蘋果6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶基因MdPGLA的克隆及功能分析

摘要：6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶（PGL）是氧化戊糖一磷酸途徑的關(guān)鍵酶，在糖代謝以及植物免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。本研究基于前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果篩選出對(duì)輪紋病有強(qiáng)烈響應(yīng)的基因MD01 G1226300，并對(duì)該基因進(jìn)行克隆鑒定與功能分析。結(jié)果表明，接種輪紋病菌6d后，‘魯麗’蘋果的病斑面積顯著小于其親本‘皇家嘎啦’和‘藤牧1號(hào)’；qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)MD01 G1226300被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，但在‘魯麗’中的表達(dá)水平顯著低于‘皇家嘎啦’和‘藤牧1號(hào)’。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，MD01 G1226300的cDNA全長762 bp，編碼253個(gè)氨基酸，MDOIG1226300蛋白相財(cái)分子量為28.04 kDa，理論等電點(diǎn)為5.85，為穩(wěn)定的親水性蛋白，屬于SugarP_isomerase超家族，存在6個(gè)可能的活性位點(diǎn)，無跨膜結(jié)構(gòu)域且整體位于膜外區(qū)，三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和B折疊形成：通過同源序列比對(duì)分析后命名為MdPCLA，與梨PbPGL4進(jìn)化關(guān)系最近，氨基酸序列同源性為70. 13%。超表達(dá)MdPGIA的轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織對(duì)輪紋病的抗性以及抗性相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照，表明MdPGIA負(fù)調(diào)控蘋果對(duì)輪紋病的抗性。本研究結(jié)果豐富了蘋果中PGL家族基因響應(yīng)生物脅迫的理論體系，為蘋果抗病分子機(jī)制解析和通過遺傳性狀改良創(chuàng)制抗病蘋果新種質(zhì)提供了參考基因。

關(guān)鍵詞：蘋果：MdPGIA；輪紋?。夯蚩寺。汗δ茯?yàn)證

中圖分類號(hào)：S661.1：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024） 08-0016-07

蘋果（Malus domestica Borkh.）是溫帶地區(qū)種植面積最大、經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的水果之一，但其產(chǎn)量和品質(zhì)常受病蟲害影響，嚴(yán)重制約蘋果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。由葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）引起的蘋果輪紋?。╝pple ring rot）又稱粗皮病，易造成果實(shí)腐爛，引起樹勢(shì)衰弱或整株死亡，是我國蘋果主產(chǎn)區(qū)最嚴(yán)重的病害之一。在生產(chǎn)上，果農(nóng)為控制病害多采取噴施農(nóng)藥等化學(xué)方法，易導(dǎo)致輪紋病菌抗藥性提高，且造成嚴(yán)重環(huán)境污染。因此，探索防治輪紋病新策略、選育抗輪紋病新品種是蘋果遺傳育種亟待解決的重要問題，對(duì)推動(dòng)我國蘋果產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展具有重要意義。

磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）是細(xì)胞中重要的初生代謝途徑，是碳源合成植保素、木質(zhì)素等次生代謝途徑的必經(jīng)中間途徑，具有重要的生理功能，可為核苷酸合成和芳香氨基酸產(chǎn)生提供還原劑NADPH、5-磷酸核酮糖以及4-磷酸赤蘚糖。PPP途徑可分為兩個(gè)階段：氧化階段和非氧化階段。氧化PPP（oxidativePPP，OPPP）將6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為5-磷酸核酮糖，后者成為非氧化PPP的底物。OPPP是細(xì)胞代謝的一個(gè)中心分支，為生物合成代謝提供NADPH和磷酸糖。在植物細(xì)胞中，OPPP分支存在于細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)體中，由6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PD）、6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶（6PGL）和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6PGD）組成。在擬南芥中，這些酶由核基因組中的小基因家族編碼，包括6個(gè)G6PD、5個(gè)6PGL和3個(gè)6PGD亞型。擬南芥PGL1、PGL2、PGIA和PGL5四個(gè)基因編碼了6-PGL的細(xì)胞質(zhì)亞型，這些基因可能在細(xì)胞質(zhì)中具有冗余作用。PGL3包含一個(gè)N端延伸和一個(gè)C端過氧化物酶體靶向基序（PTSI），同時(shí)具有質(zhì)體和過氧化物酶體靶向信號(hào)。PGL與植物的生長發(fā)育和逆境脅迫反應(yīng)密切相關(guān)。在強(qiáng)抗寒的冬小麥品種Dn1中，Ta6PGL與小麥的抗寒性相關(guān)，低溫條件下該基因的表達(dá)量上升，通過介導(dǎo)PPP途徑顯著提高植株的抗寒性，在擬南芥中，所有組織中的PGL3表達(dá)一致，發(fā)育種子中的表達(dá)略有升高，并且該基因的轉(zhuǎn)錄在整個(gè)發(fā)育過程中相對(duì)較高且穩(wěn)定。PGL3的表達(dá)水平與植物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫相關(guān)。擬南芥pgl3-1突變體表現(xiàn)為植株矮小，抗性相關(guān)基因表達(dá)水平顯著提高，抗病性增強(qiáng)。

本研究基于前期蘋果接種輪紋病菌后的表型及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，篩選出對(duì)輪紋病有強(qiáng)烈響應(yīng)的基因MDOIG1226300，該基因與擬南芥AtPGL3同源性較高。為進(jìn)一步解析基因功能，本研究從接種輪紋病菌后的蘋果果實(shí)中克隆得到MDOIG1226300，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，隨后通過蘋果愈傷組織同源轉(zhuǎn)化驗(yàn)證其在蘋果對(duì)輪紋病抗性中的功能，以期為蘋果抗病性遺傳改良提供重要的參考基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試蘋果品種為‘魯麗’、‘皇家嘎啦’和‘藤牧1號(hào)’。所有試材定植于山東省果樹研究所天平湖基地（36°13＇N，117°01＇E）。連續(xù)3年對(duì)上述試材進(jìn)行抗病性調(diào)查及鑒定，取樣前15 d不噴施農(nóng)藥，其他按常規(guī)管理進(jìn)行。遺傳轉(zhuǎn)化所需‘王林’蘋果愈傷組織于MS培養(yǎng)基中在24℃黑暗條件下培養(yǎng)。室內(nèi)人工接種所用菌株為山東省果樹研究所果樹病蟲害監(jiān)測(cè)與防控創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)自‘富士’蘋果果實(shí)中分離出的輪紋病菌葡萄座腔菌（Botryospheria dothidea）.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘋果果實(shí)病菌接種

取28℃培養(yǎng)箱中菌絲生長旺盛且一致的輪紋病菌，蘋果果實(shí)用滅菌后的牙簽扎深5 rum的小孔，塞滿菌絲，培養(yǎng)6d后取樣，樣品液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 不同品種蘋果果實(shí)中MDOIG1226300的表達(dá)分析

本研究設(shè)計(jì)qRT-MDOIG1226300-F/R引物（表1），使用BIO-RAD實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）（Roche，USA）進(jìn)行qRT-PCR，分析MDOIG1226300在接種及未接種輪紋病菌的‘魯麗“皇家嘎啦’‘藤牧1號(hào)’蘋果果實(shí)中的表達(dá)模式。以蘋果Mdactin為內(nèi)參基因。每處理6個(gè)樣品，3次重復(fù)。采用2-AAC‘法計(jì)算基因表達(dá)水平。

1.2.3 MDOIG1226300的克隆與載體構(gòu)建

用RNA Prep Pure Plant Kit試劑盒（TIANGEN，北京）提取蘋果果實(shí)的總RNA，在蘋果GDDH13_1—1數(shù)據(jù)庫下載MDOIG1226300的全長序列，設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RevertAidTMFirst-Strand cDNA synthesis Kit， Thermo， USA）合成cDNA第一鏈，并以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。用Gel Extraction Kit快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（CWBio，北京）對(duì)得到的特異性PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，并連接至T載體（TIANGEN，北京），采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5cc感受態(tài)細(xì)胞。選取PCR驗(yàn)證正確的陽性單克隆委托生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。在NCBI網(wǎng)站（www.nlm.nih.gov）上對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4 MdPGLA的生物信息學(xué)分析

