE檢測(cè)按照方法1.2.2優(yōu)化的最佳誘導(dǎo)條件和誘導(dǎo)步驟進(jìn)行重組豬TGFⅡR蛋白的擴(kuò)大培養(yǎng)，將誘導(dǎo)好的菌液于8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，加入PBS重懸后，用超聲波破碎儀進(jìn)行破碎洗滌，參數(shù)如下：功率200 W，工作時(shí)間2 s，工作間隙2 s，共持續(xù)2 min。用超聲波進(jìn)行破碎處理后對(duì)液體進(jìn)行離心并收集沉淀，再重復(fù)1次PBS洗滌的步驟后，分別用1 mol/L、2 mol/L、3 mol/L包涵體洗滌溶液并重懸沉淀，再用超聲波破碎儀（功率200 W，工作時(shí)間2 s，工作間隙2 s，共持續(xù)2 min）進(jìn)行破碎洗滌，離心并收集沉淀。重復(fù)上述步驟6次后，用8 mol/L尿素將包涵體溶解。

將重組豬TGFⅡR蛋白溶液裝入處理好的透析袋中，以生理鹽水作為透析液，于4 ℃透析12 h，更換1次透析液后繼續(xù)透析12 h，至尿素不再滲出，確保此時(shí)重組蛋白質(zhì)處于可溶解狀態(tài)，表明已獲得純化的重組豬TGFⅡR蛋白溶液。

與此同時(shí)，收集每次尿素洗滌后的重懸溶液及純化的蛋白質(zhì)樣品，按照4∶1（體積比）加入5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液，在95 ℃、10 min條件下使其充分變性，取10 μL變性后的溶液進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)快速染色液染色15～20 min，再用蒸餾水脫色至背景清晰。

1.2.4質(zhì)譜檢測(cè)用手術(shù)刀切割電泳凝膠上的樣品蛋白質(zhì)條帶，用玻璃棒將樣品搗碎后分別加入ddH2O、脫色液、乙腈振蕩5 min，離心并去除上清液。加入三（2-羧乙基）膦（TCEP）、氯乙酰胺（CAA）于60 ℃孵育30 min，進(jìn)行還原烷基化反應(yīng)。加入乙腈振蕩5 min，隨后離心去除上清液，再真空抽干。按照樣品體積加入適量胰蛋白酶，于37 ℃孵育并振蕩過(guò)夜進(jìn)行酶切。第2 d加入肽段抽提液（ACN/formic acid），超聲處理10 min，離心后取上清液，真空抽干。使用C18脫鹽柱脫鹽，真空抽干后于-20 ℃凍存，準(zhǔn)備上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5重組蛋白質(zhì)生物活性的檢測(cè)從屠宰場(chǎng)收集形態(tài)正常的卵巢，依次在37 ℃生理鹽水溶液、75%乙醇中清洗后抽取卵泡液，離心并收集顆粒細(xì)胞，在含有10％胎牛血清、1％三抗的F12培養(yǎng)基中懸浮后接種于12孔板中，再將其置于37 ℃、含5％ CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將純化的重組豬TGFⅡR蛋白過(guò)濾除菌后，與TGF-β1在培養(yǎng)箱中提前孵育4 h（使重組TGFⅡR蛋白與TGF-β1充分結(jié)合）。將豬顆粒細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照、TGF-β1處理組、重組豬TGFⅡR蛋白處理組，重組豬TGFⅡR蛋白與TGF-β1共孵育處理組。提前將重組蛋白與TGF-β1在37 ℃培養(yǎng)箱中共孵育4 h，隨后對(duì)所有處理組的豬顆粒細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行加藥處理，45 min后收集細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，每孔細(xì)胞加入120 μL含1％ PMSF的胞蛋白裂解液，于冰上裂解30 min后加入5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液，在95 ℃處理10 min，使其充分變性。

每組取10 μL蛋白質(zhì)樣品上樣，經(jīng)SDS-PAGE后，用半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5％脫脂奶粉于室溫封閉1 h后，分別用p-Smad3、Smad3一抗于4 ℃孵育過(guò)夜，用TBST溶液洗滌后，在室溫下加入與p-Smad3、Smad3一抗對(duì)應(yīng)的二抗孵育1 h，再用TBST溶液洗滌，配制并吸取適量增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）覆蓋于蛋白質(zhì)條帶上，通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像儀（LAS-4000）進(jìn)行拍攝，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參蛋白質(zhì)。

2結(jié)果與分析

2.1原核表達(dá)載體的構(gòu)建

GenBank中收錄的豬TGFⅡR共有567個(gè)氨基酸殘基，用TMHMM 2.0在線(xiàn)軟件對(duì)TGFⅡR進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第1～160個(gè)氨基酸屬于蛋白質(zhì)的胞外域，并且第1～23個(gè)氨基酸屬于信號(hào)肽部分（圖1）。因此，我們選擇第24～159個(gè)氨基酸進(jìn)行表達(dá)研究。

