大豆轉錄因子GmMYC2L參與植物耐鹽性調控

摘要：轉錄因子在植物應對逆境脅迫的響應和調節(jié)過程中起著十分重要的作用。為探究大豆bHLH轉錄因子家族成員GmMYC2L在植物耐鹽脅迫中的功能，本研究利用序列同源比對分析大豆GmMYC2L蛋白與三裂葉薯、番茄、芝麻、本氏煙草和擬南芥MYC2蛋白的保守結構域，利用半定量PCR檢測鹽脅迫對大豆GmMYC2L基因表達模式的誘導作用，通過煙草葉片瞬時表達分析GmMYC2L蛋白的亞細胞定位，利用浸花法獲得轉GmMYC2L基因擬南芥植株，并分析野生型和轉基因擬南芥植株對鹽脅迫的響應及機制。結果表明，大豆GmMYC2L蛋白具有bHLH家族典型的保守結構域且定位于細胞核；鹽脅迫下，大豆根和葉中GmMYC2L基因表達量明顯上調。鹽脅迫下，GmMYC2L基因過表達擬南芥植株葉片中丙二醛含量和過氧化氫含量顯著低于野生型擬南芥植株，葉片中超氧化物歧化酶（SOD）活性和過氧化物酶（POD）活性顯著增加；抗氧化酶基因AtSOD和AtPOD的相對表達量亦顯著上調。以上結果說明大豆GmMYC2L基因能通過抗氧化途徑增強植物的耐鹽性。本研究結果為大豆等作物的耐鹽性遺傳改良提供候選基因。

關鍵詞：大豆；轉錄因子；GmMYC2L ；耐鹽性

中圖分類號：S565.1文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2024）07-1182-09Soybean transcription factor GmMYC2L is involved in the regulation of plant salt toleranceZHANG Bin

（Hunan University of Science and Engineering/Hunan Provincial Engineering Research Center for Ginkgo biloba， Yongzhou 425199， China）

Abstract：Transcription factors play an important role in the response and regulation of plants to adversity stress. In order to explore the function of soybean bHLH transcription factor family member GmMYC2L in plant salt tolerance， the conserved domains of soybean GmMYC2L protein and MYC2 proteins of sweet potato， tomato， sesame， Nicotiana benthamiana and Arabidopsis thaliana were analyzed by sequence homology comparison. The expression pattern of soybean GmMYC2L gene induced by salt stress was detected by semi-quantitative PCR. The subcellular localization of GmMYC2L protein was analyzed by transient expression in tobacco leaves. GmMYC2L gene transgenic Arabidopsis thaliana plants were obtained by floral dip method. The response and mechanism of wild-type and transgenic Arabidopsis thaliana plants to salt stress were analyzed. The results showed that soybean GmMYC2L protein had a typical conserved domain of the bHLH family and the protein was localized in the nucleus. Under salt stress， the expression of GmMYC2L gene in soybean roots and leaves was significantly up-regulated. Under salt stress， the contents of malondialdehyde and hydrogen peroxide in the leaves of GmMYC2L overexpressing Arabidopsis thaliana plants were significantly lower than those of wild-type Arabidopsis thaliana plants， and the superoxide dismutase （SOD） activity and peroxidase （POD） activity in the leaves were significantly increased. The relative expression levels of antioxidant enzyme genes AtSOD and AtPOD were also significantly up-regulated. The above results indicated that soybean GmMYC2L gene could enhance salt tolerance of plants through antioxidant pathway. The results of this study provide candidate genes for genetic improvement of salt tolerance in soybean and other crops.