通過Expasy網(wǎng)站（https：//web．expasy．org/compute_pi）在線分析MDOIG1226300蛋白理化性質(zhì)。利用NCBI網(wǎng)站分析軟件對(duì)MDOIG1226300蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。采用DNAMAN 8.0（Lynnon Biosoft，USA）、DNA Club數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)多個(gè)物種的同源蛋白進(jìn)行序列比對(duì)分析。利用MEGA 11.0軟件，選用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）對(duì)多個(gè)物種的PGIA同源氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘋果愈傷組織轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因株系表型觀察

將MdPGL4的CDS全長序列連接到超表達(dá)載體pBI121上，構(gòu)建植物基因超表達(dá)載體pBI121 -MdPGIA-FLAG，利用LBA4404農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入蘋果‘王林’愈傷組織中，使用50mg/L卡那霉素篩選陽性植株，設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行qRT-PCR鑒定，獲得超表達(dá)MdPGIA的蘋果愈傷組織。取28℃培養(yǎng)條件下菌絲生長一致的輪紋病菌，用打孔器取大小一致的菌餅接種于生長10 d的愈傷組織中央，黑暗培養(yǎng)4d后取樣，樣品液氮速凍后-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，通過qRT-PCR分析不同愈傷組織中抗性相關(guān)基因（表1）的表達(dá)模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘魯麗’對(duì)輪紋病的抗性分析及相關(guān)基因篩選

2.1.1 蘋果果實(shí)接種輪紋病菌后的表型分析

對(duì)‘魯麗’及其親本‘皇家嘎啦’‘藤牧1號(hào)’進(jìn)行輪紋病菌接種，結(jié)果（圖1A、B）表明，接種6d后，‘魯麗’的病斑面積顯著小于‘皇家嘎啦’‘藤牧1號(hào)’，病斑直徑較兩者分別減小57%和30%。說明‘魯麗’對(duì)輪紋病具有較高的抗性。

2.1.2 MDOIG1226300基因的鑒定及表達(dá)模式分析

前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)MDOIG1226300基因的表達(dá)趨勢(shì)與蘋果對(duì)輪紋病的抗性呈顯著負(fù)相關(guān)。本研究利用qRT - PCR技術(shù)檢測(cè)MDOIG1226300在接種及未接種輪紋病菌的‘魯麗’‘皇家嘎啦’‘藤牧1號(hào)’果實(shí)中的表達(dá)模式，以未接種輪紋病菌的‘藤牧1號(hào)’為參比計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果（圖1C）表明，接種輪紋病菌后MDOIG1226300在‘魯麗’‘皇家嘎啦’‘藤牧1號(hào)’中均被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，品種間差異顯著；在‘魯麗’中的表達(dá)水平顯著低于‘皇家嘎啦’和‘藤牧1號(hào)’，表達(dá)量僅分別為兩者的37%和32%。以上結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了MDOIG1226300與蘋果對(duì)輪紋病的抗性呈負(fù)相關(guān)。

2.2 MDOIG1226300的克隆與生物信息學(xué)分析

以接種輪紋病菌后的蘋果果實(shí)cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增得到750 bp左右的條帶（圖2A）；產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳回收后與pMD19-T Vector連接，轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆后搖菌測(cè)序，結(jié)果目的基因cD-NA全長762 bp，編碼253個(gè)氨基酸，與蘋果基因組GDDH13數(shù)據(jù)庫中的MDOIG1226300一致，與擬南芥AtPGL3同源性較高。

