花生PLT基因家族全基因組鑒定與表達分析

摘要：PLT家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物胚胎、干細胞、分生組織及器官生長發(fā)育等過程都起著重要作用。本研究利用生物信息學技術(shù)在栽培種花生基因組中鑒定到12個PLT家族基因，分布在11條染色體上：AhPLT蛋白大多含有2個保守的AP2結(jié)構(gòu)域，編碼439 - 713個氨基酸，預測定位在細胞核或葉綠體中；AhPLT基因結(jié)構(gòu)復雜，具有多樣的短外顯子結(jié)構(gòu)，外顯子數(shù)在5-8個之間，不同家族成員中分布不同的保守基序：AhPLT家族成員啟動子區(qū)存在生長素、赤霉素和茉莉酸等激素相關(guān)的順式作用元件。qRT-PCR結(jié)果顯示，AhPLT1 -B和AhPLT5-B分別在根中和種子中的表達量最高：兩基因?qū)に豂AA、6-BA和GA3有不同的響應(yīng)，其中AhPLT1 -B受6-BA調(diào)控上調(diào)表達最顯著，AhPLT5-B受6-BA、IAA和GA，調(diào)控呈先升高后降低的表達模式。本研究為花生PLT基因的生物學功能研究提供了參考。

關(guān)鍵詞：花生：PLT轉(zhuǎn)錄因子：基因家族：生物信息學分析：表達分析

中圖分類號：S565.2：Q781 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024） 08-0001-09

PLETHORA（PLT）屬于APETALA 2/ETHYL-ENE RESPONSE FACTOR（AP2/ERF）型轉(zhuǎn)錄因子，PLT家族成員在植物的新生分生組織中表達水平較高，參與新生分生組織的形成和維持以及器官的啟動和發(fā)育過程。PLT基因的結(jié)構(gòu)包括兩個保守的AP2重復結(jié)構(gòu)域，兩者之間存在較大的結(jié)構(gòu)差異。

PLT在根發(fā)育過程中扮演重要角色，在促進根尖分生組織（root meristem，RM）的形態(tài)建成和活性維持，特別是靜止中心（quiescent center，QC）的定位中至關(guān)重要。QC在根尖分生組織中充當干細胞維持所需的組織中心。PLT1和PLT2被認為是維持根尖干細胞和QC細胞的胚胎規(guī)格所必需的兩個功能冗余基因，QC的形成要求PLTI-PLT2和SHR-SCR共同參與。PLT對于促進植物芽再生過程也具有重要作用。研究表明，PLT3、PLT5和PLT7通過復雜的機制調(diào)控擬南芥（Arabidopsis thaliana L．）芽再生的過程。具體而言，在芽從頭再生途徑中，側(cè)器官邊界相關(guān)基因CUC2發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而PLT則通過調(diào)節(jié)CUC2的表達水平來促進芽的再生。另外，PLT還需要與CUC基因相互作用，以參與芽的再生調(diào)控過程。豆科植物的根瘤中寄居著固氮根瘤菌，這些根瘤形成在根部表示可能存在著與根相關(guān)的因素。研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿（Medicago truncatula L.）中4個MtPLT基因在根結(jié)節(jié)發(fā)育和維持中起著冗余的功能作用，與擬南芥根部發(fā)育中的PLT基因相似。在干細胞的研究中，LT1和PLT2的啟動子活性以及蛋白結(jié)合物呈梯度狀分布，并在干細胞區(qū)域達到最大值。PLT活性很大程度上是累加性和劑量依賴性的，干細胞狀態(tài)受PLT活性水平的調(diào)控，高水平的活性有助于保持干細胞的原始狀態(tài)，較低水平的活性則促進干細胞有絲分裂，更低水平的PLT活性則會促進干細胞向分化狀態(tài)轉(zhuǎn)變。在根干細胞區(qū)域和不定芽生成過程中，可以觀察到PLT基因的特異表達。利用農(nóng)桿菌侵染的方法，在金魚草（Antirrhinum majus L.）中侵染帶有PLT5基因的農(nóng)桿菌可誘導不定芽的形成。用同樣的方法，在番茄（Solanum lyco-persicum L．）和兩個甘藍品種（Brassica rapa，var' Bok choy' and' Pei Tsai'）中侵染，都能獲得穩(wěn)定遺傳的不定芽，表明應(yīng)用PLT5可提高植物的轉(zhuǎn)化效率，并且這種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可促進基因組編輯或其他植物生物技術(shù)在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用。