Key words：soybean；transcription factor；GmMYC2L；salt tolerance

江蘇農業(yè)學報2024年第40卷第7期張斌：大豆轉錄因子GmMYC2L參與植物耐鹽性調控植物生長過程中容易受到不利環(huán)境因素的影響，包括極端溫度、干旱和鹽漬化等非生物脅迫及病蟲害等生物脅迫[1]。其中，土壤鹽漬化會加劇植物體內活性氧過量積累，破壞Na+和K+離子平衡，抑制光合作用，進而導致植物生長受阻甚至死亡[2]。為了在逆境下生長，植物通常會在生理、生化和分子水平上形成應對策略[3]。分子層面上轉錄因子是一類可以結合到下游基因啟動子元件上調控基因表達水平的蛋白質家族，在植物的耐鹽性調控中起重要作用[4]。目前WRKY[5]、ERF[6]、MYB[7]、NAC[8]、ARF[9]、bZIP[10]和bHLH[3]等轉錄因子參與植物耐鹽脅迫調控已得到證實。

轉錄因子bHLH家族成員較多，是植物中的第二大轉錄因子家族，通常含有兩個高度保守的結構域，即基本結構域和HLH結構域[3]?；窘Y構域位于N端，能夠結合下游基因啟動子上的G-box或E-box元件；HLH結構域主要位于C端，在蛋白質間互作時發(fā)揮作用。bHLH家族成員參與植物耐鹽脅迫調控已有較多研究。擬南芥AtbHLH122基因的表達水平受鹽脅迫誘導上調，擬南芥AtbHLH122突變體對鹽脅迫更敏感，而AtbHLH122基因過表達植株的耐鹽性明顯增強[11]。番茄bHLH家族成員SlbHLH22則可通過激活抗氧化系統(tǒng)，清除多余活性氧，增強植株耐鹽性[12]?；ㄉ鶤hbHLH121蛋白可以直接結合AhPOD、AhCAT和AhSOD等基因啟動子的G-box/E-box區(qū)域，從而提高上述基因的表達水平；此外，AhbHLH121基因過表達的轉基因花生植株在鹽處理下的抗氧化酶活性顯著上升，活性氧積累量明顯減少，即轉基因植株對鹽脅迫的耐受性明顯增強[13]。編碼水稻bHLH家族成員OrbHLH001基因過表達則可激活K+通道基因OsAKT1的表達，進而促進鹽脅迫下根和莖中的K+向葉片的運輸，同時減少根對Na+的吸收，維持水稻植株Na+含量/K+含量處于正常水平，減輕鹽脅迫對水稻植株造成的損傷[14]。鹽誘導下，大豆bHLH家族基因GmbHLH3的表達上調，其編碼蛋白質可結合到氯離子通道蛋白質基因GmCLC1的啟動子上并上調其表達水平，進而介導大豆毛狀根對Cl-、NO-3等離子的吸收并限制其向地上部的轉運，維持GmbHLH3過表達大豆植株較低的Cl-含量/NO-3含量和Na+含量/K+含量，增強其耐鹽性[15]。MYC2屬于bHLH 轉錄因子，能夠響應植物生長發(fā)育相關的多種內源和外源信號，在信號轉導途徑中發(fā)揮核心作用[16]。鹽處理可以誘導丹參SmMYC2基因的表達，過表達該基因可以提高轉基因植株體內超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶活性，增加脯氨酸含量，導致轉基因擬南芥植株對鹽脅迫的耐受性明顯增強[17]。鹽脅迫下，甘薯IbMYC2基因的表達水平顯著上調，IbMYC2基因過表達植株的花青素含量顯著增加；同時，鹽脅迫還能激活抗氧化酶和脯氨酸合成酶編碼基因，增強活性氧清除能力，賦予植株更強的耐鹽性能[4]。

大豆（Glycine max）是中國重要的糧油作物，富含蛋白質，是食用油、植物蛋白質和動物飼料的關鍵原料。Xu等[18]從栽培大豆基因組中篩選鑒定出308個bHLH家族基因；其中，該家族成員GmPIB1能抑制活性氧產生的關鍵酶編碼基因GmSPOD1的表達，減少活性氧（ROS）的積累，增強大豆疫霉菌抗性[19]。大豆GmMYC2基因參與鹽脅迫適應過程調控，GmARF16轉錄因子可以直接激活GmMYC2的表達，GmMYC2負向調控脯氨酸的合成，增強大豆對鹽脅迫的敏感性[20]。本研究團隊在前期的研究中篩選到1個GmMYC2的同源基因GmMYC2L，為明確其在鹽脅迫應答過程中的功能機理，本研究通過轉基因、生理生化測定和分子生物學技術，分析GmMYC2L基因在鹽脅迫下的表達模式及其編碼蛋白質的亞細胞定位，探究野生型和轉GmMYC2L基因擬南芥植株在耐鹽性方面的差異及機制，為大豆的耐鹽品種選育提供理論依據和重要基因資源。