MDOIG1226300蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為28.04 kDa，理論等電點(diǎn)（pl）為5.85，包含28個(gè)Ala（11. 1%）、26個(gè)Leu （10.3%）、21個(gè)Lys （8.3%） ，21個(gè)Val（8.3%）；負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)為33個(gè)，正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)為27個(gè)；總平均親水系數(shù)（GRAVY）為-0.159，屬于親水性蛋白；脂肪系數(shù)為89.09，不穩(wěn)定系數(shù)為26.56（＜40），為穩(wěn)定蛋白。

蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)MDOIG1226300蛋白屬于SugarP-isomerase超家族蛋白，E值為2.09e-107。推測(cè)存在6個(gè)可能的活性位點(diǎn)，分別位于第45 - 50、75 - 80、155 - 160、185 - 190、210 - 215位氨基酸之間，與其在磷酸戊糖途徑中發(fā)揮的作用有關(guān)。通過TMHMM2.0預(yù)測(cè)MD01G1226300蛋白的跨膜區(qū)域，結(jié)果（圖2B）顯示，該蛋白在跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)的概率極低，在膜外區(qū)的概率接近于1，說明其無跨膜結(jié)構(gòu)域且整體位于膜外區(qū)。通過SWISS-MODEL對(duì)MD01G1226300三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，采用的模板為AOA540M7QI，序列相似度為88.93%，結(jié)果（圖2C）顯示，α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)主要參與了MDOIG1226300蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。

多序列比對(duì)結(jié)果（圖3）顯示，MD01G1226300與白梨（Pyrus bretschneideri Rehd）PbPCIA（XP_048427164.1）的同源性最高，為70.13%；與石榴（Punica granatum L.）PgPGIA（XP_031380672.1）、桃（Prunus persica）PpPGIA（XP_007218710.2）、甜橙（Citrus sinesis）CsPGIA（XP_006493166.2）的同源性分別為69.65%、66. 04%、56.35%，表明從蘋果中克隆得到的MDOIG1226300基因所編碼的蛋白與其他物種的PGIA蛋白具有較高的相似性，因此將該基因命名為MdPGL4。

為了進(jìn)一步研究MdPGIA與其他物種的親緣關(guān)系，利用MEGA 11.0軟件基于氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果（圖4）顯示，MdPGIA和Pb-PGIA聚在1個(gè)分支，親緣關(guān)系最近。

2.3 超表達(dá)MdPGIA的蘋果愈傷組織表型及抗性相關(guān)基因表達(dá)分析

為深入研究MdPGL4的功能，本研究通過LBA4404農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行蘋果愈傷組織轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，并進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，獲得了超表達(dá)MdPGL4的蘋果愈傷組織株系。隨后對(duì)超表達(dá)MdPGIA的愈傷組織1#和2#株系進(jìn)行輪紋病菌接種試驗(yàn)。如圖5A所示，接種輪紋病菌4d后，超表達(dá)MdPCL4的轉(zhuǎn)基因愈傷組織的病斑面積顯著大于對(duì)照，1#和2#株系病斑的平均直徑分別約為對(duì)照的2.1倍和1.9倍。表明MdPGIA的過量表達(dá)使轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織對(duì)輪紋病菌的抗性降低。

對(duì)超表達(dá)MdPGLA轉(zhuǎn)基因愈傷組織中水楊酸（salicylic acid，SA）和氧化還原相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果（圖5B）顯示，接種輪紋病菌4d后，SA相關(guān)基因MdNPR1、MdPAL以及氧化還原相關(guān)基因MdPOD、MdSOD在1#株系的表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照：除MdNPR1外，在2#株系中的表達(dá)水平也顯著降低。

