摘 要:【目的】揭示黑老虎5個群體70份種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)狀況,為種質(zhì)資源評價、保護及利用提供理論依據(jù)?!痉椒ā坑煤Y選出的17對引物進行所有樣本SSR-PCR擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳后采用GenAlex v6.502、Ntsys V2.2及Structure 2.3.4等軟件進行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析?!窘Y(jié)果】17對引物的70份樣本中共檢測到147個等位基因,平均每對引物擴增出8.647個等位基因。17個位點的Shannon信息指數(shù)(I)平均值為1.421,期望雜合度(He)平均值為0.648,多態(tài)信息指數(shù)(PIC)平均值為0.612。5個群體中馬關(guān)群體(MGH)的遺傳多樣性最高,I和He分別為1.070和0.544。群體遺傳分化系數(shù)(Fst)平均值為0.323,有32.3%的變異來源于群體間。分子方差分析(AMOVA)顯示群體間方差分量比為28.8%,群體間的遺傳變異占總變異量的28.8%。17個位點群體內(nèi)近交系數(shù)(Fis)的平均值為0.161(Fis>0),黑老虎存在較強的近親交配,5個群體中只有廣西群體(GXH)Fis<0?;蛄鳎∟m)為0.876,屬中等水平。UPGMA聚類和STRUCTURE分析將70份黑老虎種質(zhì)資源劃分成了3個類群:類群Ⅰ由來自MGH的樣本資源組成,類群Ⅱ主要由屏邊群體(PBH)的樣本資源組成,類群Ⅲ主要由GXH、貴州群體(GZH)及湖南群體(HNH)的樣本資源組成?!窘Y(jié)論】黑老虎種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性,群體間存在極高的遺傳分化,遺傳變異主要來源于群體內(nèi)的個體。大部分種質(zhì)的遺傳背景比較單一,同一群體的不同種質(zhì)遺傳組分基本相同。在黑老虎育種及資源保護和開發(fā)工作中,應(yīng)在盡量涵蓋全部群體類別的基礎(chǔ)上,特別重視遺傳多樣性豐富的群體以及各群體內(nèi)不同類型個體的選擇、保存和利用。
關(guān)鍵詞:黑老虎;種質(zhì)資源;SSR標記;遺傳多樣性;遺傳結(jié)構(gòu)
中圖分類號:S718.46 文獻標志碼:A 文章編號:1673-923X(2024)05-0156-11
基金項目:云南省重大科技專項計劃項目(202302AE090002)。
Genetic diversity and genetic structure of Kadsura coccinea germplasm resources revealed by SSR markers
LI Siguang1, CHEN Shaoyu1, FU Yupin1, YIN Aiping1, SIMA Yongkang1, QI Rongpin1, ZHOU Yun1, WANG Shaochang2
(1.a. Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants; b. Yunnan Laboratory for Conservation of Rare, Endangered Endemic Forest Plants, Public Key Laboratory of the State Forestry and Grassland Administration, Yunnan Academy of Forestry and Grassland, Kunming 650201, Yunnan, China; 2. Forestry and Grassland Bureau of Miao Autonomous County, Pingbian 661299, Yunnan, China)
Abstract:【Objective】The aims of the study are to reveal genetic diversity and genetic structure of Kadsura coccinea germplasm resources and to provide theoretical basis for their evaluation, conservation, development and utilization.【Method】17 SSR primers were employed in SSR-PCR of 70 samples and software of GenAlex v 6.502, Ntsys V 2.2, Structure 2.3.4 were used to analyze genetic diversity of the germplasm resources.【Result】A total of 147 alleles were detected with a mean value of 8.647 per locus. The average Shannon information index (I) of 17 loci was 1.421. The average of expected heterozygosity (He) was 0.648 and the average of polymorphic information content (PIC) was 0.612. MGH population showed the highest genetic diversity level among 5 populations, of which I and He were 1.070 and 0.544 respectively. The average genetic differentiation coefficient (Fst) was 0.323, indicating 32.3% of variation existed among populations. AMOVA analysis showed that the ratio of variance component among populations was 28.8% and gene flow among populations was at moderate level with Nm value of 0.876. The average of inbreeding coefficient (Fis) was 0.161(Fis>0), which meant a stronger inbreeding in K. coccinea. Among 5 populations, only Fis of GXH was above zero. Seventy individuals were divided into 3 groups through UPGMA and STRUCTURE analysis. GroupⅠincluded individuals from MGH, group Ⅱ composed individuals from PBH and group Ⅲ composed individuals from GXH, GZH and HNH.【Conclusion】The K. coccinea germplasm resources show high genetic diversity and high genetic differentiation and low gene exchange. The genetic variation derives mainly from individuals within populations. The genetic composition for most germplasm resources is relatively simple. Therefore, in the work of resource selection and conservation, on the base of covering all populations, attention should be paid to the preservation of different types of individuals besides selection of populations with rich genetic diversity.