1材料與方法

1.1不同植物MYC2蛋白質氨基酸序列分析

從大豆基因組參考數據庫（https：//soykb.org/）下載GmMYC2L氨基酸序列（登錄號：Glyma.01G096600），從美國國家生物信息中心（NCBI）數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載三裂葉薯（Ipomoea triloba）、番茄（Solanum lycopersicum）、芝麻（Sesamum indicum）、本氏煙草（Nicotiana tabacum）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）的MYC2氨基酸序列，數據庫登錄號分別為XP_031095962.1（三裂葉薯）、XP_004244656.1（番茄）、XP_011081344.1（芝麻）、XP_016500166.1（本氏煙草）和NP_174541.1AtMYC2（擬南芥）。利用DNAMAN軟件對GmMYC2L和ItMYC2、SlMYC2、SiMYC2、NtMYC2、AtMYC2的氨基酸序列進行對比。

1.2組織RNA提取和基因表達檢測

大豆盆栽試驗于2023年3月在湖南科技學院植物生長室進行。將大豆種子（品種為中黃13）播種于直徑20 cm、高30 cm裝有5 kg營養(yǎng)土的花盆中，每盆播種6顆種子，共12盆，于植物生長室進行培養(yǎng)。生長室內溫度恒定20 ℃，相對濕度60%～70%，日照時間16 h/d，白天光照度為100 μmol/（m2· s）。待大豆幼苗的真葉完全展開后，使用150 mmol/L NaCl溶液澆灌，以清水澆灌作為對照（CK），各6盆，分別在0 h、3 h、6 h和12 h時取大豆根和葉各1 g，液氮速凍后在-80 ℃冰箱中保存。

在研缽中加入液氮和植物組織樣品，將樣品充分研磨后使用植物RNA提取試劑盒[翌圣生物科技（上海）股份有限公司產品]提取總RNA，取2 μg RNA使用反轉錄試劑盒[翌圣生物科技（上海）股份有限公司產品]合成cDNA。以GmUBI3為內參基因，利用2× Hieff CanacePCR Master Mix 高保真酶和PCR儀（德國Biometra公司產品）進行半定量PCR，明確大豆幼苗根和葉中GmMYC2L基因的相對表達水平。所用引物如表1所示。

1.3大豆GmMYC2L的亞細胞定位

以大豆cDNA為模板，克隆不含終止密碼子的GmMYC2L基因編碼序列，并連接到pCAMBIA1300-GFP表達載體（上海百風生物科技有限公司產品）35S啟動子下游，獲得融合質粒35S-GmMYC2L-GFP。使用農桿菌介導的方法將融合質粒35S-GmMYC2L-GFP和pCAMBIA1300-GFP載體分別轉化本氏煙草葉片。其中，轉化pCAMBIA1300-GFP空載體的煙草葉片為對照。轉化后的煙草轉移到植物生長室避光培養(yǎng)1 d，再按16 h/d的光照條件培養(yǎng)1 d，使得外源基因在煙草葉片中產生相應蛋白質。使用Ultra VIEW VoX激光共聚焦顯微鏡（美國PerkinElmer公司產品）觀察綠色熒光在煙草葉片細胞中的位置進行GmMYC2L蛋白的亞細胞定位。