綜合以上研究結(jié)果推測(cè)，MdPGL4可能通過影響SA及氧化還原反應(yīng)調(diào)控蘋果對(duì)輪紋病的抗性。

3 討論與結(jié)論

PPP是植物中心代謝途徑，與植物的生長發(fā)育密切相關(guān)。該途徑的不可逆氧化部分是NADPH的主要來源，以防止氧化應(yīng)激：可逆非氧化部分是合成核苷酸、芳香氨基酸、苯基丙烷及其衍生物的碳骨架的來源。PPP包含一系列由7種不同酶催化的反應(yīng)：G6PD、6PGL、6PGD、5-磷酸核糖異構(gòu)酶（RPI）、5-磷酸核酮糖異構(gòu)酶（RPE）、轉(zhuǎn)酮醇酶（TK）和轉(zhuǎn)醛縮酶（TA）。PGL是OPPP的主要酶類，可將6-磷酸葡萄糖-8-內(nèi)酯加速水解為6-磷酸葡萄糖酸，為生物合成反應(yīng)提供重要的還原劑等物質(zhì)，AtPGL3是唯一編碼具有N端轉(zhuǎn)運(yùn)肽和保守PTSI的PGL基因，為擬南芥生長發(fā)育所必需。本研究在接種輪紋病菌的蘋果果實(shí)中克隆得到擬南芥At-PGL3的同源基因MdPGIA，序列比對(duì)結(jié)果顯示MdPGIA與白梨PbPGIA氨基酸序列的同源性達(dá)70. 13%，屬于SugarP_isomerase超家族蛋白，存在6個(gè)可能的活性位點(diǎn)。

前人研究表明PGL在植物生長發(fā)育過程中表達(dá)量相對(duì)較高且穩(wěn)定，并且在響應(yīng)生物和非生物脅迫中具有重要作用。植物幼苗受低溫馴化時(shí)，PPP效率提高，從而增強(qiáng)抗凍性。擬南芥PGL3可提高OPPP效率，防止6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯的積累，以保證細(xì)胞內(nèi)源化合物的完整性。AtPGL3通過改變植物葉片組織中的氧化還原狀態(tài)影響光合細(xì)胞的氧化還原平衡，從而激活防御反應(yīng)。小麥PGL對(duì)分蘗節(jié)抗寒有著重要作用，-25℃條件下，PGL的表達(dá)水平顯著提高，導(dǎo)致PPP中Ru5P和NADPH等中間產(chǎn)物的積累，從而為植物的生物合成提供原料和專一性供體。此外，PPP的代謝終產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖的累積也能增強(qiáng)細(xì)胞滲透壓，從而降低寒冷對(duì)細(xì)胞的傷害，擬南芥pgl3-1突變體表現(xiàn)為植株矮小，G6PD活性增強(qiáng)，細(xì)胞氧化還原電位降低，對(duì)丁香假單胞菌的抗性顯著提高。

目前，對(duì)于PGL基因的研究主要集中于模式植物，在蘋果中尚未有鑒定其功能的報(bào)道。本研究qRT-PCR分析結(jié)果表明，接種輪紋病菌后，不同品種的蘋果果實(shí)中MdPGL4的表達(dá)量顯著升高。對(duì)輪紋病敏感性越高的蘋果品種，MdPGIA的表達(dá)水平越高，推測(cè)MdPGIA與蘋果對(duì)輪紋病的抗性呈負(fù)相關(guān)。前期的研究表明，植物激素水楊酸水平和氧化還原反應(yīng)與蘋果對(duì)輪紋病的抗性密切相關(guān)。與野生型相比，超表達(dá)MdPGL4的轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織對(duì)輪紋病的抗性以及水楊酸和氧化還原抗性相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著降低，表明MdPCLA負(fù)調(diào)控蘋果對(duì)輪紋病的抗性。

本研究通過對(duì)MdPGIA的克隆及其響應(yīng)輪紋病的表達(dá)分析，豐富了蘋果屬植物PGL家族基因響應(yīng)生物脅迫的理論體系，也為蘋果抗病分子機(jī)制解析和通過遺傳性狀改良創(chuàng)制抗病蘋果新種質(zhì)提供參考基因。

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（ZR2020QC147）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-27）；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 （農(nóng)業(yè)良種工程）項(xiàng)目（2023LZGCQY009）；山東省果樹研究所科研創(chuàng)新基金青年工程項(xiàng)目（2023GSKY02）；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（重大科技創(chuàng)新工程）項(xiàng)目（2022LZGC010）