通過(guò)人工化學(xué)合成法合成密碼子優(yōu)化后的序列，得到編碼豬TGF Ⅱ R基因的胞外域蛋白質(zhì)編碼DNA片段。將該DNA片段經(jīng)Bam H I、Xho I雙酶切處理后連接至同樣經(jīng)過(guò)雙酶切處理的pET-32a（+）載體上，經(jīng)E.coli DH5α轉(zhuǎn)化、篩選、擴(kuò)增，最終獲得用于原核表達(dá)的pET-32a（+）-TGF Ⅱ R質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒用Bam H I/Xho I進(jìn)行雙酶切鑒定，分別得到長(zhǎng)度為2 000 bp、5 000 bp的片段，與預(yù)期大小一致（圖2），表明質(zhì)粒pET-32a（+）-TGF Ⅱ R構(gòu)建成功。

2.2重組蛋白質(zhì)的SDS-PAGE檢測(cè)

將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21（DE3）中，經(jīng)乳糖誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE分析?？捡R斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示，以蛋白質(zhì)相對(duì)分子量為10 000～180 000的Maker作為參照，可見(jiàn)相對(duì)分子量約為15 000的包涵體蛋白質(zhì)得到成功表達(dá)（圖3中的第2泳道）。分別用0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L乳糖對(duì)包涵體蛋白質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，包涵體蛋白質(zhì)表達(dá)效率最高的誘導(dǎo)質(zhì)量濃度為2.0 g/L（圖4中的第4泳道）。當(dāng)以4 h、5 h、6 h、7 h、8 h的乳糖誘導(dǎo)時(shí)間分別誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，8 h的誘導(dǎo)效果最佳（圖5中的第10泳道）。

2.3重組豬轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1Ⅱ型受體（TGFⅡR）蛋白胞外域的純化和復(fù)性對(duì)分離提取的包涵體進(jìn)行多次清洗后，用8 mol/L尿素將其溶解，然后對(duì)其進(jìn)行復(fù)性處理，并對(duì)復(fù)性后的蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分析。重組蛋白質(zhì)的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果（圖6）顯示，泳道中出現(xiàn)相對(duì)分子量約為15 000的蛋白質(zhì)條帶，與預(yù)期相對(duì)分子量為15 000的重組豬TGFⅡR蛋白大小相符，且純度達(dá)80％以上。由此可見(jiàn)，本試驗(yàn)獲得了純度較高且溶解度良好的重組豬TGFⅡR胞外域蛋白質(zhì)。M：Marker；泳道1：純化后的重組豬TGFⅡR蛋白。

2.4重組蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

為了證明所表達(dá)的蛋白質(zhì)是豬TGFⅡR蛋白，將上述試驗(yàn)中相對(duì)分子量為15 000左右的蛋白質(zhì)電泳條帶切下進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，并對(duì)質(zhì)譜鑒定試驗(yàn)得到的肽段序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。如圖7所示，pET-32a（+）-TGFⅡR經(jīng)乳糖誘導(dǎo)后表達(dá)的蛋白質(zhì)確實(shí)為重組豬TGFⅡR蛋白。

2.5重組TGFⅡR胞外域蛋白質(zhì)的生物活性檢測(cè)

目前已知TGF-β1活性中最主要且最直觀的表現(xiàn)是與其受體TGFⅡR結(jié)合并催化其下游信號(hào)分子Smad2、Smad3的磷酸化。因此，要鑒定本研究制備的重組豬TGFⅡR蛋白是否具有生物活性，主要是要證明其是否能與TGF-β1結(jié)合。換言之，要證明重組豬TGFⅡR蛋白是否可以與細(xì)胞表面的天然TGFⅡR競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TGF-β1，從而抑制細(xì)胞內(nèi)Smad2、Smad3的磷酸化。Western blotting檢測(cè)結(jié)果（圖8）表明，用TGF-β1處理后，豬顆粒細(xì)胞中的Smad3磷酸化水平升高；當(dāng)用重組豬TGFⅡR蛋白與TGF-β1共孵育處理豬顆粒細(xì)胞時(shí)，Smad3的磷酸化水平相較于TGF-β1單獨(dú)處理顯著下降。上述研究結(jié)果表明，重組豬TGFⅡR蛋白可以與TGF-β1結(jié)合，從而影響Smad3的磷酸化水平，該重組蛋白質(zhì)具有生物學(xué)活性。

