灰氈毛忍冬花器官發(fā)育相關(guān)LmSOC1基因克隆及表達分析

摘 要：【目的】克隆灰氈毛忍冬MADS-box家族基因SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1），對其進行生物信息學和表達模式分析，為探究灰氈毛忍冬花冠不開放機制奠定理論基礎。【方法】基于花蕾型灰氈毛忍冬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選到開花調(diào)控基因LmSOC1的Unigene序列并克隆全長cDNA序列，通過生物信息學分析和實時熒光定量PCR技術(shù)分析編碼蛋白特性和不同品種中LmSOC1基因的表達特異性，最后將LmSOC1基因插入到原核表達質(zhì)粒載體pTOPO-D1中，并在表達宿主BL21（DE3）中進行蛋白表達?！窘Y(jié)果】LmSOC1基因包含645 bp的ORF區(qū)，LmSOC1蛋白不含信號肽、無跨膜區(qū)，為穩(wěn)定的親水性蛋白。系統(tǒng)進化樹分析表明，LmSOC1蛋白與黃花蒿、榴蓮、可可等的SOC1蛋白親緣關(guān)系更近。實時熒光定量PCR分析表明，在2個花蕾型灰氈毛忍冬品種的花蕾和葉片中均檢測到LmSOC1基因的表達，而葉片中表達量明顯高于花蕾。同時，在早期花蕾中LmSOC1基因的表達量高于晚期花蕾，在‘金翠蕾’品種中這一表達差異極顯著（P<0.01）。最后成功在大腸桿菌BL21（DE3）中表達出重組蛋白?！窘Y(jié)論】通過對LmSOC1基因的克隆和表達分析發(fā)現(xiàn)，該基因可能在灰氈毛忍冬花器官發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，為進一步研究該基因在植物花發(fā)育中的生物學功能奠定了基礎。

關(guān)鍵詞：灰氈毛忍冬；MADS-box；LmSOC1；基因克?。槐磉_分析；原核表達

中圖分類號：S718.43 文獻標志碼：A 文章編號：1673-923X（2024）05-0181-10

基金項目：湖南省自然科學基金面上項目（2022JJ30326）；木本油料資源國家重點實驗室建設項目（2022PT1004）。

Cloning and expression analysis of LmSOC1 gene related to floral organ development in Lonicera macranthoides

LONG Lijun1，2， MA Yingzi2， ZENG Huijie1， LI Changzhu1， ZHANG Gang3， LIU Sisi1， LI Yimin3

（1. Institute of Economic Forest， Hunan Academy of Forestry， Changsha 410004， Hunan， China； 2. School of Life Science and Technology， Central South University of Forestry Technology，Changsha 410004， Hunan， China； 3.a. Key Laboratory for Research and Development of “Qin Medicine” of Shaanxi Administration of Chinese Medicine， Xi’an 712046， Shaanxi， China； b. State Key Laboratory of Research and Development of Characteristic Qin Medicine Resources （Cultivation）， Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712083， Shaanxi， China）

Abstract：【Objective】SUPPRESOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1 （SOC1） gene from MADS-box family of Lonicera macranthoides was cloned and its bioinformatics and expression patterns were analyzed to lay a theoretical foundation for exploring the mechanism of corolla non-opening in L. macranthoides.【Method】In order to explore the functions of SOC1 genes in the flowering of L. macranthoides， this study screened and cloned the cDNA sequences of LmSOC1 genes from the transcriptome data of bud-type L. macranthoides. Bioinformatics analysis was used to analyze the characteristics of the encoded proteins， and quantitative reversetranscription polymerase chain reaction to detect the specific expression of LmSOC1 in different varieties. And then the LmSOC1 gene extracted from L. macranthoides was successfully integrated into the prokaryotic expression plasmid pTOPO-D1. Subsequently，this recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli strain BL21 （DE3） to facilitate the expression of the target protein.【Result】The LmSOC1 gene harbored a 645 bp open reading frame （ORF）， yielding an encoded protein characterized by stability and hydrophilicity， devoid of both transmembrane regions and signal peptides. Phylogenetic tree analysis proved that LmSOC1 protein had close genetic relationship with the LmSOC1 proteins from Artemisia annua， Durio zibethinus， and Theobroma cacao. The real-time fluorescence quantitative PCR analysis revealed the presence of LmSOC1 gene expression in both the buds and leaves of two bud type varieties of Lonicera japonica. Interestingly， the expression level was notably higher in the leaves compared to the buds. Furthermore， within the buds， the expression of the LmSOC1 gene was found to be higher in early flower buds compared to late flower buds. This discrepancy in expression was particularly significant in the ‘Jincuilei’ variety， with a p-value of less than 0.01， indicating an extremely significant difference. Finally， the recombinant protein was successfully expressed in E. coli BL21（DE3）.【Conclusion】Through cloning and expression analysis of the LmSOC1 gene， it was found that this gene may play an important role in the development of organs in L. macranthoides， and it laid a foundation for further research on the biological function of this gene.

