明小花蝽卵黃原蛋白的鑒定及表達(dá)分析

摘要：本研究對明小花蝽Orius nagaii的卵黃原蛋白（vitellogenin，vg）進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析、原核表達(dá)、抗體制備以及時(shí)空動(dòng)態(tài)表達(dá)分析，旨在為昆蟲卵黃原蛋白的研究提供理論依據(jù)。用RACE方法克隆出OnVg基因全長，運(yùn)用生物信息網(wǎng)站分析OnVg蛋白得出其具有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：脂蛋白N端結(jié)構(gòu)域、未知功能結(jié)構(gòu)域以及血管性血友病因子結(jié)構(gòu)域。構(gòu)建On Vg的原核表達(dá)載體pET-32a-c（+）-OnVg，轉(zhuǎn)至大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過免疫昆明小鼠制備了anti-OnVg抗體。Western blot結(jié)果顯示anti-OnVg抗體與OnVg蛋白能夠特異性結(jié)合。qPCR檢測vg基因在明小花蝽若蟲、成蟲階段和成蟲不同組織中的時(shí)空動(dòng)態(tài)表達(dá)，結(jié)果表明vg基因在若蟲階段最低，成蟲階段表達(dá)量升高且3d時(shí)表達(dá)水平達(dá)到最高：成蟲腹部表達(dá)量最高，其次是腸道和卵巢。本研究結(jié)果可為探究明小花蝽的生殖調(diào)控機(jī)理提供理論支持。

關(guān)鍵詞：明小花蝽：卵黃原蛋白：原核表達(dá)：抗體制備；時(shí)空表達(dá)

中圖分類號(hào)：S476.2：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024） 08-0137-09

小花蝽（Orius spp.）屬半翅目花蝽科，原產(chǎn)于亞洲，目前在世界各國均有分布。作為一類重要的廣食性捕食性天敵昆蟲，小花蝽被廣泛應(yīng)用于防治田間及溫室中的蚜蟲、薊馬、螨類等多種小型害蟲以及部分鱗翅目害蟲。明小花蝽（Orius nagaii）隸屬小花蝽屬，目前僅有少量關(guān)于其分布和內(nèi)生共生菌的報(bào)道，其飼養(yǎng)技術(shù)、生物學(xué)、生理學(xué)及防害應(yīng)用等方面還未見報(bào)道。通過室內(nèi)飼養(yǎng)明小花蝽，發(fā)現(xiàn)其適應(yīng)能力強(qiáng)、產(chǎn)卵量高，且易于在室內(nèi)大量擴(kuò)繁，極具商業(yè)化飼養(yǎng)潛力。

卵黃原蛋白（vitellogenin，vg）是一種脂肪體細(xì)胞蛋白，其表達(dá)受性別、組織以及生長歷期調(diào)控。在雌性成蟲脂肪體中，vg被特異性合成，隨后經(jīng)過切割、糖基化和磷酸化等一系列過程，最終釋放到血腔中，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被卵巢攝取，在卵巢內(nèi)被進(jìn)一步修飾形成并發(fā)育成卵子。雌性昆蟲的生殖過程受保幼激素和蛻皮激素調(diào)控，vg是主要分子靶點(diǎn)，但是不同昆蟲受激素調(diào)節(jié)存在差異，例如蜜蜂、果蠅受蛻皮激素調(diào)控，黏蟲受保幼激素調(diào)控，而斜紋夜蛾受蛻皮激素和保幼激素共同調(diào)控。

國內(nèi)有關(guān)小花蝽的報(bào)道更多是關(guān)于捕食功能反應(yīng)、毒性試驗(yàn)、營養(yǎng)物質(zhì)選擇等領(lǐng)域，對其繁殖關(guān)鍵因子的分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究甚少。本研究利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲取vg基因cDNA片段，采用RACE技術(shù)克隆明小花蝽vg基因全長，運(yùn)用生物信息學(xué)網(wǎng)站分析明小花蝽vg蛋白基因（OnVg）結(jié)構(gòu)特征，構(gòu)建pET-32a-c（+）-OnVg原核表達(dá)載體，并制備蛋白特異性抗體，通過熒光定量PCR分析vg基因在明小花蝽若蟲、成蟲階段，以及成蟲頭、胸、腹、卵巢、腸道組織中的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究OnVg的功能及其在生殖中的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

