葡萄VvLBD35和VvLBD36的生物信息學(xué)與表達(dá)分析

摘要：LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN（LBD）家族是含有高度保守的LOB結(jié)構(gòu)域的一類植物特有轉(zhuǎn)錄因子，參與植物的生長代謝以及多種逆境脅迫應(yīng)答等過程。本研究通過生物信息學(xué)方法對(duì)葡萄LBD基因家族中的VvLBD35和VvLBD36進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系分析，并利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)兩個(gè)基因的組織表達(dá)模式以及在干旱、高鹽、高溫和低溫條件下的誘導(dǎo)表達(dá)模式。結(jié)果顯示，VvLBD35和VvLBD36均含有α-螺旋、無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，VvLBD36還含有較多的3-折疊結(jié)構(gòu)；VvLBD35和VvLBD36與擬南芥、水稻、玉米、柑橘和番茄等植物中的LBD蛋白都有較高的同源性；VvLBD35和VvLBD36的啟動(dòng)子區(qū)含有多種脅迫、激素以及生長發(fā)育相關(guān)的應(yīng)答元件：VvLBD35和VvLBD36在根、莖、葉中均有不同程度的表達(dá)，且均在葉中表達(dá)量最高，約是根和莖中的2-8倍：誘導(dǎo)表達(dá)模式分析表明，VvLBD35受高溫誘導(dǎo)最為顯著，下調(diào)至約為對(duì)照的6%，而VvLBD36受高鹽和高溫的誘導(dǎo)最為顯著，分別上調(diào)至對(duì)照的5.67倍和14.29倍。本研究為進(jìn)一步深入揭示VvLBD35和VvLBD36的生物學(xué)功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：葡萄；LBD家族：序列分析；表達(dá)分析；非生物脅迫

中圖分類號(hào)：S663.1：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024） 08-0023-07

LBD轉(zhuǎn)錄因子家族，又稱為AS2（asymmetricleaves 2-like）/LOB基因家族，因其編碼蛋白中均含有一段LOB （lateral organ boundaries）結(jié)構(gòu)域而得名。LOB結(jié)構(gòu)域一般含有3種保守的基序，即類鋅指結(jié)構(gòu)域、Gly-Ala-Ser（GAS）結(jié)構(gòu)域以及類亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。LBD轉(zhuǎn)錄因子家族根據(jù)LOB結(jié)構(gòu)域的完整性可分為Ⅰ類和Ⅱ類。Ⅰ類包含3種完整的結(jié)構(gòu)域，而且GAS結(jié)構(gòu)域與類亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域之間能夠通過形成“螺旋卷曲”結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用。Ⅱ類具有一個(gè)殘缺的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，但Ⅱ類基因家族較Ⅰ類相對(duì)保守。LBD基因家族中Ⅰ類成員較多。研究顯示，LBD蛋白間一般以形成異源二聚體的形式發(fā)揮生物學(xué)作用。

目前，已在多種植物中鑒定到LBD基因家族成員，在擬南芥中鑒定到43個(gè)、大麥中24個(gè)、番茄中46個(gè)、玉米中44個(gè)、毛果楊中57個(gè)LBD基因。LBD轉(zhuǎn)錄因子參與植物的生長代謝以及多種逆境脅迫應(yīng)答等過程。擬南芥中鑒定到AtLBD16、AtLBD29在生長素響應(yīng)因子ARF7介導(dǎo)的側(cè)根發(fā)育以及溫度依賴性愈傷組織的形成中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用：AtLBD15通過參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控植物的干旱脅迫應(yīng)答：AtLBD27參與擬南芥器官的發(fā)生過程；AtLBD18、AtLBD30、AtLBD36等在擬南芥導(dǎo)管分化、細(xì)胞壁形成和花發(fā)育中均可發(fā)揮重要的作用：AtLBD37、AtLBD39調(diào)控?cái)M南芥花青素的形成和氮響應(yīng)過程。PtLBD1參與調(diào)控楊樹次生生長過程。小立碗蘚受甘露醇誘導(dǎo)后大多數(shù)PpLBDs表達(dá)量均上調(diào)，可能會(huì)增加植株的耐旱性。菊花CmLBD1的表達(dá)受生長素調(diào)節(jié)并參與不定根原基的形成過程。農(nóng)作物中也鑒定到一些LBDs廣泛地參與到對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答以及植物生長發(fā)育調(diào)控過程。比如，玉米ZmLBD2和ZmLBD5均參與干旱脅迫響應(yīng)的調(diào)控過程，ZmLBD19調(diào)控植物器官發(fā)生的過程：馬鈴薯StLBD2 -6和StLBD3-5的表達(dá)受干旱脅迫誘導(dǎo)，可能參與干旱脅迫應(yīng)答：水稻Ⅱ類LBD蛋白OsLBD37和Os-LBD38介導(dǎo)抽穗期的生長調(diào)控：番茄SlLBD40介導(dǎo)茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控干旱脅迫應(yīng)答：小麥TaLBD16 - 4D參與植株結(jié)構(gòu)和抽穗期的調(diào)控：大豆GmLBD12經(jīng)干旱和多種激素等脅迫處理后被顯著誘導(dǎo)。然而，與擬南芥和農(nóng)作物相比，經(jīng)濟(jì)作物葡萄LBD基因家族的研究卻相對(duì)較少，與逆境脅迫的關(guān)系更是鮮有報(bào)道。

