當歸根際土壤中木霉菌的分離鑒定及拮抗作用

摘要：收集甘肅省道地中藥材當歸根際土壤，采用平板稀釋法分離土壤中木霉菌株，利用平板對峙法測定其拮抗作用，結(jié)合形態(tài)學特征及ITS序列比對鑒定木霉菌株分類地位，以期篩選具有生防作用的菌株并明確其拮抗作用。結(jié)果表明，從甘肅省當歸根際土壤中分離得到21株木霉菌株，篩選出1株對靶標菌拮抗效果最好的木霉菌株TD-5，鑒定為長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）。TD-5對茄病鐮刀菌（Fusarium solani）拮抗作用最好，抑制率為83.31%；對首都葉點霉菌（Phyllosticta capitalensis）的拮抗作用最差，抑制率為24.55%；對三線鐮刀菌（Fusarium tricinctum）和膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）的拮抗作用介于二者之間。菌株TD-5的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對茄病鐮刀菌的抑菌效果最好（抑制率79.44%），對膠孢炭疽菌的抑菌效果較差（抑制率64.99%）；其難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對三線鐮刀菌的抑菌效果最好（抑制率70.72%），對茄病鐮刀菌的抑菌效果最差（抑制率31.12%）。

關(guān)鍵詞：當歸；木霉菌；生防菌；分離鑒定；拮抗作用

中圖分類號：S567.239 文獻標志碼：A 文章編號：2097-2172（2024）08-0774-05

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.08.014

Isolation， Identification and Antagonism of Biocontrol Trichoderma spp.

from Rhizosphere Soil of Angelica sinensis

LIU Lilong 1， 2， ZHANG Aiqin 1， ZHANG Huan 1， MI Yongwei 3， HU Xiaofen 4， LI Yufang 1

（1. Institute of Animal Husbandry， Pasture and Green Agriculture， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China; 2. Wheat Research Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China; 3. Institute of

Chinese Herbal Medicines， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China; 4. Forest Farm

of Tange， Xiaolong Mountain Forestry Protection Center of Gansu Province， Tianshui Gansu 741300， China）

Abstract： Soil samples were collected from the rhizosphere of authentic medicinal herb Angelica sinensis in Gansu Province， and Trichoderma spp. strains were isolated using the dilution coating method. The antagonistic effects were determined using the plate confrontation method， and the classification of Trichoderma spp. strains were identified through morphological characteristics and ITS sequence alignment， aiming to screen strains with biocontrol potential and clarify their antagonistic effects. The results showed that 21 Trichoderma spp. strains were obtained by isolated from the rhizosphere soil of Angelica Sinensis in Gansu Province， 1 strain with the best inhibitory effect on the target pathogens was screened and identified as Trichoderma longibrachiatum strain TD-5. TD-5 had the strongest antagonistic effect on Fusarium solani with an inhibitory rate at 83.31%， antagonistic effect against Phyllosticta capitalensis was the worst（inhibitory rate was 24.55%）， the antagonism effects against Fusarium tricinctum and Colletotrichum gloesosporioides were between them. The volatile metabolites of TD-5 were most sensitive to Fusarium solani （inhibitory rate was 79.44%）， the sensitivity to Colletotrichum gloesosporioides was the lowest （inhibitory rate was 64.99%）; Non-volatile metabolites from strain TD-5 were most sensitive to Fusarium tricinctum（inhibitory rate was 70.72%）， the sensitivity to Fusarium solani was the lowest （inhibitory rate was 31.12%）.