Keywords： Lonicera macranthoides； MADS-box； LmSOC1； gene cloning； expression analysis； prokaryotic expression

灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides為忍冬科Caprifoliaceae忍冬屬Lonicera多年生常綠纏繞木質(zhì)藤本植物，常生于山谷溪邊、山坡或山頂混交林、灌木叢中，多分布于我國南部地區(qū)[1]?；覛置潭鳛樯姐y花的主要基原植物之一，其干燥的花蕾及初開的花為常用入藥部位[2]。其性寒、味甘，具有抗菌消炎、涼血解毒、疏風散熱等功效，是一種集藥用、保健、觀賞和生態(tài)作用于一體的經(jīng)濟植物，廣泛應用于制藥、食品、化妝品等領域，具有巨大的開發(fā)潛力[3]?；覛置潭吧昕剐圆睢⒗倨诙?、易凋謝、產(chǎn)量和有效成分含量低[4]，若能延長蕾期將帶來巨大的經(jīng)濟效益。而其突變株花蕾型灰氈毛忍冬因蕾期長、花蕾整齊不開放[5-6]，同時解決了采摘困難等問題，為灰氈毛忍冬植物提供了新的優(yōu)良種質(zhì)資源。為更好地指導實際生產(chǎn)和迎合未來分子育種的發(fā)展趨勢，對花蕾型灰氈毛忍冬蕾期長、花冠不展開等現(xiàn)象背后的分子機制進行研究將顯得十分必要。

MADS-box基因家族是植物中一類生物功能豐富的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與調(diào)控植物生長發(fā)育的各個時期，尤其在調(diào)控植物花期、花器官形態(tài)發(fā)育等方面，MADS-box基因皆發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[7-8]。SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1（SOC1）基因是調(diào)控植物開花的重要整合因子，隸屬于MADS-box家族的SOC1/TM3亞家族，受光周期、春化作用、赤霉素調(diào)控和自主途徑等多個途徑的控制[9-10]，具有影響植物的開花時間、花器官形態(tài)建成以及調(diào)控花分生組織成熟的重要功能[11-12]。目前SOC1同源基因已從多種植物中成功克隆，如牡丹Paeonia suffruticosa[13]、中國水仙Narcissus tazetta[14]、梅花Prunus mume[15]等，但至今未見灰氈毛忍冬LmSOC1基因的有關(guān)報道，其在灰氈毛忍冬開花過程中的作用也尚不清楚。