1.4載體構建和轉基因植株篩選

以大豆cDNA為模板，克隆GmMYC2L基因編碼序列，經1%瓊脂糖凝膠電泳，切下含有目的條帶的凝膠進行片段回收，然后將回收片段插入雙元表達載體pFGC5941的35S啟動子下游，獲得重組質粒35S-GmMYC2L，并將其轉入GV3101根癌農桿菌。利用浸花法轉化野生型擬南芥，收獲T0代種子。將T0代種子經75%乙醇消毒5 min后均勻撒在含25 mg/L潮霉素（HYG）的MS培養(yǎng)基上，篩選得到能正常生長的抗性幼苗。進一步提取野生型擬南芥和抗性幼苗的DNA和RNA，通過熒光定量PCR檢測抗性植株中Hyg基因（所用引物見表1）是否存在以及GmMYC2L的相對表達水平，得到過表達轉基因植株（OE），將轉基因植株繼續(xù)培養(yǎng)，收獲相應的種子用于后續(xù)試驗。熒光定量PCR所用引物見表1。

擬南芥野生型和轉基因植株中Hyg基因檢測方法：將能夠生長的抗性幼苗移栽到營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)，21 d后剪取植株葉片，使用植物DNA提取試劑盒[翌圣生物科技（上海）股份有限公司產品]提取DNA，利用20.0 μL PCR反應體系（2×Hieff CanacePCR Master Mix 高保真酶10.0 μL、無菌水8.0 μL、Hyg正向引物和反向引物各0.5 μL、DNA模板1.0 μL）進行擴增，即利用PCR儀（德國Biometra公司產品）進行半定量PCR，PCR產物利用1%瓊脂糖凝膠電泳以檢測植株中Hyg基因表達情況。

擬南芥野生型和轉基因植株中GmMYC2L基因的相對表達水平檢測：擬南芥野生型和抗性幼苗培養(yǎng)21 d后，利用擬南芥野生型和轉基因植株葉片提取RNA，以AtACTIN2基因作為內參基因，2×SYBR Green Mix[翌圣生物科技（上海）股份有限公司產品]為熒光染料，參照Xu等[18]方法，利用熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司產品）進行擬南芥野生型和轉基因植株的GmMYC2L基因表達水平檢測。

1.5擬南芥耐鹽性評價和生理生化指標測定

將GmMYC2L過表達擬南芥種子（OE）和野生型擬南芥種子（WT）消毒后均勻播在常規(guī)MS培養(yǎng)基和含150 mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)皿播30粒種子，4 ℃放置3 d后轉移到植物生長室[恒定溫度20 ℃，相對濕度60%～70%，日照時間16 h/d，光照度100 μmol/（m2·s）]垂直放置，7 d后觀察種子的萌發(fā)和根的生長情況，測量并統(tǒng)計平均根長。

將GmMYC2L過表達擬南芥種子（OE）和野生型擬南芥種子（WT）播種于面積36 cm2、高5 cm裝有100 g營養(yǎng)土的塑料缽中，每缽播種6粒種子，4 ℃黑暗放置3 d后移至植物生長室[恒定溫度20 ℃，相對濕度60%～70%，日照時間16 h/d，光照度為100 μmol/（m2·s）]培養(yǎng)。21 d后挑選長勢一致的植株分成2組，各12株，以150 mmol/L NaCl水溶液澆灌作為處理，以清水澆灌作為對照，處理7 d后觀察植株生長狀況。參照文獻[21]的方法測定不同處理下擬南芥植株葉片的丙二醛（MDA）含量，利用過氧化氫測定試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司產品）測定擬南芥葉片中的H2O2含量。利用總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒和過氧化物酶（POD）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司產品），按照試劑盒使用說明書進行不同處理下擬南芥植株（WT和OE）葉片中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）的活性測定。以AtACTIN2為內參基因，2×SYBR Green Mix[翌圣生物科技（上海）股份有限公司產品]為熒光染料，參照Xu等[18]方法，利用熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司產品）進行擬南芥野生型和轉基因植株的AtSOD和AtPOD基因的相對表達量測定。

上述測定均設3個重復，利用SPSS v20軟件進行差異顯著性分析（P<0.05）。

2結果與分析

2.1大豆轉錄因子GmMYC2L鑒定及GmMYC2L基因表達模式大豆GmMYC2L的氨基酸序列與三裂葉薯、番茄、芝麻、本氏煙草和擬南芥的MYC氨基酸序列比對結果如圖1所示。從圖中可以看出，大豆GmMYC2L與其他物種MYC2的氨基酸序列均具有典型的bHLH-MYC結構域和HLH結構域。