Keywords: Kadsura coccinea; germplasm resources; SSR markers; genetic diversity; genetic structure
黑老虎Kadsura coccinea又稱冷飯團、過山龍?zhí)伲逦蹲涌芐chisandraceae南五味子屬Kadsura的常綠木質(zhì)藤本,生長于海拔200~2 000 m半開闊的灌叢和樹林中,多攀附于高大喬木或灌叢的樹冠上面,國內(nèi)主要分布于四川、浙江、廣東、廣西、貴州、海南、湖南、江西和云南等地[1-2]。黑老虎全株皆有利用價值,根、莖含生物堿、酚類、萜類或甾醇、揮發(fā)油等活性物質(zhì)[3-4],有消腫、解毒、緩解中樞抑制、安神等功效,對治療慢性肝炎、抗氧化、抗HIV病毒、抗衰老等也有作用[5];其莖、葉四季常綠,聚合果色澤艷麗,果色多樣,垂吊如燈籠,用于綠廊、涼亭等園林配置,具有較高的觀賞價值[6]。此外,其果味甜,富含多種人體必需的氨基酸和微量元素,而且有調(diào)節(jié)血脂的作用,是一種具有開發(fā)潛力的新奇水果[7-9]。近年來由于利益驅(qū)使,黑老虎野生資源被過度采挖,加之其生境的嚴重破壞,導致該物種面臨生存危機,開展黑老虎野生資源的調(diào)查、保存及合理保護和開發(fā)利用顯得尤為重要。
目前,有關(guān)黑老虎的資源調(diào)查[10]、系統(tǒng)分類[11-13]、形態(tài)特征[14]、化學成分分析[15-17]和藥理活性[5,18]、組織培養(yǎng)[19]等方面有研究報道,但分子標記相關(guān)的研究僅見黑老虎基因組SSR特征分析及引物開發(fā)以及ISSR-PCR反應(yīng)體系建立的報道[20-21],未見基于分子標記的黑老虎種質(zhì)資源遺傳多樣性研究,而了解種質(zhì)資源的遺傳多樣性對于種質(zhì)的保存、合理利用以及遺傳改良策略的制定都具有非常重要的參考價值和指導意義。在眾多的分子標記技術(shù)中,具有共顯性特性的簡單重復序列(SSR)標記因信息豐富、重復性好、操作簡單、成本低被廣泛應(yīng)用[22-23]。本研究在已開發(fā)的黑老虎SSR引物基礎(chǔ)上,采用SSR分子標記技術(shù)對收集的5個群體共70份黑老虎種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析,揭示其遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)狀況,為種質(zhì)資源評價、保護及育種計劃的制定奠定理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材 料
供試的70份黑老虎葉片樣品于2022年7月采自昆明樹木園黑老虎資源收集圃的70個單株。70個單株分別屬于5個群體,分別于2013—2018年從原生地采集引種,樣品數(shù)量及來源信息見表1。采集新鮮葉片,編號后置于裝有硅膠的密封袋中,帶回實驗室冷藏備用。
1.2 方 法
1.2.1 黑老虎基因組DNA提取及檢測
用植物DNA提取試劑盒(NanoMagBio)提取黑老虎基因組DNA,具體步驟參照試劑盒說明書。提取的DNA分別采用瓊脂糖凝膠(1%)電泳及NanoDrop 8000超微量分光光度計(Thermo Fisher Scientific, USA)進行濃度和質(zhì)量的檢測。將DNA樣品稀釋至20 ng/mL,于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 SSR-PCR擴增反應(yīng)及引物篩選