花生（Arachis hypogaea L．）作為一種重要的油料和經(jīng)濟作物，在我國具有廣泛的適應(yīng)性和顯著的經(jīng)濟效益等優(yōu)點，總產(chǎn)量在油料作物中名列前茅。PLT基因家族在植物根、葉、花、根瘤等器官的生長發(fā)育，以及輔助遺傳轉(zhuǎn)化中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。國內(nèi)對PLT基因家族的研究相對較少，而且在花生領(lǐng)域幾乎沒有相關(guān)報道，因此對花生PLT基因家族進行研究具有重要的意義?；ㄉz傳轉(zhuǎn)化目前仍較困難，研究PLT基因家族將有助于開發(fā)新的花生轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。本研究通過信息生物學手段對栽培種花生PLT基因家族成員進行全基因組鑒定和表達分析，為花生PLT基因家族功能研究以及花生再生體系建立奠定基礎(chǔ)。 1 材料與方法

1.1 花生PLT基因家族成員鑒定和染色體定位分析

借助Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam. xfam. org/）提供的PLETHORA（PF00847）結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型文件，利用TBtools軟件對花生數(shù)據(jù)庫進行搜索，接著運用CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih．gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）進行保守結(jié)構(gòu)域鑒定和篩選。通過ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）在線網(wǎng)站分析花生PLT成員的氨基酸數(shù)量、蛋白質(zhì)分子量、等電點、親水性以及亞細胞定位特征，利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ib-cp.fr/cgi-bin/npsa_automat. pl？ page= npsa_sopma.html）在線網(wǎng)站對AhPLTs蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行詳細分析與結(jié)構(gòu)預測。將PLT基因家族成員的基因名稱及其在染色體上的位置上傳至在線網(wǎng)站MG2C（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2. 11），對花生PLT基因在染色體上的定位進行分析。

1.2 花生PLT基因家族系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守基序分析

為了研究PLT基因家族的進化關(guān)系，從Phy-tozome數(shù)據(jù)庫（https：//phytozome-next. jgi. doe.gov/）中下載花生、擬南芥、水稻（Oryza sativa L-）和苜蓿等物種的PLT基因序列和編碼蛋白氨基酸序列，利用TBtools軟件繪制系統(tǒng)進化樹，將輸出的nwk. file文件上傳至在線網(wǎng)站（https：//itol.embl.de/）對進化樹進行美化。通過MEME在線網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/meme/doc/meme.html）對PLT蛋白序列進行保守基序motif分析，將保守基序數(shù)目設(shè)置為10;之后將花生PLT基因家族的gff3文件、保守基序分析結(jié)果（meme.XML）文件和進化樹分析結(jié)果（nwk.file）文件上傳至TBtools軟件對基因結(jié)構(gòu)進行可視化分析。使用NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST進行同源蛋白序列比對，選取跨物種同源蛋白序列，并將其導人ClustalX進行多序列比對。利用在線工具（https：//www.ebi.ac. uk/Tools/hmmer/）分析花生PLT蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，將數(shù)據(jù)上傳至TBtools軟件進行可視化分析。

1.3 花生PLT基因家族順式作用元件預測

通過分析AhPLTs起始密碼子上游2 000 bp序列，并參考Chao和Wang等的研究方法，預測順式作用元件。

1.4 花生PLT基因家族在不同組織部位的表達分析

為進一步了解PLT基因在花生不同組織中的表達情況，在Peanut Base（https：//peanutbase.org/）數(shù)據(jù)庫中下載參考基因組（arahyTifrunner.GnmI.Ann1. CCJH）的表達譜數(shù)據(jù)，從中篩選出PLT基因家族成員在19個花生組織中的表達數(shù)據(jù)，包括葉片、莖尖、根、根瘤、花被、雄蕊、雌蕊、莢果、果針、果殼和種子等。使用聯(lián)川生物云平臺站（https：//www.omicstudio.cn/tool/4）對花生PLT基因家族各個組織表達量歸一化（數(shù)值進行Log2處理），隨后構(gòu)建基因表達熱圖。