鹽脅迫及CK處理下大豆幼苗中GmMYC2L基因的表達情況如圖2所示。從圖可以看出，鹽脅迫3 h，大豆根中GmMYC2L的表達量明顯增加；6 h時表達量略有降低，但仍明顯高于無鹽脅迫對照；鹽脅迫3 h，大豆葉中GmMYC2L的表達水平也呈上調趨勢，上述結果說明GmMYC2L基因參與大豆對鹽脅迫的響應過程。

2.2大豆GmMYC2L蛋白的亞細胞定位

分別轉化融合質粒35S-GmMYC2L-GFP和pCAMBIA1300-GFP空載體的本氏煙草葉片細胞綠色熒光特征如圖3所示。從圖中可以看出，轉化pCAMBIA1300-GFP空載體的煙草葉片細胞細胞膜和細胞核中都能夠觀察到明顯的綠色熒光，而轉化重組質粒35S-GmMYC2L-GFP的煙草葉片細胞僅細胞核中有熒光信號分布，說明大豆GmMYC2L蛋白定位于細胞核。

2.3外源大豆基因GmMYC2L過表達擬南芥植株的篩選鑒定克隆GmMYC2L基因全長序列，插入pFGC5941載體35S啟動子下游，獲得基因過表達載體35S-GmMYC2L（圖4A）。含有潮霉素抗性的擬南芥幼苗能夠正常生長，即子葉正常展開，不含有潮霉素抗性的幼苗則在萌發(fā)后生長受到抑制（圖4B）。含有潮霉素抗性的擬南芥幼苗生長21 d后葉片PCR檢測結果顯示其含有外源Hyg基因（圖4C）。含有潮霉素抗性的擬南芥幼苗生長21 d后葉片半定量PCR分析結果顯示內參基因（AtACTIN2）在野生型擬南芥（WT）和抗性幼苗均有表達，證明RNA提取無誤。野生型擬南芥中大豆GmMYC2L基因不表達，而抗性幼苗中外源大豆基因GmMYC2L正常表達（圖4D），說明本研究建立的外源大豆基因GmMYC2L過表達擬南芥植株（OE）是可靠的。

2.4過表達GmMYC2L擬南芥植株的耐鹽性

常規(guī)MS培養(yǎng)基上野生型擬南芥植株（WT）和過表達GmMYC2L擬南芥植株（OE）的根長無顯著差異；150 mmol/L鹽脅迫下，過表達GmMYC2L擬南芥植株（OE）的根長顯著長于WT（圖5）。

清水灌溉對照，過表達GmMYC2L擬南芥植株（OE）和野生型擬南芥植株（WT）的長勢差異不大，單株鮮重無顯著差異；而150 mmol/L NaCl水溶液澆灌處理，過表達GmMYC2L擬南芥植株（OE）的長勢明顯好于WT植株，單株鮮重顯著高于WT植株（圖6，表2）。同樣，清水灌溉對照，過表達GmMYC2L擬南芥植株（OE）和野生型擬南芥植株（WT）葉片中MDA含量和H2O2含量亦無顯著差異，而150 mmol/L NaCl水溶液澆灌處理，過表達GmMYC2L擬南芥植株（OE）和野生型擬南芥植株（WT）葉片中MDA含量和H2O2含量均顯著增加，且野生型擬南芥植株（WT）葉片中MDA含量和H2O2含量顯著高于過表達GmMYC2L擬南芥植株（表2），上述結果說明過表達GmMYC2L擬南芥植株對鹽脅迫的耐受性增強。

2.5GmMYC2L對抗氧化酶活性及其基因表達量的影響清水灌溉對照，擬南芥WT和OE葉片中SOD活性和POD活性均無明顯差異；鹽脅迫處理，OE葉片中SOD活性和POD活性高于野生型植株。與酶活性相對應，鹽脅迫處理，過表達GmMYC2L擬南芥植株（OE）葉片中AtSOD基因和AtPOD基因的相對表達量顯著高于野生型擬南芥植株（WT）（表3）。