鑒于SOC1基因在植物開花過程中的關(guān)鍵作用，本研究從灰氈毛忍冬轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫中篩選出灰氈毛忍冬LmSOC1基因的Unigene序列，通過同源克隆技術(shù)獲得LmSOC1基因的cDNA全長序列，并對得到的序列進行生物信息學分析，初步探究了該基因在結(jié)構(gòu)上的特性。接著通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了LmSOC1基因在灰氈毛忍冬‘龍花’和‘金翠蕾’兩個品種的葉片、花蕾早期和花蕾晚期中的表達水平和時空特異性表達情況，構(gòu)建LmSOC1基因的原核表達載體并將其導入大腸桿菌BL21（DE3）表達宿主中進行表達，為深入研究灰氈毛忍冬LmSOC1基因的生物學功能提供分子基礎，同時也為解析灰氈毛忍冬蕾期長、花冠不展開的分子機制提供了重要參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料選擇灰氈毛忍冬花蕾品種‘龍花’和‘金翠蕾’的早期花蕾、晚期花蕾和葉片，取自湖南省林業(yè)科學院試驗林場?！埢ā汀鸫淅佟鬟x取4株長勢良好且無病蟲害的灰氈毛忍冬植株，采集其幼嫩葉片、早期花蕾和晚期花蕾樣本，材料采集后用自封袋包裝好并編號后立即液氮速凍，轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱以備后續(xù)提取RNA使用。

1.2 總RNA的提取與cDNA的合成

取適量灰氈毛忍冬葉片和花蕾于研缽中，加液氮對樣品進行充分研磨，使用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）提取樣本的總RNA。RNA完整性利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，RNA濃度和質(zhì)量使用酶標儀進行檢測。使用PrimeScriptTM RT Master Mix對符合質(zhì)量檢測標準的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，合成Complementary DNA（cDNA），得到的cDNA置于-20 ℃冰箱保存。

1.3 LmSOC1基因的全長序列克隆

根據(jù)本課題組前期測得的灰氈毛忍冬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（PRJNA 667821），利用Primer Premier 6.0軟件設計LmSOC1基因的Coding Sequence（CDS）引物SOC1-F、SOC1-R，5′端特異性引物SOC1-5′-F、SOC1-5′-R和3′端特異性引物SOC1-3′-F、SOC1-3′-R（表1）。以稀釋20倍的cDNA為模板進行PCR擴增[16]，反應體系（25 L）包括：12.5 μL 2×Phanta Max緩沖液，0.5 μL dNTP Mix， 1 μL正向引物，1 μL反向引物，0.5 μL高保真DNA聚合酶，1.5 μL cDNA和8.0 μL雙蒸水。PCR反應程序為95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)35次；72 ℃ 5 min；4 ℃持續(xù)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，在紫外切膠儀下對符合條件的目的條帶進行切膠，然后將膠回收產(chǎn)物連接至pTOPO載體上并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，并在LB固體培養(yǎng)基平板（含100 μg·mL-1氨芐青霉素）上進行過夜培養(yǎng)。將PCR鑒定為陽性的菌落送至長沙擎科生物公司進行測序。

使用DNAstar軟件對克隆獲得的CDS序列以及5′和3′端序列進行拼接，最終得到灰氈毛忍冬LmSOC1基因的cDNA全長序列。接著使用引物SOC1-5′-F和SOC1-3′-R進行PCR擴增、回收、轉(zhuǎn)化和測序，驗證cDNA全長。將灰氈毛忍冬LmSOC1 cDNA序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得GenBank登錄號為OQ 507620。

1.4 LmSOC1蛋白基因生物信息學分析

利用NCBI網(wǎng)站在線查找灰氈毛忍冬LmSOC1基因的全長開放閱讀框（ORF），并推導編碼的氨基酸序列。參照馮發(fā)玉等[17]、胡俊東等[18]的方法，分析LmSOC1基因編碼氨基酸的基本理化性質(zhì)、親水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點、信號肽以及二三級結(jié)構(gòu)；預測其亞細胞定位情況，并通過NCBI網(wǎng)站CD-Search分析其保守結(jié)構(gòu)域；利用NCBI的blast P搜索相似蛋白，下載同源性較高的蛋白序列，運用DNAMAN軟件對灰氈毛忍冬LmSOC1與其他物種SOC1蛋白分別進行序列對比分析；借助MEGA-X中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap重復1 000次。