明小花蝽來自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院天敵昆蟲實(shí)驗(yàn)室，試驗(yàn)開始于2022年2月。飼養(yǎng)條件：溫度（26±1）℃，濕度（60+5）%，光照周期L：D=16 h：8h，以蕓豆和米蛾卵喂養(yǎng)。

1.2 Vg蛋白的結(jié)構(gòu)分析

使用NovoPro（https： //www. novopro. cn/tools/tmhmm. html）網(wǎng)站的在線工具進(jìn)行蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測；使用EMBL（http：//smart. embl- heidelberg.de/）中的SMART程序鑒定其功能結(jié)構(gòu)域：使用DNAMAN 6.0.3.99中文版翻譯成氨基酸序列。

1.3 引物設(shè)計(jì)

使用Primer3Plus（https：//www. primer3plus.com/index.html）網(wǎng)站設(shè)計(jì)引物（表1）。RACE試驗(yàn)委托上海植碩生物科技有限公司完成，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 明小花蝽vg基因全長克隆

1.4.1 核心片段擴(kuò)增

取約20 mg明小花蝽置于2 mL的離心管中，放于液氮中冷凍研磨，使用Tr-izol法提取總RNA。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用核心引物OnVg-f/OnVg-r（表1），對提取的總RNA進(jìn)行RT-PCR。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，按照Vazyme的phanta max fidelity DNA polymerase說明書獲得核心序列。

1.4.2 5’/3 'RACE克隆基因全長

根據(jù)核心序列設(shè)計(jì)RACE引物并進(jìn)行5'RACE和3'RACE。5'RACE依照5’/3'RACE Kit，2nd Generation（Roche）說明書，使用引物Vg-5' RACE -rt-r進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；得到的cDNA經(jīng)引物Vg-5 'RACE-rl和Oligo dT-Anchor Primer（Vial 8）進(jìn)行第一輪PCR;以第一輪PCR產(chǎn)物為模板使用引物Vg-5' RACE-r2和PCR Anchor Primer（Vial 9）進(jìn)行第二輪巢式PCR0 3'RACE依照3'Full RACE Core Kit（Taka-ra）說明書，使用Vg-3' RACE-fl引物和3'RACEOuter Primer進(jìn)行第一輪PCR;以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，使用引物Vg-3'RACE-f2和3'RACEControl Inner Primer進(jìn)行第二輪嵌套PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化，送至生工進(jìn)行測序，將5' RACE、核心序列及3'RACE拼接在一起，得到OnVg cDNA的全長序列。

1.5 PCR擴(kuò)增

提取明小花蝽總RNA，使用PrimeScript RTreagent Kit（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，參考祝晴、李佳鵬等的擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序，其中上、下游引物On-Vg-1 F/R和OnVg - 2F/R各2μL，cDNA模板1μL；反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30-35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR結(jié)束后電泳檢測目的條帶（960 bp）。

1.6 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

按照膠回收試劑盒（北京聚合美生物科技有限公司）的使用說明，將正確的凝膠條帶回收純化。將回收產(chǎn)物與pET-32a-c（+）（Novagen）載體分別用限制性內(nèi)切酶BamH I（Thermo）、NotI（Thermo）進(jìn)行雙酶切。利用T4連接酶（TaKaRa）進(jìn)行連接，構(gòu)成重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素（Ampr）抗性的LB固體培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)13 - 16 h后挑取菌落。將單菌落置于1.5 mL離心管中（離心管中放人500 μL含Ampr的LB液體培養(yǎng)基），37℃、220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)12 -14 h后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，以獲得含目的基因的重組載體pET-32a-c（+）-OnVg。

1.7 Vg蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

取2 μL測序正確的pET-32a-c（+）-OnVg重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E．coli BL21感受態(tài)細(xì)胞（天根生化科技有限公司）中，培養(yǎng)在含Ampr的LB固體培養(yǎng)基上，37℃高速振蕩12 -14 h后觀察并挑取菌落。將單菌落懸浮于15mL離心管（離心管中放人3 mL含Ampr的LB液體培養(yǎng)基），37℃、220 r／min振蕩培養(yǎng)12 - 16 h，菌液渾濁后轉(zhuǎn)入100 mL液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。后續(xù)菌液OD00。值在0.6左右時(shí)，加入1mg/mL IPTG（索萊寶）進(jìn)行誘導(dǎo)，37℃、150 r/min搖5-6 h后，8 000 r／min低溫離心10- 12 min收集菌體。