葡萄作為一種具有較高營養(yǎng)價(jià)值的經(jīng)濟(jì)作物，種植歷史悠久，在全世界范圍內(nèi)被廣泛種植。然而，全球氣候變暖、工業(yè)污染、干旱、土壤鹽堿化等非生物脅迫的加劇嚴(yán)重影響著葡萄的生長過程。因此，研究葡萄脅迫應(yīng)答相關(guān)基因、挖掘耐脅迫基因資源，為后續(xù)有針對(duì)性地進(jìn)行脅迫應(yīng)答相關(guān)基因的改造以培育具有多種脅迫抗性的新品種有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

前期研究通過生物信息學(xué)和同源性分析鑒定到葡萄中存在40個(gè)LBD基因（VvLBDl -VvLBD40），本研究通過生物信息學(xué)方法分析葡萄LBD基因家族成員VvLBD35和VvLBD36的基因結(jié)構(gòu)特征和進(jìn)化關(guān)系，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)兩者在葡萄根、莖、葉中的組織表達(dá)模式以及在干旱、高鹽、高溫和低溫條件下的誘導(dǎo)表達(dá)模式，為進(jìn)一步揭示VvLBD基因家族應(yīng)答逆境脅迫的生物學(xué)作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和處理

葡萄品種為‘貴妃’，于2021年9月在日光溫室中按照品種最適條件進(jìn)行常規(guī)管理。葡萄種子首先置于4℃條件下層積，2d后移入25℃、16h光照/8 h黑暗的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。分別收集培養(yǎng)4周后葡萄植株的根、莖、葉組織，經(jīng)液氮速凍后移入-80℃超低溫冰箱保存。

誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)：采用干旱（200 mmol/L甘露醇）、高鹽（300 mmol/L NaCl）、高溫（42℃）和低溫（4℃）分別處理生長4周的葡萄植株6h；以正常條件下的葡萄植株作為對(duì)照。脅迫處理后收集葡萄葉片并立即用液氮冷凍保存。

1.2 VvLBD35和VvLBD36蛋白的亞細(xì)胞定位及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

從Phytozome數(shù)據(jù)庫（http：//www.phytozome.org/）下載葡萄VvLBD35和VvLBD36的核苷酸和氨基酸序列，通過查閱LBD轉(zhuǎn)錄因子保守基序的研究結(jié)果，依據(jù)其保守基序的序列特征，分析繪制VvLBD35和VvLB’D36的基因序列圖：使用WoLFPSORT在線網(wǎng)站（https：//www.genscript．com/wolf-psort.html）進(jìn)行VvLBD35和VvLBD36的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；利用SWISS-MODEL（http：//swissmod-el．expasy. org）在線預(yù)測(cè)葡萄VvLBD35和Vv-LBD36蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3 VvLBD35和VvLBD36的序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

采用DNAMAN生物學(xué)軟件對(duì)葡萄VvLBD35與擬南芥AtLBD27、水稻Os0890402100、玉米2mOOOOleb042180、柑橘CcLBD6、番茄SILBD27進(jìn)行氨基酸保守域序列比對(duì)，對(duì)VvLBD36與擬南芥AtLBD38、水稻OsLBD37、玉米2mOOOOleb326200、柑橘CICLE_v10026374mg、番茄Solyc029092550進(jìn)行氨基酸保守域序列比對(duì)。利用ClustalX軟件對(duì)葡萄、擬南芥、水稻、玉米、柑橘、番茄6個(gè)物種的蛋白序列進(jìn)行分析比對(duì)。利用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 VvLBD35和VvLBD36的順式作用元件分析

利用PlantCARE（http：//bioinformatics. psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/）在線預(yù)測(cè)葡萄VvLBD35和VvLBD36啟動(dòng)子區(qū)（約2 000 bp）存在的順式作用元件，最后利用TBtools軟件進(jìn)行可視化繪圖。