1.5 花生PLT基因家族不同激素處理下表達模式分析

供試花生品種為農(nóng)大花108，對成熟種子及萌發(fā)生長3周左右花生植株的根、莖、莖尖和葉片取樣：對萌發(fā)生長3周左右的幼苗分別噴施50μmol/L IAA、25 μmol/L 6-BA和100 μmol/L GA3進行激素處理，并在0（處理前）、1、3、6、12、24 h取植株葉片。每個試驗3次生物學重復，每個重復取3株的樣品混合。將所取材料裝入無RNA酶離心管中，液氮速凍后-80℃保存。

通過qRT-PCR檢測PLT基因在不同激素處理下的表達情況，引物信息見表1。根據(jù)TransS-cript@Green One - Step qRT - PCR SuperMix（TRANS）說明書進行qRT- PCR。反應(yīng)體系（20μL）：Mix 10 μL，ddH20 8.2 μL，cDNA模版1 μL，上、下游引物各0.4 μL。反應(yīng)程序：95℃5 min，95℃10 s，60℃30 s，40個循環(huán)。內(nèi)參基因使用actin，利用2-△△Ct方法計算AhPLT基因的相對表達水平，然后運用Graphpad Prism軟件進行數(shù)據(jù)可視化呈現(xiàn)，分析花生PLT基因在組織器官和不同激素處理下的表達情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生PLT基因家族成員鑒定和染色體定位

本研究從花生全基因組中共鑒定到12個PLT基因家族成員，分別命名為AhPLTl -A、Ah-PLT1-B、AhPLT2 -A、AhPLT2 -B、AhPLT3 -A、Ah-PLT3-B、AhPLT4 -A、AhPLT4 -B、AhPLT5 -A、Ah-PLT5-B、AhPLT7 -A、AhPLT7 -B。編碼439 - 713個氨基酸，分子量在47.10 - 77.95kDa之間，等電點為5.74-8.46（表2）。AhPLT蛋白的亞細胞定位預測結(jié)果（表2）顯示，除AhPLT3-A和AhPLT3-B兩個蛋白定位于葉綠體外，其他蛋白均定位在細胞核中?；ㄉ鶳LT蛋白平均親水系數(shù)均為負值，說明這些蛋白均為親水性蛋白。

染色體定位結(jié)果（圖1）顯示，AhPLT成員的染色體分布并不均勻，12個AhPLT基因分布在花生的11條染色體上，但大部分染色體上只分布有1個基因，只有8號染色體上分布有2個基因。

2.2 花生PLT基因家族系統(tǒng)進化樹構(gòu)建、基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守基序分析

將12個花生PLT蛋白與擬南芥、水稻、二倍體花生中的PLT蛋白進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果（圖2）表明，12個花生PLT蛋白在進化關(guān)系上分為4個分支。其中，AhPLTI-A、AhPLTl-B與At-PLTI/AIL3（AT3G20840.1）和AtPLT2/AIIA（ATIG51190.1）聚類到同一分支，AhPLT3 -A、Ah-PLT3-B與AtPLT3/AIL6（AT5G10510.1）和At-PLT7（AT5G65510.1）聚類到同一分支，AhPLT4 -A、AhPLT4 -B與AtPLT4（AT5G17430.1）聚類到同一分支，AhPLT5 -A、AhPLT5 -B與AtPLT5（AT5 G57390.1）聚類到同一分支，表明它們之間存在密切的親緣關(guān)系。

基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果（圖3A）表明，PLT的結(jié)構(gòu)復雜且具有多樣的短外顯子結(jié)構(gòu)，外顯子數(shù)介于5-8個之間。其中，AhPLT3 -A、AhPLT3-B、AhPLT7-A和AhPLT7-B外顯子數(shù)目最多，各有8個，AhPLT2 -A和AhPLT4-B的外顯子數(shù)目最少，各有5個。

通過MEME在AhPLT家族中檢索到10個保守motif（圖3B），其中Motif 1、Motif 2、Motif 6和Motif 7在12個成員中均存在：只有AhPLT2-B缺失Motif 5；AhPLT2-A和AhPLT2-B缺失Motif 3和Motif 4；除AhPLT5 -A、AhPLT5 -B、AhPLT7-A和AhPLT7-B外，其他成員均有Motif 10。值得注意的是Motif 7位于AhPLT5-A和AhPLT5 -B的C端，而在家族其他成員中均位于N端，這是兩者區(qū)別于家族中其他成員的結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，在AhPLT進化過程中家族成員的蛋白序列相對保守。