1.5 LmSOC1基因的表達模式分析

分別提取花蕾型灰氈毛忍冬‘龍花’和‘金翠蕾’葉片、早期花蕾和晚期花蕾的總RNA，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測灰氈毛忍冬‘龍花’和‘金翠蕾’葉片、早期花蕾以及晚期花蕾中LmSOC1基因的相對表達水平。使用Primer Premier 6.0設計LmSOC1基因的qRT-PCR特異性引物F：5′-AGCAGCATCGCTTATCAGGCAAG-3′和R：5′-AAGGAGGCACGACCGCTATCAA-3′。每個qRTPCR反應體系包括2 μL cDNA（100 ng·μL-1），10 μL SYBR qPCR Master Mix，0.4 μL的上游和下游特異性引物，8.2 μL ddH2O。實時熒光定量PCR擴增程序為：95 ℃預變性3 min；40個循環(huán)（95 ℃變性10 s，60 ℃復性30 s）。熔解曲線的擴增程序為：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s。以灰氈毛忍冬18 S rRNA基因作為內(nèi)部參考基因，每個樣品重復4次，LmSOC1的表達量用2-ΔΔCt法計算[19]。

1.6 LmSOC1蛋白基因原核表達載體構(gòu)建及誘導表達

參照pTOPO-D1 Directional Expression Kit操作說明將灰氈毛忍冬LmSOC1基因構(gòu)建到原核表達載體pTOPO-D1上，按說明書引物設計原則設計擴增引物SOC1-yF和SOC1-yR（表1）。根據(jù)特異性引物對cDNA進行PCR擴增，然后使用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，并在紫外切膠儀下對觀察到的目的條帶進行切膠回收純化。隨后將回收產(chǎn)物插入到pTOPO-D1載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，涂布在LB固體培養(yǎng)基（含100 μg·mL-1氨芐青霉素）進行過夜培養(yǎng)，篩選出白色單菌落，將PCR鑒定為陽性的單菌落送測序并提取質(zhì)粒。接著將重組質(zhì)粒pTOPO-D1-LmSOC1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中進行表達，白色單菌落經(jīng)過PCR驗證后，在LB液體培養(yǎng)基（含有100 μg·mL-1氨芐青霉素）中加入不同終濃度的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷進行誘導表達。誘導結(jié)束后取全部菌液進行離心（5 000 r·min-1，10 min），在菌體中加入pH值為7.5的1×PBS緩沖液（2.5 mL），混勻后再加入PMSF（60 μL，10 mg·mL-1）溶液。將離心管置于冰水混合物中進行超聲破碎，直到溶液變清亮。接著對破碎菌液進行離心，分離上清液與沉淀，分別加入SDS-PAGE Loading Buffer混勻，置于沸水浴煮沸10 min，目的蛋白使用12.0% SDS-PAGE電泳檢測[20-21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取

灰氈毛忍冬‘龍花’葉片和花蕾的總RNA提取結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，28 S和18 S rRNA條帶明亮清晰，沒有出現(xiàn)拖尾，且28 S rRNA與18 S rRNA條帶亮度約為2∶1，說明提取的總 RNA較為完整；OD260/OD280值為2.0～2.2，說明RNA純度較高，可用于開展后續(xù)試驗。

2.2 LmSOC1基因全長cDNA克隆

通過RT-PCR擴增得到長度為660 bp的LmSOC1基因CDS片段（包含部分5′UTR和3′UTR片段），1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。通過DNASTAR 7.1中的MegAlign程序比對分析，克隆所得的序列與轉(zhuǎn)錄組測序所得序列一致。利用表1中5′/3′端引物分別進行5′擴增和3′擴增，得到長度為853 bp的LmSOC1基因5′UTR片段（包含部分CDS序列片段）與314 bp的LmSOC1基因3′UTR片段（包含部分CDS序列片段），1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。將已測定的CDS片段、5′和3′端擴增產(chǎn)物進行拼接，得到基因全長序列，并進行驗證。設計全長引物，進行PCR擴增、回收、轉(zhuǎn)化及測序，測序結(jié)果與拼接結(jié)果一致（圖2），表明成功擴增得到序列全長為1 401 bp的LmSOC1 cDNA特異性片段。