1.5 葡萄總RNA提取與qRT-PCR檢測(cè)

利用RN03 RNA提取試劑盒（北京Aidlab公司）提取葡萄組織總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cD-NA。qRT-PCR檢測(cè)采用Bio-Rad CFX96系統(tǒng)，使用Takara的SYBR Green PCR Master Mix試劑盒。VvActin作為內(nèi)參基因，測(cè)定VvLBD35和Vv-LBD36在葡萄不同組織以及不同脅迫處理下葉片中的表達(dá)模式，重復(fù)3次。引物信息見表1。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

利用2 -AAC‘法計(jì)算VvLBD35和VvLBD36基因的相對(duì)表達(dá)量。利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析，采用最小顯著差數(shù)法（LSD）進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 VvLBD35和VvLBD36蛋白亞細(xì)胞定位及三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

VvLBD35和VvLBD36分別編碼301、222個(gè)氨基酸，對(duì)其編碼蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示，VvLBD35具有典型的C-block基序CAACK-YQRRKCSSEC，結(jié)構(gòu)模式符合CX2CX6CX3C，屬于LBD基因家族的Ⅰ類：而VvLBD36則不具有以上基序特征，含有一個(gè)殘缺的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，表明其屬于Ⅱ類。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Vv-LBD35和VvLBD36可能均定位于細(xì)胞核。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果（圖1）顯示，VvLBD35包含多個(gè)α螺旋，無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角較少，未發(fā)現(xiàn)β-折疊；VvLBD36包含少量的α螺旋，較多的β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。

2.2 VvLBD35和VvLBD36的氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

如圖2所示，通過對(duì)VvLBD35和VvLBD36蛋白與其他5個(gè)物種LBD家族成員分別進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)，VvLBD35與擬南芥AtLBD27、水稻Os08g0402100、玉米2m0000leb042180、柑橘CcLBD6、番茄SILBD27均包含保守LOB結(jié)構(gòu)域中的C基序，該序列的相似性高達(dá)85%，全部序列的相似性為33%（圖2A）；VvLBD36與擬南芥AtLBD38、水稻OsLBD37、玉米2mOOOOleb326200、柑橘CICLE_v10026374mg、番茄Solyc02g092550的序列相似性達(dá)到61%（圖2B）。表明6種LBD家族成員的N端區(qū)域高度保守，C端區(qū)域具有特異性，為可變C端。圖2 VvLBD35（A）和VvLBD36（B）與其他物種LBD氨基酸序列比對(duì)

為了進(jìn)一步了解VvLBD35和VvLBD36轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA7.0軟件對(duì)12種LBD蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果（圖3）顯示，VvLBD35轉(zhuǎn)錄因子與番茄SILBD27、擬南芥AtLBD27同源性較高，系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系較近，其次是玉米2m00001eb042180、水稻Os08g0402100以及柑橘CcLBD6; VvLBD36與擬南芥AtLBD38、番茄Solyc02g092550以及柑橘CICLE_v10026374mg同源性較高，系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系較近，其次是水稻Os-LBD37和玉米2m00001eb326200。

2.3 VvLBD35和VvLBD36啟動(dòng)子順式作用元件分析

為了解VvLBD35和VvLBD36的潛在功能和調(diào)控機(jī)制，利用PlantCARE在線軟件分別提取葡萄VvLBD35和VvLBD36約2 000 bp的啟動(dòng)子序列，并進(jìn)行順式作用元件分析。如圖4所示，Vv-LBD35啟動(dòng)子上分布有脫落酸作用元件（ABRE）、茉莉酸甲酯作用元件（CGTCA -motif）、生長素反應(yīng)元件（TGA - element）、光響應(yīng)元件（TCCC-motif）、低溫反應(yīng)元件（LTR）以及干旱脅迫反應(yīng)元件（MBS）等；VvLBD36啟動(dòng)子區(qū)域則含有赤霉素（P-box）、水楊酸（TCA-element）、氧脅迫（GC -motif）和茉莉酸甲酯（CGTCA - motif和TGACG-motif）響應(yīng)等相關(guān)的順式作用元件；同時(shí)，這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子中還含有與生長發(fā)育相關(guān)的元件，如胚乳發(fā)育元件（GCN4_motif）和分生組織表達(dá)元件（CAT-box）等。表明VvLBD35和VvLBD36可能在葡萄的非生物脅迫應(yīng)答和生長發(fā)育方面均發(fā)揮著重要作用。