花生PLT家族成員的蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果（圖3C）顯示，AhPLT蛋白含有AP2和AP2superfamily等結(jié)構(gòu)域，其中所有成員均含有AP2結(jié)構(gòu)域，只有AhPLT3-A、AhPLT3-B、AhPLT5 -B、AhPLT7 -A含有AP2 superfamily。多序列比對結(jié)果顯示，該家族蛋白的結(jié)構(gòu)特點主要表現(xiàn)為包含兩個具有高度保守性的AP2結(jié)構(gòu)域，分別命名為R1和R2，其中，AhPLT2 -A、AhPLT2 -B和Ah-PLT4-B蛋白的R2結(jié)構(gòu)域缺失。

2.3 花生PLT基因家族順式作用元件

通過對AhPLT基因家族成員起始密碼子上游2 000 bp序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其中不僅含有光響應(yīng)和逆境響應(yīng)等元件，還擁有植物激素應(yīng)答相關(guān)的元件。PLT基因在調(diào)節(jié)植物器官的生長發(fā)育過程中，通過響應(yīng)各種植物激素發(fā)揮作用。選取生長素（TGA - element，AACGAC）、水楊酸（TCA-element，CCATCTTTTT）、茉莉酸（TGACG - motif，TGACG）、脫落酸（ABRE，ACGTG）、種子特異性（RY-element，CATGCATG）、光響應(yīng)（MRE，AAC-CTAA）和赤霉素（P-box，CCTTTTG）7類順式作用元件進行分析，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，AhPLT基因家族成員啟動子區(qū)域包含的ABA響應(yīng)元件最多，僅在AhPLT4-B和AhPLT7-A上未預測到：赤霉素元件在大多數(shù)成員中也都可以預測到，而生長素相關(guān)元件僅存在于AhPLT1 -A、AhPLT3 -A和Ah-PLT3 -B上。種子特異性元件只有AhPLT1和Ah-PLT5啟動子包含，表明這兩個基因可能參與花生種子發(fā)育的調(diào)控過程。

2.4 花生PLT基因家族組織特異性表達分析

為了探究PLT家族基因在花生不同組織部位的表達差異，在花生數(shù)據(jù)庫Peanutbase中下載花生參考基因組表達譜數(shù)據(jù)，從中篩選出PLT基因家族成員在19個花生組織中的表達譜數(shù)據(jù)。繪制熱圖后結(jié)果（圖5）顯示，12個AhPLT基因的表達模式表現(xiàn)出明顯的組織特異性。AhPLT1、AhPLT2和AhPLT4在根和種子發(fā)育的早期有較高的表達水平，推測它們可能與花生根和種子的發(fā)育相關(guān)。AhPLT5同樣可能參與花生種子的發(fā)育過程，但其可能主要在種子發(fā)育的后期發(fā)揮作用。AhPLT3 -B在雄蕊中的表達量最高，推測其可能參與花生雄蕊或花粉發(fā)育的調(diào)控過程。Ah-PLT7在主莖莖尖和側(cè)枝莖尖的表達量較高，表明其可能參與花生頂端分生組織活性的調(diào)控過程。

2.5 花生PLT1和PLT5基因在不同激素處理下表達模式分析

基于PLT1和PLT5基因的重要功能，本研究利用qRT-PCR檢測了AhPLTl -B和AhPLT5-B在花生不同組織部位和和3種激素處理下的表達模式。結(jié)果表明，AhPLTl -B在莖、莖尖、葉和種子中表達量較低，在根中表達量最高；AhPLT5 -B在種子中的表達量最高（圖6A）。在IAA處理下，花生葉片中AhPLT1 -B的表達量隨處理時間的延長呈現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢，AhPLT5 -B表達量在處理1 h達到最大值，之后逐漸下降（圖6B）；經(jīng)過6-BA處理后，AhPLTl -B和AhPLT5-B都有不同程度的上調(diào)，從3h開始AhPLT1 -B的表達量升高，24 h達到最高，AhPLT5-B表達量6h達到最大值，之后有所下降（圖6C）；在GA，處理下，Ah-PLTl -B和AhPLT5-B的表達模式類似，表達量都在6h達到最大值，隨處理時間延長，表達量開始出現(xiàn)下降趨勢（圖6D）。AhPL T1 -B和AhPLT5 -B對IAA、6-BA和GA，都有不同程度的響應(yīng)，其中對6-BA的響應(yīng)最明顯，表明6-BA在兩基因發(fā)揮功能時起著重要作用。