收集未誘導(dǎo)與誘導(dǎo)樣品菌體，加5 mL細(xì)胞裂解液（CLB：GLPBLO為99：1），經(jīng)超聲波破碎，于10 000 r/min、4℃離心10- 12 min后收集上清和沉淀，1×SDS - PAGE蛋白上樣緩沖液與上清1：1混合，2xSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液與沉淀按照2：1混合，振蕩儀充分振蕩后，于100℃沸水中變性5 min，進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測。檢測合格后分裝，- 80℃保存，用于后續(xù)的抗體制備。

1.8 Western blot

將免疫印記膜用甲醇處理約15 s，按照三明治結(jié)構(gòu)方法（濾紙-PVDF膜-凝膠-濾紙），60 V或300mA轉(zhuǎn)膜3h。參考祝晴、李佳鵬等的方法進(jìn)行奶粉封閉、一抗和二抗孵育，使用His標(biāo)簽抗體和anti- OnVg血清抗體進(jìn)行蛋白檢測。

1.9 Vg抗體制備

將正確的重組蛋白膠條研磨，用O.go-/o生理鹽水稀釋。昆明小鼠提前喂養(yǎng)2-3 d，每只20 9左右。用1 mL針管注射300 - 400 μL稀釋液到小鼠腹腔，每周注射一次，持續(xù)4周。第5周眼球取血至1.5 mL離心管，37℃水浴1h，4℃冰箱放置6h后，12 000 r/min、4℃離心13 - 15 min，取上清，置于液氮冷凍至發(fā)白狀態(tài)后放入-800C凍存，或用血清加60％甘油稀釋后-20℃冰箱保存。

1.10 明小花蝽卵巢蛋白提取

將羽化3d后的明小花蝽置于PBS中進(jìn)行卵巢解剖，提取蛋白。研磨液制備：蛋白裂解液（RI-PA）200 μL、磷酸酶抑制劑4μL、1×蛋白酶抑制劑2 μL、100x PMSF 2μL混合在一起，所有試劑配制在冰上操作。明小花蝽卵巢（n≥40）中加入200 μL研磨液進(jìn)行研磨，放人冰盒靜置30min，12 000 r/min、4℃離心5- 10 min，取上清液；上清液與蛋白上樣緩沖液4：1混合，100℃金屬浴5min。

1.11 OnVg基因的時(shí)空表達(dá)

分別取卵、1-5齡若蟲和羽化1、3、5、7、9、10d的雌成蟲（n≥35），及羽化后12-24 h雌成蟲的頭、胸、腹、卵巢、腸道組織（n≥40）。提取總RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，而后以cDNA為模板，Actin為內(nèi)參，引物見表1，使用思科捷2x SYBR GreenqPCR Mix（With ROX）試驗(yàn)盒檢測OnVg的相對表達(dá)。qPCR反應(yīng)體系20 μL：上、下游引物各0.4μL，ddH2O 6.8 μL，cDNA模板2μL（cDNA稀釋10倍），2x SYBR qPCR Mix 10 μL， ROX ReferenceDyeⅡ0.4 μL。反應(yīng)程序（二步法）：95℃預(yù)變性20 s;90℃變性3s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理組進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，4個(gè)技術(shù)重復(fù)。結(jié)果用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

1.12 數(shù)據(jù)分析

使用PASW Statistics 18軟件（SPSS Inc.，Chi-cago．IL，USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OnVg基因的核心片段及基因全長

根據(jù)已知序列，設(shè)計(jì)了核心序列引物，進(jìn)行核心片段擴(kuò)增，開放閱讀框長5 973 bp（圖1A）?；蛱禺愐?'RACE-r1和5'RACE-r2分別與試劑盒自帶引物進(jìn)行第一輪、第二輪5'RACE試驗(yàn)。通過第一輪PCR得到了彌散條帶（圖IB，條帶2），以第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二輪巢式PCR，得到一條清晰的條帶（圖1B，條帶3）。3'RACE步驟同上，進(jìn)行第二輪巢式PCR，得到一條清晰的條帶（圖1C）。