總體積為15 μL的SSR-PCR反應(yīng)體系中包含:7.5 μL的2×Taq PCR Master Mix,2.0 μL的Mix primer(10 pmol/mL),1.0 μL的DNA Template(20 ng/mL),4.5 μL的ddH2O。PCR擴增程序為:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,52~62 ℃梯度退火30 s,72℃延伸30 s,運行10個循環(huán); 95 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,運行25個循環(huán);72 ℃延伸20 min,最后4 ℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后,擴增產(chǎn)物經(jīng)熒光毛細管電泳檢測。
基于上述反應(yīng)體系及反應(yīng)程序,每個群體中隨機抽取3個樣品,從已經(jīng)發(fā)表的28對引物[21]中篩選出穩(wěn)定性強、多態(tài)性高的引物,經(jīng)擴增結(jié)果的檢測篩選出17對引物(表2)用于所有樣品擴增。
1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及遺傳多樣性分析
用篩選出的17對引物完成70份黑老虎DNA樣本擴增并進行毛細管電泳檢測,獲得毛細管電泳峰圖。根據(jù)峰圖讀取各DNA樣本擴增產(chǎn)物序列大小,使用Excel軟件進行基因型數(shù)據(jù)統(tǒng)計及整理,根據(jù)分析軟件要求對數(shù)據(jù)格式進行相應(yīng)的轉(zhuǎn)換。通過GenAlex v6.502軟件計算各位點的等位基因數(shù)(Na)、預期雜合度(He)、香農(nóng)指數(shù)(I)、多態(tài)信息指數(shù)(PIC)、樣本或群體間的Nei’s遺傳距離(D)、群體內(nèi)的近交系數(shù)(Fis)等基礎(chǔ)遺傳參數(shù),同時進行分子方差分析(AMOVA)及主成分分析(PCoA)[24];基于遺傳一致度,用Ntsys V2.2軟件進行聚類分析[25],用MEGA 6.0軟件構(gòu)建進化樹[26]。
用STRUCTURE 2.3.4軟件對70份黑老虎資源進行遺傳結(jié)構(gòu)分析[27],設(shè)置K=3~10,Burn-in周期10 000,MCMC(MarkovChain Monte Carlo)為100 000,每個K值運行20次,用在線STRUCTURE HARVESTER軟件計算最佳ΔK值(即最佳遺傳類群)。根據(jù)最佳ΔK值,用CLUMMP和DISTRUCT軟件繪制遺傳結(jié)構(gòu)圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 擴增結(jié)果及位點的多態(tài)性
17對引物對黑老虎種質(zhì)資源的SSR擴增獲得穩(wěn)定、多態(tài)性高的擴增結(jié)果,圖1為部分擴增結(jié)果的毛細管電泳圖譜。各引物的擴增結(jié)果見表2和表3。由表2可知,17對引物SSR擴增的條帶大小為111~274 bp,在70份樣本中共檢測到147個等位基因,平均每對引物擴增到8.647個等位基因。17對引物檢測到的等位基因數(shù)量為3~19個,其中KCZ127擴增出的等位基因最多(18個),引物KCZ057和KCZ081擴增出的等位基因最少(各3個)。