Key words： Angelicae sinensis; Trichoderma spp.; Biocontrol bacteria; Isolation and identification; Antagonism

當歸（Angelica sinensis）是傘形科當歸屬多年生草本植物，以干燥根入藥，有活血、調(diào)經(jīng)、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤和抗抑郁等功效［1 ］。甘肅道地中藥材“岷歸”主產(chǎn)區(qū)集中在定西、隴南等地區(qū)，種植歷史悠久，效佳質(zhì)優(yōu)［2 ］。近年來，隨著中醫(yī)藥大健康產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，當歸需求量逐年增加，已成為促進當?shù)亟?jīng)濟和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要支柱。然而，隨著種植規(guī)模的逐步擴大，因連作等不規(guī)范栽培方式導致的當歸土傳病害發(fā)生日趨嚴重。化學農(nóng)藥是防治當歸病害最有效的方式之一，但長期不科學、大量和單一使用會引起病原菌的抗藥性、當歸產(chǎn)品品質(zhì)下降和質(zhì)量安全等問題［3 ］。利用生物防治替代化學農(nóng)藥是目前防治植物病害最安全、可持續(xù)、對環(huán)境友好的方法，對防治中藥材土傳病害具有重要意義。

木霉菌（Trichoderma spp.）作為植物病害生物防治中應用和研究較多的一類真菌，大量存在于土壤、植物根部和各種環(huán)境中［4 ］，其因具有拮抗、重寄生和生態(tài)競爭等作用，能夠抑制植物病原菌的生長。近年來，利用木霉菌防治中藥材病害已有較多報道。肖春萍等［5 ］從人參健株根際土壤中篩選出的長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）和多孢木霉（Trichoderma polysporum）對人參7種病原菌的抑菌率達46.67%以上；潘爭艷等［6 ］從遼寧省20種藥用植物土壤中分離篩選出4株對5種靶標菌抑制率大于70%的木霉菌；丁萬隆等［7 ］開展木霉菌株對中藥材病原菌的抑菌試驗，通過溫室盆栽和田間防治兩種處理方式，發(fā)現(xiàn)木霉制劑對溫室盆栽北沙參菌核病的防治效果高達83.6%，對黃芪根腐病的田間防治達效果高達80%，表明可以用生防木霉制劑替代多菌靈等常用農(nóng)藥。研究和實踐表明，木霉菌對部分中藥材土傳病害的防治經(jīng)濟有效，且越來越受到人們的重視，但利用木霉菌及其制劑防治當歸病害的相關(guān)報道較少。本研究擬從甘肅省道地中藥材當歸根際土壤中分離篩選對當歸土傳病害拮抗作用較好的木霉菌株，以期為當歸土傳病害的防治提供生物防菌資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土樣采集于甘肅省當歸主要種植區(qū)域的定西市渭源縣（會川鎮(zhèn)、五竹鎮(zhèn)、路園鎮(zhèn)）、漳縣（三岔鎮(zhèn)、大草灘鎮(zhèn)、金鐘鎮(zhèn)）、岷縣（梅川鎮(zhèn)、麻子川鎮(zhèn)、秦許鄉(xiāng)）和隴南市宕昌縣（哈達鋪鎮(zhèn)、阿塢鎮(zhèn)、南河鎮(zhèn)），共4個縣12個鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）。每個采集地隨機選取當歸田3塊，采用五點混合采樣法，挖取5～20 cm土層內(nèi)的當歸根系，先抖落大塊不含根系的土壤，然后取根系表面1～2 mm的細粒土樣約100 g，混合均勻經(jīng)自然風干后過篩（16目標準篩，孔徑1 mm），裝入無菌密封袋儲存于4 ℃或零下20 ℃冰箱備用。

供試靶標菌株：茄病鐮刀菌（Fusarium solani）和三線鐮刀菌（Fusarium tricinctum）分離自采集的當歸根際土壤，為當歸土傳病害病原菌［8 ］；膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloesosporioides）和首都葉點霉菌（Phyllosticta capitalensis）能侵染芒果、香蕉、火龍果及蜜柚等水果，均分離自采集的當歸根際土壤［9 - 10 ］，其對當歸是否具有致病性需進一步測定。以上4種靶標菌均保存于甘肅省農(nóng)業(yè)科學院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所（甘肅省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所）微生物實驗室。

