納米酶增強免疫層析法定量檢測血液中的降鈣素原

摘要 建立了一種以金、鉑納米粒子修飾的金屬有機框架材料（MAP）為標記物的降鈣素原（Procalcitonin，PCT）快速定量免疫層析檢測方法。本方法以靜電吸附法制備的MAP-抗PCT 單克隆抗體偶聯(lián)物為檢測探針，將抗PCT 多克隆抗體和羊抗鼠IgG 分別噴涂硝酸纖維素（NC）膜構建試紙條的檢測線和質控線，采用基于信號放大的夾心免疫法定量檢測PCT。結果表明， MAP 免疫層析試紙條具有靈敏度高、特異性強和穩(wěn)定性好等優(yōu)點，利用其檢測PCT 的動態(tài)檢測范圍為0.61 pg/mL～320 ng/mL，檢出限為0.25 pg/mL，日內和日間精密度（RSD）均小于15%。實際樣品檢測結果表明，本方法僅需微量樣本即可檢測全血中PCT 的濃度，對于炎癥反應的早期診斷、監(jiān)測治療及預后判斷具有重要意義。

關鍵詞 側流免疫層析法；降鈣素原；快速檢測；納米酶

生物標志物的高靈敏和快速檢測對于疾病診斷具有重要意義。目前，生物標志物的臨床檢測方法主要為儀器分析法，具有檢測靈敏度高、可自動化以及適合高通量檢測等優(yōu)勢[1]。但是，儀器分析法通常需要大型儀器設備，價格昂貴、檢測時間長，難以滿足欠發(fā)達地區(qū)對生物標志物快速檢測的需求，也無法用于家庭自檢[2]。免疫層析試紙條法（Lateral flow immunoassay， LFIA）具有操作簡單、檢測結果直觀、耗時少以及成本低等優(yōu)點[3]，適于大規(guī)模快速篩查，是目前發(fā)展最快的一種即時診斷方法。

金納米顆粒（Au nanoparticles， AuNPs）基于局域表面等離子體共振效應可產生鮮艷的顏色，因而被廣泛用作LFIA 方法的信號探針。然而，傳統(tǒng)的30～40 nm AuNPs 探針因摩爾消光系數(shù)較低、顏色信號偏弱，用于試紙條檢測時靈敏度有限，無法滿足痕量待測物以及微量樣本的檢測需求?；贏uNPs 有序組裝的信號放大策略可有效提高試紙條的檢測靈敏度。該策略通常利用鏈霉親和素-生物素[4]、互補核酸鏈[5]或抗原與抗體間[6]的特異性結合使更多的AuNPs 在檢測線（T 線）區(qū)域二次富集，從而實現(xiàn)檢測信號放大。然而，該策略雖然可將試紙條檢測靈敏度提升1～2 個數(shù)量級，但因二次富集效率存在差異，易導致檢測結果變異系數(shù)變大。將大量AuNPs 負載至大粒徑載體（細菌[7]、碳納米管[8]和一維硅納米棒[9]等）上以增強探針顏色信號的強度，也是提高試紙條檢測靈敏度的有效策略。但是，當所用載體粒徑過大時，其遷移速率變慢，這將帶來探針在T 線上非特異性駐留的風險，從而使假陽性結果的可能性增加。此外，使用熒光微球、染料聚苯乙烯微球[10]以及磁性熒光微球[11]等探針也可提高試紙條的檢測靈敏度，但通常只能提高一個數(shù)量級左右。

酶催化信號放大是一種被廣泛應用于提高各類分析方法靈敏度的有效策略[12]。Zhang 等[13]以辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase， HRP）和抗體共標記AuNPs 作為LFIA 探針，利用HRP 的高催化活性催化底物顯色，從而提高了試紙條的檢測靈敏度。但是， HRP 等天然酶的催化活性高度依賴于蛋白質的構象，易受溫度、pH 值和離子強度等環(huán)境因素的影響[14]，從而限制了基于天然酶的信號探針在檢測中的應用。納米酶是一類具有類天然酶活性的納米材料[15]，與天然酶相比具有化學性質穩(wěn)定、環(huán)境耐受性強、成本低以及長期穩(wěn)定性好等優(yōu)勢[16]。相比于大部分金屬基納米酶，鉑納米粒子（Platinumnanoparticles， PtNPs）具有更優(yōu)越且穩(wěn)定的類過氧化物酶（POD）催化活性，通過調控PtNPs 的尺寸、形貌、晶面和組成成分等可進一步增強其催化活性[17]。就尺寸因素而言，小粒徑的PtNPs 具有更大的比表面積，因此更容易暴露催化活性位點，從而具有更高的催化活性。但是，小粒徑PtNPs 在使用過程中因表面能過高而易發(fā)生團聚，導致催化活性下降[18]。將小粒徑PtNPs 固定在多孔納米材料的表面或孔隙中，理論上可以改善其分散性，獲得穩(wěn)定的高催化活性。金屬有機框架材料（Metal-organic frameworks，MOFs）是一類以金屬離子或金屬團簇為節(jié)點，與有機配體自組裝形成的多孔材料[19]，具有高比表面積、可調節(jié)的孔徑、可調控的化學成分和嚴格定義的金屬節(jié)點，因而可作為限域負載或原位生長納米材料的優(yōu)良載體[20-21]。

降鈣素原（Procalcitonin， PCT）是血清降鈣素的前體肽[22]，被認為是診斷和檢測細菌感染的理想生物標志物[23]。準確測定血液中的PCT 濃度對于輔助診斷細菌性感染具有重要意義[24]。在健康人血液中，PCT 濃度一般低于0.1 ng/mL[25-26]；當血液中PCT 的濃度大于0.5 ng/mL 時，患者發(fā)生嚴重敗血癥或敗血性休克的風險大大增加[27-28]。受限于檢測靈敏度，采用常規(guī)膠體金試紙條檢測PCT 時，通常需要靜脈穿刺采血獲得足夠量的樣本[29]，而對于難以進行靜脈穿刺的人群，例如嬰幼兒及老年患者，樣本收集存在一定困難。本研究以鋯基金屬有機框架納米材料（Zr-MOF）[30]為載體，通過在MOF 上原位生長AuNPs 獲得具有強比色信號的MOF@AuNPs 納米復合物（MA）；在MA 上繼續(xù)生長PtNPs，獲得了具有高類POD活性的MOF@AuNP@PtNPs 復合物（MAPs）?？疾炝艘訫APs 為探針的LFIA（MAP-LFIA）對PCT 的檢測性能。由于MAPs 不僅具有較強的比色信號，還具有非常高的類POD 活性，因此通過酶催化信號放大可以實現(xiàn)PCT 的靈敏檢測。本研究開發(fā)的MAP-LFIA 可快速、超靈敏定量檢測稀釋后血樣中的痕量PCT，對嬰幼兒及老年患者僅需從足底或指部獲取微量血樣（2 μL）即可滿足檢測需求。