3討論

TGF Ⅱ R是TGF-β家族中多個(gè)成員共用的受體，通過(guò)與TGF-β配體結(jié)合并誘導(dǎo)磷酸化來(lái)進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]。大量研究發(fā)現(xiàn)，TGF Ⅱ R通過(guò)影響TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而在抑制腫瘤發(fā)生的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TGF Ⅱ R可以作為GA結(jié)合蛋白A （GABPA）的直接靶點(diǎn)而激活TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而發(fā)揮對(duì)腫瘤的抑制作用[15]。除了抑制腫瘤，TGF Ⅱ R還在調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞凋亡與女性生育能力中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，作為去泛素酶USP9X的新底物和間接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，參與組成包括TGF-β信號(hào)通路在內(nèi)的功能性微調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[16]。TGF Ⅱ R對(duì)于顆粒細(xì)胞的作用在豬的研究中也有報(bào)道，Yang等[17]發(fā)現(xiàn)，TGF Ⅱ R是豬顆粒細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵抑制因子，且TGF Ⅱ R可以作為靶點(diǎn)發(fā)揮作用以啟動(dòng)新生小鼠卵巢中的原始卵泡發(fā)育并維持原始卵泡靜止[18]。很多研究發(fā)現(xiàn)，TGF Ⅱ R可以在不同物種中通過(guò)TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而影響卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡。因此，阻斷TGF-β信號(hào)的傳導(dǎo)可能是一種改善母豬卵泡發(fā)育、提高繁殖效率的有效治療手段。

然而在目前的研究中，阻斷TGF-β家族的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)常用小分子抑制劑和siRNA干擾的方法[19]。小分子抑制劑作為一種化合物，雖然具有高效的特點(diǎn)，但在動(dòng)物活體中使用時(shí)存在毒性較大、給藥繁瑣和成本較高等缺點(diǎn)。而siRNA干擾是目前的研究中常用的一種較為有效的方法，但是在很多時(shí)候只能進(jìn)行體外細(xì)胞試驗(yàn)，動(dòng)物活體試驗(yàn)也存在與小分子抑制劑類(lèi)似的困難。鑒于此，結(jié)合前人研究結(jié)果，我們提出了利用重組TGF Ⅱ R蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合體內(nèi)TGF-β以阻斷家族的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法。目前Gao等[20]構(gòu)建了人的包含抗PD-L1抗體、TGF Ⅱ R胞外域的多功能融合蛋白質(zhì)，在小鼠模型中，可免疫抑制TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而抑制腫瘤的增殖。但是，目前尚未有研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)重組豬TGF Ⅱ R蛋白的表達(dá)能夠阻斷TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且缺乏利用重組蛋白質(zhì)進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)的相關(guān)研究。

因此，本研究構(gòu)建了豬TGF Ⅱ R的原核表達(dá)載體，通過(guò)在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)后，提取并純化重組豬TGF Ⅱ R蛋白，并對(duì)其活性進(jìn)行驗(yàn)證。首先，在感受態(tài)細(xì)胞BL21DE3中轉(zhuǎn)入原核質(zhì)粒，用終質(zhì)量濃度為2.0 g/L的乳糖誘導(dǎo)，于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜以成功表達(dá)重組豬TGF Ⅱ R包涵體蛋白。表達(dá)成功后，于冰上超聲破碎細(xì)菌，離心后棄上清液，用PBS及包涵體洗滌溶液多次重懸沉淀并用超聲波洗滌沉淀，隨后用生理鹽水對(duì)沉淀進(jìn)行透析處理24 h，SDS-PAGE結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)的純化效果較好，豬TGF Ⅱ R重組蛋白質(zhì)的純度達(dá)80％以上，且處于穩(wěn)定的可溶解狀態(tài)。通過(guò)質(zhì)譜鑒定，確定所表達(dá)的蛋白質(zhì)為豬TGF Ⅱ R重組蛋白質(zhì)。

與真核表達(dá)系統(tǒng)相比，以大腸桿菌為表達(dá)載體的原核表達(dá)系統(tǒng)，具有成本較低、生長(zhǎng)速度快等特點(diǎn)，并可在較短時(shí)間內(nèi)表達(dá)出大量目的蛋白質(zhì)。本研究主要實(shí)現(xiàn)的是重組豬TGF Ⅱ R蛋白的包涵體蛋白質(zhì)表達(dá)，雖然包涵體蛋白質(zhì)需要用高濃度的尿素進(jìn)行變性后復(fù)性，具有步驟復(fù)雜、可能存在影響蛋白質(zhì)活性及復(fù)性率的因素等問(wèn)題，但是對(duì)獲得的重組豬TGF Ⅱ R蛋白在細(xì)胞水平上進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，本研究獲得了具有生物活性的重組豬TGF Ⅱ R蛋白。

本研究成功表達(dá)了純度較高、處于穩(wěn)定可溶狀態(tài)的豬重組TGFⅡR蛋白，并分為對(duì)照組、TGF-β1處理組、豬重組TGFⅡR蛋白與TGF-β1共孵育處理組、豬重組TGFⅡR蛋白處理組來(lái)進(jìn)行豬顆粒細(xì)胞水平的驗(yàn)證。結(jié)果顯示，豬重組TGFⅡR蛋白可以結(jié)合TGF-β1，且smad3的磷酸化水平顯著下調(diào)，表明本試驗(yàn)用原核系統(tǒng)構(gòu)建的豬重組TGFⅡR蛋白具有活性，可以競(jìng)爭(zhēng)性阻斷TGF-β1信號(hào)來(lái)改善母豬卵泡發(fā)育，為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)適用于提高母豬乃至其他家畜繁殖效率的產(chǎn)品奠定了工作基礎(chǔ)。

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