2.2 OnVg基因序列分析

OnVg基因cDNA全長6 133 bp，其中開放閱讀框長5 973 bp，翻譯成1 990個(gè)氨基酸，去掉信號(hào)肽，約219.33 kDa，包含3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：脂蛋白N端結(jié)構(gòu)域（LPD_N）、未知功能結(jié)構(gòu)域（un-known functuin，DUF1943）以及血管性血友病因子結(jié)構(gòu)域（von Willebrand factor type D domain．vWD）。選取灰色陰影部分960 bp堿基（圖2），杜會(huì)玲，等：明小花蝽卵黃原蛋白的鑒定及表達(dá)分析約32 kDa，進(jìn)行PCR克隆及測序。對序列進(jìn)行位點(diǎn)切割，切割位點(diǎn)RSRR將其分解成大、小兩個(gè)亞基，預(yù)測大亞基為173.74 kDa，不含信號(hào)肽的小亞基為41.69 kDa。結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增序列長度正確，無突變堿基（圖3）。

2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

將OnVg擴(kuò)增片段與pET-32a-c（+）載體經(jīng)帶有酶切位點(diǎn)的引物PCR擴(kuò)增（圖4），構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-32a-c（+）-OnVg。利用通用引物經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，得到的片段大小基本符合預(yù)期（圖5），表明載體構(gòu)建成功，可用于誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。

2.4 重組蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的上清和沉淀分別進(jìn)行聚丙烯酰胺蛋白電泳檢測，Bradford法染色后發(fā)現(xiàn)，pET-32a-c（+）-OnVg的重組質(zhì)粒大小在55 kDa左右（圖6），為圖2灰色陰影部分蛋白分子量32kDa加上載體修飾，目的蛋白主要以沉淀形式表達(dá)，在上清中表達(dá)不明顯。Western blot結(jié)果（圖7）顯示，目的蛋白與His抗體能夠很好地結(jié)合，55kDa處的條帶與預(yù)期大小一致，證明重組蛋白正確表達(dá)。

2.5 抗體制備與檢測

將重組蛋白經(jīng)切膠研磨后配制成生理鹽水稀釋液，注射到昆明小鼠體內(nèi)，5周后收集血清，檢測血清抗體anti- OnVg。用稀釋5 000倍的血清對誘導(dǎo)樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果（圖8）條帶單一且清晰，與預(yù)期相符，可滿足免疫組化和Western blot試驗(yàn)的要求。用anti-OnVg血清抗體檢測明小花蝽卵巢蛋白樣品，結(jié)果（圖9）顯示，在抗體稀釋5 000倍時(shí)，蛋白條帶清晰，符合預(yù)測的蛋白分子量173.74 kDa。

2.6 OnVg序列時(shí)空動(dòng)態(tài)表達(dá)

以Actin為內(nèi)參，qPCR檢測OnVg基因在明小花蝽若蟲階段、成蟲階段和雌成蟲不同組織部位的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式，表明OnVg在不同發(fā)育階段和成蟲不同組織中的表達(dá)均有波動(dòng)。其在成蟲腹部相對表達(dá)水平最高，其次是腸道和卵巢，在胸部和頭部的表達(dá)水平最低（圖10A）。整個(gè)若蟲階段OnVg的表達(dá)水平較低且各階段間無顯著差異；成蟲階段表達(dá)水平變化較大，3d時(shí)達(dá)到高峰，7d時(shí)降至最低，后再次上升，但顯著低于3d時(shí)（圖10B）。