2.3 LmSOC1基因序列分析

根據(jù)NCBI與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其與GenBank中已注冊的多種植物SOC1基因有較高的相似性，因此將該基因命名為LmSOC1。LmSOC1基因cDNA全長為1 401 bp，CDS序列大小為645 bp，編碼214個氨基酸，其中5′UTR為560 bp，3′UTR為196 bp，全長序列及編碼氨基酸見圖3。

2.4 LmSOC1蛋白基本理化性質(zhì)分析

利用Expasy網(wǎng)站分析LmSOC1基因的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)LmSOC1蛋白的分子式為C1082H1780 N322O335S9，相對分子質(zhì)量為24 948.53，理論等電點PI為9.02，脂肪系數(shù)為89.30，不穩(wěn)定系數(shù)為56.76，數(shù)值均大于40，推測屬于不穩(wěn)定蛋白。正電荷殘基總數(shù)為36，負電荷殘基總數(shù)為30，親水性平均系數(shù)為-0.715，利用ProtScale進行再次預測，結(jié)果顯示該蛋白的親水性區(qū)域所占比例大于疏水性區(qū)域，這與ProtParam的預測結(jié)果一致，表明該蛋白屬于親水性蛋白。在WOLF PSORT的在線預測中，發(fā)現(xiàn)LmSOC1蛋白的生物活性主要存在于細胞核。TMHMM的預測結(jié)果顯示，LmSOC1編碼的氨基酸序列（1～214）沒有跨膜結(jié)構(gòu)。SignalP 4.1的分析結(jié)果顯示，LmSOC1蛋白不屬于分泌蛋白。通過Netphos 3.1服務器的分析，發(fā)現(xiàn)LmSOC1編碼的氨基酸序列可能存在19個磷酸化位點，其中絲氨酸（Ser）磷酸化位點、蘇氨酸（Thr）磷酸化位點、酪氨酸（Tyr）磷酸化位點分別為15、2、2個。

2.5 LmSOC1蛋白保守結(jié)構(gòu)域和二、三級結(jié)構(gòu)預測

NCBI的 Conserved domains在線工具分析顯示，LmSOC1基因編碼蛋白含有高度保守的MADS結(jié)構(gòu)域（3～78）和中度保守的K-box結(jié)構(gòu)域（88～170），具備已報道植物SOC1的典型結(jié)構(gòu)特征（圖4）。

SOPMA分析表明，LmSOC1蛋白的二級結(jié)構(gòu)（圖5a）主要由124個α螺旋（57.94%）、18個延伸鏈（8.41%）、6個β轉(zhuǎn)角（2.80%）和66個無規(guī)則卷曲（30.84%）組成，α螺旋占比最高，其次是無規(guī)則卷曲，β轉(zhuǎn)角占比最低。

利用SWISS-MODEL在線軟件以7nb0.1.A為模板構(gòu)建LmSOC1的三維結(jié)構(gòu)模型（圖5b），序列相似性為74.07%，全球性模型質(zhì)量評分為0.74。

2.6 LmSOC1氨基酸序列同源性比對和系統(tǒng)進化樹分析

使用DNAMAN軟件對灰氈毛忍冬LmSOC1基因編碼蛋白序列與其他物種的同源蛋白序列進行同源性比對，結(jié)果表明，LmSOC1蛋白同可可Theobroma cacao（XP_017973057.1）、芝麻Sesamum indicum（XP_011101156.1）、黃花蒿Artemisia annua（PWA95442.1）、酸棗Ziziphus jujube var. spinosa（XP_048322084.1）、大豆Glycine max（NP_001236377.1）SOC1蛋白具有較高的同源性，同源性分別為63.03%、64.45%、62.62%、61.32%、61.06%（圖6），且均具有MADS結(jié)構(gòu)域和K-box結(jié)構(gòu)域。