表3還顯示了17個位點的遺傳多樣性參數(shù)。其中有效等位基因數(shù)(Ne)的平均值為3.773,Shannon信息指數(shù)(I)的平均值為1.421,觀測雜合度(Ho)的平均值為0.426,期望雜合度(He)的平均值為0.648。17個位點的多態(tài)信息指數(shù)(PIC)為0.273~0.884,平均值為0.612,平均值高于0.500。其中2個位點(KCZ127和KCZ147)的PIC分別高達0.884和0.858,而且所有位點的PIC都大于0.250,PIC值大于0.500的位點有13個,占76.5%,說明研究采用的17對引物皆顯示了較高的多態(tài)性,可以有效地揭示黑老虎種質(zhì)資源的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)。
2.2 黑老虎5個群體的遺傳多樣性分析
2.2.1 群體的遺傳多樣性水平
基于SSR標記的黑老虎5個群體的遺傳多樣性參數(shù)見表4。由表4可知,5個群體的Ne為1.909~2.891,平均為2.406;I為0.607~1.070,平均為0.855;Ho為0.379~0.493,平均為0.422;He為0.354~0.544,平均為0.451。數(shù)據(jù)表明,5個群體的遺傳多樣性存在差異,基于He和I衡量群體遺傳多樣性水平,馬關(guān)群體的遺傳多樣性最高,I和He分別為1.070,0.544;廣西群體的遺傳多樣性最低,I和He分別為0.607和0.354。群體Ho與He的相對大小可以反映群體內(nèi)個體間的交配特性及雜合子狀況,當Ho
2.2.2 群體的遺傳分化狀況
F統(tǒng)計量可反映群體間的遺傳分化狀況,其中群體內(nèi)近交系數(shù)(Fis)是衡量群體內(nèi)偏離哈迪-溫伯格平衡的程度,當Fis>0時,群體內(nèi)存在近親交配,雜合子不足,反之則異型交配,雜合子過量。本研究中,表3顯示17個位點Fis的平均值為0.161(Fis>0),表4顯示5個群體Fis的平均值為0.107(Fis>0),數(shù)據(jù)表明所研究的黑老虎種質(zhì)資源存在較強的近親交配,雜合子不足,5個群體中只有廣西群體的Fis<0,以異型交配為主。群體分化系數(shù)(Fst)是衡量群體遺傳分化程度的參數(shù),本研究Fst平均值為0.323(表3),說明有32.3%的變異來源于群體間。分子方差分析(AMOVA)得到了類似的結(jié)果,有28.8%的變異來源于群體間(表5)。黑老虎種質(zhì)資源的遺傳變異主要來源于群體內(nèi)。
2.3 黑老虎群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析
2.3.1 遺傳結(jié)構(gòu)
用STRUCTURE 2.3.4軟件分析了70份黑老虎種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu),結(jié)果(圖2)表明,當K=3時,ΔK值最大。根據(jù)似然值最大原則,可以將70份黑老虎種質(zhì)資源按遺傳組分劃分為3個類群(圖3),其中橙色部分為第1類群,主要由來自廣西群體、貴州群體和湖南群體的種質(zhì)資源構(gòu)成;藍色部分為第2類群,基本由馬關(guān)群體的種質(zhì)資源構(gòu)成;黃色部分為第3類群,其主要樣本來自屏邊群體。由圖3可知,大部分種質(zhì)的遺傳背景比較單一,僅極少數(shù)種質(zhì)有混合遺傳組分來源,遺傳背景較復雜。另外,同一群體的不同種質(zhì)遺傳組分基本相同。
2.3.2 UPGMA聚類及PCoA分析
采用基于Nei’s遺傳距離的非加權(quán)組平均法(UPGMA)對黑老虎70份種質(zhì)資源進行聚類分析,結(jié)果見圖4。由圖4可知,在遺傳距離為0.40時,70份黑老虎種質(zhì)資源被劃分為3大類群。類群Ⅰ全部為馬關(guān)群體的種質(zhì)資源,類群Ⅱ由屏邊群體種質(zhì)資源及2份馬關(guān)群體種質(zhì)資源組成,類群Ⅲ則除了2份屏邊群體種質(zhì)資源外,其他皆為來自廣西、貴州及湖南群體的種質(zhì)資源??梢?,來自同一群體的種質(zhì)資源基本聚在了同一個類群中。從群體的聚類情況看,類群Ⅲ和類群Ⅱ首先聚為一支,即廣西、貴州、湖南群體與屏邊群體首先聚在一起,再與馬關(guān)群體聚類,馬關(guān)群體與其他4個群體有較大的遺傳距離。