3討論

鹽脅迫已成為農作物生長的主要限制因素之一[22-25]，且中國鹽漬化耕地面積呈擴大趨勢[1]。挖掘作物耐鹽基因并進行耐鹽性品種選育已成為保障作物生產的重要手段。國內外學者在作物耐鹽性調控的生理機理、關鍵基因的挖掘和分子調控網絡解析方面已有較多成果[1]。轉錄因子在作物耐鹽性調控中處于核心位置[5-10]。轉錄因子MYC2參與植物生長調節(jié)、信號傳導、激素相互作用及多種非生物脅迫應答等過程[3，11]。茉莉酸處理條件下，擬南芥AtMYC2基因過表達，能促進擬南芥花青素的積累，但抑制根系生長[26]。IbMYC2基因的過表達能增強甘薯植株的耐鹽性[4]。大豆bHLH家族基因在調節(jié)金屬離子運輸和提高植株耐受生物脅迫方面的作用已有報道[18-19]。本研究發(fā)現大豆GmMYC2L蛋白也包含與其他植物類似的bHLH-MYC和HLH保守結構域，無鹽脅迫對照大豆根和葉中GmMYC2L基因表達水平較低，但鹽脅迫處理，大豆根和葉中GmMYC2L基因表達水平均明顯上調，且根中更加明顯。根是作物響應鹽脅迫最早的器官，GmMYC2L基因在根中迅速上調是作物根系對鹽脅迫響應的具體表現。

甘藍型油菜BnMYC2基因能調節(jié)氣孔開閉，進而提高油菜的耐旱性[27]。Deng等[17]發(fā)現過表達丹參SmMYC2的轉基因擬南芥和丹參毛狀根的耐鹽性更強，主要原因是轉基因植株在鹽脅迫處理下比野生型植株具有更高的抗氧化酶活性以及更低的MDA含量和活性氧（ROS）含量[17]。但擬南芥AtMYC2基因過表達則導致轉基因植株耐鹽性明顯降低[16]。因此，不同植物的MYC2基因功能是不保守的。本研究通過構建GmMYC2L基因過表達載體并獲得轉GmMYC2L基因擬南芥植株（OE），發(fā)現GmMYC2L基因過表達不影響擬南芥植株的正常生長，在培養(yǎng)基和營養(yǎng)土上擬南芥野生型和轉基因植株的生長狀況無明顯差異；而在鹽脅迫處理下，轉基因植株的幼苗根長顯著長于野生型植株，擬南芥幼苗地上部的單株鮮重亦明顯優(yōu)于野生型植株，說明GmMYC2L基因過表達賦予擬南芥植株更強的鹽脅迫適應能力。但是，Wang等[20]研究顯示大豆GmMYC2負調控植物耐鹽性，分析發(fā)現其報道的GmMYC2基因（Glyma.08G271900）與本研究基因GmMYC2L均被注釋為MYC2，二者相似性為87.37%，進一步證明植物MYC2同源基因功能的多樣性。通常非生物脅迫會導致活性氧（ROS）在植株中過量積累，造成細胞的氧化傷害，進而降低酶活性，抑制植物生長[28]。植物可以通過激活抗氧化酶（如SOD和POD）活性，維持細胞ROS穩(wěn)態(tài)，減少對植株的損害[29]。脯氨酸是重要的滲透調節(jié)物質，可降低逆境下細胞的滲透電位，增強細胞吸水量，減輕逆境對植物生長的影響[30]。本研究發(fā)現大豆GmMYC2L調節(jié)植物耐鹽性的生理機制與丹參SmMYC2類似，過表達GmMYC2L植株在鹽脅迫下積累更少的MDA和H2O2，同時SOD和POD活性增強；對應的基因AtSOD、AtPOD也在鹽脅迫處理的OE中表現出更高的表達水平。即大豆bHLH家族轉錄因子GmMYC2L能夠通過激活抗氧化途徑，提高抗氧化酶活性，清除鹽脅迫導致的過量活性氧，從而增強植物的耐鹽性。本研究結果為大豆和其他作物耐鹽性遺傳改良提供依據和基因資源。

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（責任編輯：石春林）