3 討論與結(jié)論

AP2/ERF作為一類獨特的轉(zhuǎn)錄因子，在植物中發(fā)揮著重要作用。PLT基因家族作為其中的重要成員，在調(diào)控植物胚胎發(fā)育、維護分生組織以及促進器官生長等過程中扮演關(guān)鍵角色。在本研究中，通過對栽培種花生全基因組進行深入鑒定，成功篩選出12個PLT基因，同時，結(jié)合幾種模式植物如擬南芥、水稻等的進化分析，對其進行了命名，揭示PLT基因在植物界的分子進化過程。擬南芥中PLT5參與調(diào)控不定芽的生長發(fā)育，在番茄中過表達PLT5也可以促進創(chuàng)傷處長出新的愈傷和不定芽。進化分析結(jié)果表明，花生AhPLT5-A、AhPLT5 -B與AtPLT5具有較近的親緣關(guān)系，因此推測AhPLT5 -A和AhPLT5-B為AtPLT5的直系同源基因，且也具有促進愈傷組織和不定芽再生的功能。

PLT基因家族含有2個保守的AP2結(jié)構(gòu)域，基因結(jié)構(gòu)比較復雜，外顯子數(shù)量較多。對花生PLT基因結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，其外顯子數(shù)量為5-8個，與擬南芥、水稻等模式植物基本一致，說明不同物種中PLT基因家族在進化過程中相對保守。保守結(jié)構(gòu)域分析和AP2結(jié)構(gòu)域多序列比對分析也表現(xiàn)出相似的結(jié)果。

PLT基因家族成員參與植物花、芽、結(jié)節(jié)以及根等組織和器官的發(fā)育過程。本研究使用19個花生組織的表達數(shù)據(jù)對12個AhPLT基因表達模式進行分析，發(fā)現(xiàn)大部分基因表達量比較低，個別基因在根、莖尖和種子中的表達量相對較高，推測PLT家族成員在這些花生器官的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。PLT1和PLT5在愈傷組織和不定芽的生長過程中起著重要的作用，利用PLT5進行遺傳轉(zhuǎn)化還能夠提高轉(zhuǎn)化效率。AhPLT1和AhPLT5的啟動子上包含響應(yīng)生長素和細胞分裂素等激素的調(diào)控元件，說明它們可能通過響應(yīng)這些激素信號誘導參與調(diào)控植物的生長發(fā)育過程。已有的研究表明，PLT5在芽原基起始和活性維持中起重要作用，而PLT1作為核心模塊調(diào)控根尖的發(fā)育。組織特異性表達分析的結(jié)果表明，這兩個基因可能還參與了花生種子的發(fā)育調(diào)控過程進而影響花生的產(chǎn)量。對花生進行不同激素處理后，兩個PLT基因?qū)に豂AA、6-BA和GA。都有不同程度的響應(yīng)，其中AhPLT1 -B受6-BA調(diào)控上調(diào)表達最顯著，AhPLT5 -B受6-BA、IAA和GA，調(diào)控呈先升高后降低的表達模式。同時，研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用PLT1和PLT5可以提高愈傷組織和不定芽的再生效率，具有提高花生遺傳轉(zhuǎn)化效率的應(yīng)用潛力。

綜上所述，本研究在栽培種花生中鑒定到了12個AhPLT基因，并對PLT家族成員進行了詳細的特征分析與進化分類，結(jié)合AhPLT基因表達數(shù)據(jù)，對基因在不同激素處理下表達模式進行了分析，篩選出AhPLT1和AhPLT5兩個與花生再生相關(guān)的候選基因，并發(fā)現(xiàn)細胞分裂素6-BA可能參與了對它們功能的調(diào)控。以上結(jié)果表明，AhPLT基因可能在花生的生長發(fā)育和再生過程中具有重要作用，但其調(diào)控機制仍需進一步探討。

基金項目：河南省重大科技專項（221100110300）；河南省重點研發(fā)專項（221111110500）；河南省產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項（HARS-22-05- G1）