主坐標分析(PCoA)以可視化坐標的形式更能直觀地反映群體、個體間的空間距離關(guān)系(相似性或差異性)。用GenAlex軟件對70份黑老虎種質(zhì)資源進行PCoA分析,結(jié)果見圖5。由圖5可知,70份種質(zhì)分布在相互獨立的3個區(qū)域,左部區(qū)域為MGH種質(zhì)資源,右上區(qū)域為PBH種質(zhì)資源,圖下部為其他3個群體(GZH、GXH和HNH)的種質(zhì)資源。5個群體中GZH、GXH、HNH樣本相互交織,遺傳相似性較高,其他兩個群體僅極少數(shù)樣本有相互交叉,同一群體的樣本基本集中在一個區(qū)域,這與種質(zhì)資源的UPGMA聚類結(jié)果一致。
3 結(jié)論與討論
3.1 討 論
遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分,是物種生存適應(yīng)和發(fā)展進化的前提,了解物種的遺傳多樣性可以為其保護與利用提供科學依據(jù),對種質(zhì)資源的遺傳改良及種質(zhì)創(chuàng)新亦有非常重要的意義。本研究采用17對引物對70份黑老虎種質(zhì)資源進行了基于SSR-PCR的遺傳多樣性分析,揭示了種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平及遺傳結(jié)構(gòu)狀況。
篩選出的17對SSR引物具有較高的多態(tài)性,能很好地用來揭示黑老虎種質(zhì)資源的遺傳多樣性。PIC常用來評估引物的鑒別能力及其提供信息的可靠性[28],當PIC>0.50時,引物的多態(tài)性高,提供的信息豐富,能很好地反映遺傳多樣性;當0.25
17對引物擴增結(jié)果的遺傳分析表明,黑老虎種質(zhì)資源顯示了豐富的遺傳多樣性。He和I是衡量物種遺傳多樣性的重要指標[30]。本研究中,在種的水平上,黑老虎的He和I分別為0.648和1.421,He高于鄒建文等[20]對湖南3個黑老虎群體的研究結(jié)果(SSR,He分別為0.278、0.165和0.292),高于五味子屬的其他幾個種(SSR,紅花五味子S. rubriflora,I=0.368 6;華中五味子S. sphenanthera,I=0.561 5;金山五味子S. glaucescens,I=0.469 7;狹葉五味子S. lancifolia,I=0.396 2)[31],也明顯高于顧蔚[32]對8?。ㄊ校?5份種質(zhì)資源(華中五味子)的研究結(jié)果(AFLP,He=0.196,I=0.317)。可見,黑老虎種質(zhì)資源具有非常豐富的遺傳多樣性,為黑老虎種質(zhì)資源下一步的遺傳改良提供了廣泛的遺傳基礎(chǔ)。5個群體中馬關(guān)群體的遺傳多樣性相對最為豐富,可作為遺傳材料選擇的重點群體。遺傳多樣性是物種進化與環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果,與分布、生活史、繁殖系統(tǒng)、遺傳漂變、人為活動等密切相關(guān)[33]。黑老虎廣泛的分布范圍及果實的食用性導致了其豐富的遺傳多樣性。黑老虎生長的海拔為200~2 000 m,國內(nèi)廣泛分布于四川、浙江、廣東、廣西、貴州、海南、湖南、江西和云南等地,境外緬甸、老撾、泰國、越南和印度尼西亞等地也有分布[1],為了適應(yīng)分布區(qū)域復雜的地形地貌、多樣的氣候環(huán)境,在漫長的進化過程中,黑老虎積累了豐富的遺傳變異,另外,黑老虎果實色彩鮮艷、多汁而風味獨特,由此鳥類、動物包括人類在食用果實的過程中便成為了種子的傳播者,幫助擴大種群,提高了物種的遺傳多樣性。