為了進一步研究灰氈毛忍冬LmSOC1蛋白與其他物種的SOC1蛋白之間的親緣關(guān)系，運用MEGA-X軟件，采用NJ法將灰氈毛忍冬LmSOC1氨基酸序列與其他16個物種的同源氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析，利用Bootstrap進行檢測，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖7）。結(jié)果顯示，系統(tǒng)進化樹可聚為3大分支，而灰氈毛忍冬LmSOC1蛋白則在第三大分支上，其與黃花蒿、榴蓮Durio zibethinus、可可等親緣關(guān)系較為接近，尤其與黃花蒿的親緣關(guān)系最近，與大桉Eucalyptus grandis關(guān)系最遠。

2.7 LmSOC1基因的時空特異性表達

以灰氈毛忍冬18 S rRNA為內(nèi)參基因，采用qRT-PCR的方法檢測LmSOC1在灰氈毛忍冬‘龍花’和‘金翠蕾’品種不同花蕾期及葉中的表達情況，結(jié)果如圖8所示。結(jié)果顯示，LmSOC1基因在‘龍花’和‘金翠蕾’品種各花蕾期及葉中均有表達，但變化規(guī)律不同。從整體上來看，‘金翠蕾’品種中LmSOC1基因表達量整體高于‘龍花’品種。在花蕾發(fā)育不同時期，LmSOC1表達量在‘金翠蕾’品種花蕾早期最高，在花蕾晚期表達較低，且存在極顯著差異（P<0.01）；在灰氈毛忍冬‘龍花’品種的不同花蕾期，LmSOC1基因的表達量并沒有顯示出明顯的差異。然而，在不同的組織中，LmSOC1基因的表達呈現(xiàn)了顯著的變化趨勢：在‘金翠蕾’和‘龍花’的各個花蕾期中，該基因的最高表達量均出現(xiàn)在花蕾的早期階段，且葉片的表達量高于花蕾的早期階段。

2.8 LmSOC1蛋白原核表達分析

將構(gòu)建好的pTOPO-D1-LmSOC1重組質(zhì)粒和pTOPO-D1空載體分別轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）表達菌株，擴大培養(yǎng)鑒定為陽性的單菌落，菌液經(jīng)不同濃度的IPTG 18 ℃誘導過夜后，收集菌體進行SDS-PAGE電泳驗證。結(jié)果（圖9）顯示，與空載體以及未經(jīng)IPTG誘導的pTOPO-D1-LmSOC1重組質(zhì)粒表達情況相比，在0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1 IPTG誘導條件下，pTOPO-D1-LmSOC1均出現(xiàn)一條約30 kDa的特異性蛋白條帶，與預測的帶6個組氨酸標記的目的蛋白大小一致，說明成功表達出LmSOC1重組蛋白。但表達的蛋白主要富集在沉淀中，可溶性蛋白較少，表明表達的蛋白以包涵體形式存在，為包涵體蛋白。

3 結(jié)論與討論

3.1 討 論

MADS-box家族基因在植物生長發(fā)育的各個階段起著重要作用，涉及花器官的形成、開花時間的調(diào)控以及根、莖、葉等組織的發(fā)育[22-23]。SOC1是開花時間調(diào)控途徑中的一個核心因子，在單子葉植物和雙子葉植物中廣泛存在[24]。SOC1基因通過整合光周期、春化、赤霉素和自主途徑等多種開花相關(guān)信號，調(diào)節(jié)植物的開花時間和花器官的形態(tài)發(fā)育[25]。因此，研究灰氈毛忍冬MADS-box家族中的SOC1基因，對于揭示其優(yōu)良變異現(xiàn)象背后的分子機制具有重要意義。