3 討論與結(jié)論

卵黃原蛋白可以向胚胎提供多種營養(yǎng)物質(zhì)，供其發(fā)育產(chǎn)卵，例如各種氨基酸、磷、脂質(zhì)、碳水化合物、維生素等。在絕大多數(shù)昆蟲中，vg是由約6 000-7 000 bp堿基編碼的約220 kDa的大分子膜蛋白，大亞基（140 - 190 kDa）和小亞基（40-60 kDa） -般在分泌到血腔前被切割，大亞基往往輸送至卵巢。根據(jù)氨基酸序列分析，昆蟲Vg十分保守，有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：位于N端的卵黃原蛋白N端結(jié)構(gòu)域（vitellogenin N domain，VitN）、中間區(qū)域的未知功能結(jié)構(gòu)域以及位于C端的血管性血友病因子結(jié)構(gòu)域：在N端有一個(gè)多聚絲氨酸區(qū)域，其具體功能尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。

通過對明小花蝽Vg基因序列的分析發(fā)現(xiàn)，其總長6 133 bp，編碼1 990個(gè)氨基酸，去掉信號(hào)肽，分子量為219.33 kDa左右。本研究用于原核表達(dá)的Vg肽鏈N區(qū)是一個(gè)脂蛋白結(jié)構(gòu)域，主要用于脂質(zhì)運(yùn)輸，表達(dá)的vg重組蛋白為55 kDa左右，理論上用Vg重組蛋白免疫小鼠制備的多克隆抗體對Vg大、小亞基都應(yīng)有免疫反應(yīng)，但Western blot結(jié)果顯示在明小花蝽雌蟲卵巢中，只檢測出vg的大亞基（173.74 kDa左右），在RSRR進(jìn)行位點(diǎn)切割，結(jié)果符合預(yù)測的大亞基的蛋白分子量。相關(guān)研究表明，斜紋夜蛾Vg抗體在卵與雌性血淋巴中進(jìn)行蛋白印跡分析檢測出vg的大亞基；甜菜夜蛾vg多克隆抗體在雌蟲血淋巴中只檢測出vg的大亞基（180 kD左右）；在一些高等膜翅目昆蟲如日本瘤姬蜂（Pimpla nipponi-0ca）中也得到類似結(jié)果。甜菜夜蛾vg中只有編碼大亞基的部分才有轉(zhuǎn)錄活性，而編碼小亞基的部分缺失。

vg具有傳統(tǒng)的蛋白前體功能，還與昆蟲免疫反應(yīng)等有關(guān)。研究表明，昆蟲vg的表達(dá)在不同發(fā)育階段具有很大差異，成蟲階段表達(dá)量最高。粘蟲VgR表達(dá)量在羽化后Sd最高，黑尾葉蟬在羽化后16 d達(dá)到VgR高峰值，草地貪夜蛾vg基因表達(dá)量在成蟲羽化4d達(dá)到峰值。本研究OnVg基因的表達(dá)情況與上述研究相符，都是在成蟲階段表達(dá)量最高，隨著羽化時(shí)間延長，呈先上升后下降的趨勢。卵巢是昆蟲重要的生殖器官，具有調(diào)控生殖發(fā)育、參與免疫應(yīng)答等功能。昆蟲不同組織中vg的表達(dá)量存在差異，番茄潛葉蛾VgR基因在雌蟲卵巢高度表達(dá)，草地貪夜蛾vg在雌蟲脂肪體高度表達(dá)，大草嶺雄蟲vg基因在腹部的表達(dá)量較高。對組織部位的研究結(jié)果表明，OnVg基因在明小花蝽雌蟲腹部高表達(dá)，其次是腸道和卵巢，進(jìn)一步說明Vg與卵黃發(fā)生密切相關(guān)。下一步應(yīng)著重研究Vg對明小花蝽發(fā)育的影響，探究其分子調(diào)控機(jī)制，如產(chǎn)卵量、羽化率、產(chǎn)卵前期、RNA干擾、糖代謝、脂代謝等。

本研究通過構(gòu)建重組質(zhì)粒并免疫小鼠，成功制備了anti-Vg血清抗體，可以特異性識(shí)別明小花蝽的vg蛋白，同時(shí)研究了OnVg基因在不同組織和發(fā)育階段的時(shí)空表達(dá)情況，所得結(jié)果為進(jìn)一步探究明小花蝽Vg的功能及生殖調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，可為明小花蝽商品化繁育提供新的途徑。

基金項(xiàng)目：濟(jì)南市農(nóng)業(yè)應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目（CX202201）；山東省科技型中小企業(yè)創(chuàng)新能力提升工程項(xiàng)目（2023TSGC0709）