供試培養(yǎng)基：馬丁式-孟加拉紅培養(yǎng)基（葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、磷酸二氫鉀5 g、七水硫酸鎂0.5 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 L、1%孟加拉紅水溶液3.3 mL）用于分離木霉菌菌株，并加入頭孢霉素（200 mg/L）作為細菌抑制劑（培養(yǎng)基溫度40 ℃左右）；PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基，馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1 L）用于木霉菌篩選和拮抗作用分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 木霉菌的分離純化 采用稀釋涂布法分離木霉菌株［11 ］。準確稱取待測土樣10 g，放入裝有90 mL無菌水的三角瓶（150 mL）中，加入20 g石英砂，置于25 ℃搖床上130～160 rpm振蕩2.5 h，使土壤中的微生物均勻分散，靜置10 min，即為稀釋度為1×10-1 g/mL的土壤懸浮液，再依次使用無菌水稀釋至1×10-2、1×10-3、1×10-4 g/mL備用。分別吸取各梯度的稀釋液100 ？滋L，采用“涂布法”均勻涂布于馬丁式-孟加拉紅培養(yǎng)基，置于25 ℃光照和黑暗（16/8 h）條件下培養(yǎng)3 d，挑取培養(yǎng)基上疑似木霉菌菌落邊緣的少量菌絲接種于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，并對培養(yǎng)菌株編號。長出菌落后，挑取菌落邊緣的菌絲轉(zhuǎn)移至新的PDA培養(yǎng)基進行純化培養(yǎng)得到單一菌株。單一菌株接種于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d后在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 木霉菌拮抗病原菌的室內(nèi)平板測定 采用平板對峙培養(yǎng)法［12 ］，將靶標菌株和分離純化得到的木霉菌菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫條件下活化3 d后，用直徑5 mm的打孔器在病原菌和木霉菌菌落邊緣打取菌餅，將木霉菌菌餅分別與4種靶標菌菌餅接種于PDA培養(yǎng)基兩端，兩菌餅間隔6 cm，以只接種病原菌為對照，3次重復。28 ℃恒溫下培養(yǎng)，每天定時測量病原菌菌落生長半徑，培養(yǎng)7 d后計算病原菌生長抑制率。

抑制率（%）=［對照菌落半徑（cm）－處理菌落半徑（cm）］/對照菌落半徑（cm）×100

1.2.3 木霉菌代謝產(chǎn)物對病原菌的抑菌作用測定

木霉菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌的抑菌作用測定：采用對扣培養(yǎng)法［13 ］，將木霉菌菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d后，上方蓋雙層無菌圓形玻璃紙（廣州艾諾利高新材料有限公司，直徑約10 mm），再將剛接種病原菌菌餅的PDA培養(yǎng)基扣于其上并密封，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。以空白PDA培養(yǎng)基與病原菌對扣培養(yǎng)為對照，3次重復，采用1.2.2描述的方法計算抑制率（下同）。

木霉菌難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌的抑菌作用：采用圓盤濾膜法［13 ］，在PDA培養(yǎng)基上鋪雙層無菌玻璃紙，中央接種已活化3 d的木霉菌餅，28 ℃恒溫培養(yǎng)。待木霉菌絲長滿玻璃紙前，移去玻璃紙并接種已活化的病原菌，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。以未培養(yǎng)過木霉菌的PDA培養(yǎng)基接種病原菌作為對照，每個處理3次重復，計算抑制率。

1.2.4 木霉菌鑒定 形態(tài)學特征鑒定：將木霉菌株接種在PDA培養(yǎng)基活化后，打取菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后，在菌落顏色出現(xiàn)明顯變化期間逐日挑取培養(yǎng)物制片，在光學生物顯微鏡（OLYMPUS BX43，日本奧林巴斯株式會社）下觀察子實體形態(tài)特征并拍照。參照楊合同著的《木霉分類與鑒定》［14 ］，根據(jù)菌絲體顏色、孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征初步確定木霉菌株的分類地位。