本研究通過克隆成功獲得了LmSOC1基因的完整cDNA序列，序列分析結(jié)果表明，LmSOC1基因包含一個645 bp的CDS編碼區(qū)，可編碼214個氨基酸的蛋白。LmSOC1蛋白含有MADS-box家族的保守結(jié)構(gòu)域，顯示其為MADS-box家族基因。此外，LmSOC1蛋白不含有跨膜區(qū)和信號肽，表明其為一種親水性不穩(wěn)定蛋白。亞細胞定位結(jié)果表明，該蛋白主要定位于細胞核內(nèi)，這揭示了其在細胞核中的功能調(diào)控和合成修飾。進化樹結(jié)果顯示，LmSOC1蛋白與黃花蒿、榴蓮、可可等親緣關(guān)系更為接近。研究發(fā)現(xiàn)，SOC1同源基因在植物不同組織中均有表達，但在不同物種中高表達的部位不同。木茼蒿Argyranthemum frutescens中AfSOC1在葉片和花芽中高表達[26]。TkSOC1在橡膠樹Taraxacum koksaghyz葉、根、花各組織中均有表達，其中在根中的表達量最高，在花中表達豐度最低[27]。紅掌Anthurium andraeanum中AaSOC1在果實、葉片、莖和花梗中高表達[28]。本研究表明，在灰氈毛忍冬品種‘龍花’和‘金翠蕾’中，LmSOC1基因在葉片和花蕾中均有表達，尤其是在葉片中，其相對表達量最高，這表明LmSOC1基因可能不僅僅參與調(diào)控花器官的發(fā)育，還可能在葉片的發(fā)育過程中發(fā)揮作用，從而豐富了對該基因在同一植物中的分布情況的認識。在花蕾發(fā)育的不同階段中，研究發(fā)現(xiàn)在‘龍花’和‘金翠蕾’品種的花蕾晚期，LmSOC1基因的相對表達量均降低。這種下降可能是由于樣品衰敗、細胞活性降低或者是由于SOC1 mRNA在植物組織內(nèi)不穩(wěn)定而分解所致。這些結(jié)果表明LmSOC1的表達受到花蕾發(fā)育階段和組織類型的影響，對于理解LmSOC1在植物生長發(fā)育中的調(diào)控機制具有重要意義。

本研究基于LmSOC1基因的全長序列，并將其克隆到了pTOPO-D1表達載體中，在大腸桿菌BL21（DE3）中成功進行了表達。結(jié)果表明，該基因能夠有效地表達出目的蛋白。蛋白表達的效果受多種因素影響，包括基因本身的特性、誘導溫度和表達載體標簽等。在這個試驗條件下，表達的LmSOC1蛋白主要富集在沉淀物中，這表明LmSOC1蛋白為包涵體蛋白。這可能是由于大腸桿菌的高效表達，導致蛋白合成速度太快，以致于沒有足夠時間進行折疊，亦或者是重組蛋白中含硫氨基酸較多。研究還測試了不同濃度的IPTG對蛋白表達量的影響，結(jié)果顯示1.0 mmol·L-1 的IPTG誘導可以產(chǎn)生最明顯的蛋白條帶，表明在一定的誘導條件下，蛋白表達量會隨著誘導物濃度的增加而增加。

本研究僅僅獲得了LmSOC1基因的cDNA片段，通過生物信息學分析和原核表達對該基因進行初步驗證，并未進行功能驗證，下一步準備對LmSOC1與其他MADS-box開花基因之間的互作關(guān)系進行研究，并將其遺傳轉(zhuǎn)化到擬南芥中驗證其具體功能，對深入了解LmSOC1在調(diào)控花發(fā)育過程中的具體功能和作用機制具有重要意義。

3.2 結(jié) 論

本研究成功地從灰氈毛忍冬中克隆了LmSOC1基因的cDNA全長，利用生物信息學和組織表達分析等方法對其特性進行了研究，并在大腸桿菌表達系統(tǒng)中成功誘導出目的蛋白。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，LmSOC1蛋白在功能上可能與菊科植物黃花蒿SOC1蛋白更為接近。LmSOC1基因在營養(yǎng)器官葉中表達量較高，而在生殖器官花蕾中表達量較低；隨著花蕾的發(fā)育，LmSOC1基因表達水平整體上也呈下降趨勢，因此推測LmSOC1基因在誘導灰氈毛忍冬由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。這項研究結(jié)果為進一步深入了解LmSOC1基因在灰氈毛忍冬開花過程中的功能提供了重要的理論基礎。

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[本文編校：謝榮秀]