2.4 VvLBD35和VvLBD36的組織表達(dá)模式分析

為分析VvLBD35和VvLBD36在葡萄不同組織中的表達(dá)情況，以生長4周的葡萄不同組織的cDNA為模板，利用qRT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)Vv-LBD35和VvLBD36在葡萄根、莖和葉中的表達(dá)量。結(jié)果（圖5）顯示，VvLBD35和VvLBD36在根、莖和葉中均有表達(dá)，且均在葉中表達(dá)量最高，約是根和莖中的2-8倍?？梢姡琕vLBD35和VvLBD36在葡萄不同組織中表達(dá)程度不同，這可能與其在不同組織中的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。

2.5 VvLBD35和VvLBD36的誘導(dǎo)表達(dá)模式分析

VvLBD35和VvLBD36在不同誘導(dǎo)處理下的表達(dá)模式分析結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，各誘導(dǎo)條件F VvLBD35的表達(dá)量均顯著降低，以高溫條件下降低最顯著，下調(diào)至約為對(duì)照的6%（圖6A）；Vv-LBD36受高鹽和高溫條件誘導(dǎo)表達(dá)水平顯著升高，分別為對(duì)照的5.67倍和14.29倍，而干旱和低溫處理幾乎不影響VvLBD36的表達(dá)（圖6B）。

3 討論與結(jié)論

轉(zhuǎn)錄因子作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控最后一環(huán)的關(guān)鍵因子，是近年來植物逆境脅迫分子機(jī)制研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。葡萄在栽培種植過程中極易遭受逆境脅迫，為更加有效地控制非生物脅迫對(duì)葡萄的危害，提高經(jīng)濟(jì)效益，葡萄的抗逆性尤其是耐低溫、耐高溫、干旱抗性以及響應(yīng)鹽害的能力亟待提高。為了能更好地了解葡萄轉(zhuǎn)錄因子LBD蛋白的結(jié)構(gòu)特征和表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)，本研究對(duì)葡萄Vv-LBD35和VvLBD36進(jìn)行了蛋白特征的預(yù)測(cè)，分析了兩個(gè)基因在葡萄主要組織中的內(nèi)源表達(dá)規(guī)律以及不同脅迫條件下的誘導(dǎo)表達(dá)模式，為深入揭示VvLBD35和VvLBD36響應(yīng)逆境脅迫的調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

LBD基因已經(jīng)在許多植物中被鑒定且大部分成員都屬于I類。毛果楊57個(gè)LBD基因中I類占79%：水稻基因組中鑒定到35個(gè)LBD基因，其中I類成員占比高達(dá)86%：小立碗蘚基因組中鑒定到31個(gè)LBD轉(zhuǎn)錄因子，屬于I類的成員占比為77%。前人由于研究策略、查詢序列、數(shù)據(jù)庫選擇等差異在葡萄基因組中分別鑒定到了40、50、30個(gè)LBD家族成員，而且經(jīng)過基因分析發(fā)現(xiàn)大部分成員也歸屬于I類家族。本研究通過對(duì)葡萄VvLBD35和VvLBD36基因進(jìn)行蛋白特征分析得知，VvLBD35屬于I類，具有CX，CX6CX3C的結(jié)構(gòu)模式：而VvLBD36則不具有以上基序特征，只含有1個(gè)殘缺亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，證明Vv-LBD36轉(zhuǎn)錄因子屬于Ⅱ類亞家族。

截至目前，LBD轉(zhuǎn)錄因子在多個(gè)物種響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮的作用已被驗(yàn)證。擬南芥AtLBD15、番茄SILBD40、馬鈴薯StLBD1 -5以及小立碗蘚PpLBDs等參與了植物的干旱脅迫應(yīng)答；大豆GmLBD12受干旱、低溫等多種因素的顯著誘導(dǎo)：16個(gè)BnLBDs能夠提高苧麻植株的耐熱性：辣椒中I類LBD基因在響應(yīng)高溫脅迫時(shí)表達(dá)量明顯低于Ⅱ類LBD基因。

通過對(duì)葡萄VvLBD35和VvLBD36啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，二者啟動(dòng)子區(qū)域均含有與非生物脅迫應(yīng)答相關(guān)的元件。誘導(dǎo)表達(dá)模式分析顯示，高溫條件下VvLBD35的表達(dá)顯著下調(diào)，同樣VvLBD36受高溫脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)最為顯著，表明，VvLBD35和VvLBD36可能在植物響應(yīng)高溫脅迫中發(fā)揮重要作用。另外，誘導(dǎo)表達(dá)模式分析表明葡萄VvLBD36也受到高鹽脅迫的誘導(dǎo)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示葡萄LBD轉(zhuǎn)錄因子在高溫等非生物脅迫應(yīng)答中的作用和抗性機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（ZR2022MC064）；作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（2021KF06）；濰坊學(xué)院博士科研基 金項(xiàng)目（2023BS19）