對群體遺傳分化狀況的分析結(jié)果表明,黑老虎群體間存在極高的遺傳分化,遺傳變異主要來源于群體內(nèi)。遺傳分化系數(shù)(Fst)是評估群體間遺傳分化程度的遺傳參數(shù),當Fst<0.05時,群體間分化程度低;當0.05≤Fst<0.15時,群體間分化程度中等;當0.15≤Fst<0.25時,群體間分化程度高;當Fst≥0.25時,群體間遺傳分化程度極高[34-35]。本研究的Fst=0.323,表明5個黑老虎群體間存在極高的遺傳分化,另外,此數(shù)據(jù)也表明32.3%的變異來源于群體間,分子方差分析(AMOVA)也得到了類似的結(jié)果,有28.8%的變異來源于群體間,可見黑老虎的遺傳變異主要分布在群體內(nèi)。本研究的Fst值遠高于顧蔚[32](AFLP,F(xiàn)st=0.135 0)和閆伯前等[36](SSR,F(xiàn)st=0.107 7)對華中五味子群體的研究結(jié)果,高于吳生[31]對秦嶺地區(qū)五味子屬植物的研究結(jié)果(SSR,F(xiàn)st=0.241 5),略高于Sun等[37]對五味子Schisandra chinensis和華中五味子的研究結(jié)果(ISSR,F(xiàn)st=0.270 0)??梢姾诶匣⑷后w間的遺傳分化極高,較同科植物具有更高的群體遺傳分化,遺傳變異主要分布在群體內(nèi)。資源分布、繁育系統(tǒng)、基因流、種子散布等因素共同影響群體的遺傳分化[38],其中,基因流是非常重要的因素之一。通常基因流大的物種,群體間的遺傳分化就會較小。按照Nm值,基因流被劃分成3個等級:0
UPGMA聚類與STRUCTURE分析2種聚類方式得到了相同的類群劃分結(jié)果,70份黑老虎種質(zhì)資源被劃分成了3個類群:馬關(guān)群體資源構(gòu)成的類群Ⅰ,屏邊群體資源組成的類群Ⅱ,以及廣西群體、貴州群體及湖南群體資源組成的類群Ⅲ。結(jié)果表明,大部分種質(zhì)的遺傳背景比較單一,同一群體的不同種質(zhì)遺傳組分基本相同,另外,同一群體的資源基本聚在同一個類群中。UPGMA聚類是根據(jù)遺傳距離或遺傳相似性進行類群劃分,通常會受到一定程度的人為操作影響,STRUCTURE分析可將劃分不明的群體(單株)劃分到相應(yīng)的類群中,表現(xiàn)的形式更為明確[40],而且能很好地反映材料間基因交流和滲入的情況以及材料的遺傳組分情況,有助于育種者更為準確地掌握種質(zhì)間的遺傳關(guān)系[41],為進一步開展資源選育、遺傳改良及有效保護提供科學參考。
3.2 結(jié) 論
黑老虎種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性,為其遺傳改良提供了廣泛的遺傳基礎(chǔ)。本研究中,馬關(guān)群體的遺傳多樣性相對最為豐富,應(yīng)作為遺傳材料選擇的重點群體。另外,群體間存在極高的遺傳分化,基因交流不頻繁,遺傳變異主要來源于群體內(nèi)的個體。群體內(nèi)較強的近親交配易導致種群衰退。大部分種質(zhì)的遺傳背景比較單一,同一群體的不同種質(zhì)遺傳組分基本相同。由此,在后續(xù)的黑老虎育種及資源保護和開發(fā)工作中,在盡量涵蓋全部群體類別的基礎(chǔ)上,應(yīng)特別重視遺傳多樣性豐富的群體以及各群體內(nèi)不同類型個體的選擇、保存和利用。
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[本文編校:謝榮秀]