分子生物學鑒定：按上述方法，將培養(yǎng)5 d后的木霉菌，委托成都羅寧生物科技有限公司提取DNA，選用rDNA-ITS通用引物：ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）進行PCR擴增。PCR擴增反應體系25 μL：2×PCR MasterMix 12.5 μL、DNA模板1 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR擴增反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。對擴增產(chǎn)物進行測序，將獲得的序列通過MIST（Multilocus Identification System for Trichoderma）進行聯(lián)合比對分析（http：//mmit.china-cctc.org/，參數(shù)設(shè)置Identity值98，Expect Value值0.000 01，Coverage值0.8）［15 ］。同時，應用MEGA 5.1軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定該菌與同屬菌株間的親緣關(guān) 系［16 ］。Nectria berolinensis CBS 127382作為外群。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)處理，采用DPS v7.05軟件進行統(tǒng)計分析，應用Duncan新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌的分離結(jié)果

從采集的36份土壤樣品中經(jīng)分離、純化共得到21株木霉菌菌株。其中從采自定西市渭源縣和岷縣的土樣中分離得到的木霉菌最多，均為6株；采自隴南市宕昌縣的土樣中分離到的最少，為4株；從來自定西市漳縣的土樣中分離到的菌株為5株。

2.2 木霉菌對病原菌的拮抗效果

以茄病鐮刀菌、三線鐮刀菌、膠孢炭疽菌和首都葉點霉菌作為靶標菌株，利用對峙培養(yǎng)篩選得到1株對靶標菌抑制效果最好的木霉菌菌株TD-5。從表1可以看出，菌株TD-5對4種病原菌的抑制率差異顯著（P ＜ 0.05），對茄病鐮刀菌拮抗作用最好，抑制率達83.31%；對首都葉點霉菌的拮抗作用最差，抑制率為24.55%；對三線鐮刀菌和膠孢炭疽菌的抑制率分別為63.21%和45.15%。從木霉菌生長趨勢可見，其菌絲生長迅速，能迅培養(yǎng)3 d即可觀察到，病原菌的生長明顯受到限制，4 d時木霉菌包圍整個病原菌，5 d后被包圍的病原菌邊緣塌陷幾乎不再生長（圖1）。

2.3 菌株TD-5代謝產(chǎn)物對病原菌的抑菌作用

菌株TD-5揮發(fā)性與難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對4種病原菌均有抑制作用（表2）。菌株TD-5揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對4種病原菌的抑制效果均在60.00%以上，對2種鐮刀菌最為敏感（抑制率均高于75.00%）。對茄病鐮刀菌的抑制率最高，為79.44%；對膠孢炭疽菌的抑制率最低，為64.99%，且二者差異顯著（P ＜ 0.05）。對三線鐮刀菌和首都葉點霉菌的抑制率分別為75.69%和70.15%。菌株TD-5難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對三線鐮刀菌最為敏感，抑制率為70.72%；對茄病鐮刀菌的敏感度最低，抑制率為31.12%，且二者之間差異顯著（P ＜ 0.05）；對首都葉點霉菌和膠孢炭疽菌的抑制率分別為44.15%和46.50%，兩者差異不顯著。

以上結(jié)果表明，菌株TD-5揮發(fā)性和難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對當歸根腐病主要病原菌三線鐮刀菌的抑制率均高于70.00%，生防潛力較大。

2.4 菌株TD-5的形態(tài)學鑒定

菌株TD-5在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，菌絲即可長滿整個培養(yǎng)皿。初期菌落呈白色，隨著菌絲不斷地生長，菌落上長出稠密的分生孢子堆，呈黑綠色，逐漸覆蓋整個菌落；4 d后有白色雜斑點出現(xiàn)，同時伴有不太明顯的同心輪紋。在培養(yǎng)皿邊緣，可形成少量墊狀聚合體結(jié)晶（圖2）。分生孢子呈綠色，橢圓形，孢子壁光滑；分生孢子梗有發(fā)育強壯的中軸，在中軸上向頂端產(chǎn)生單生的分生孢子梗，隨著離頂端距離的延伸，產(chǎn)生成對長度逐漸增加的二次分枝，瓶梗直接產(chǎn)生于二次分枝。分生孢子梗單生，圓柱形（圖3）。據(jù)此，初步將菌株TD-5鑒定為木霉屬（Trichoderma sp.）真菌。

2.5 菌株TD-5的分子生物學鑒定

將測序獲得的菌株TD-5的rDNA-ITS序列輸入MIST，按照已設(shè)置的檢索參數(shù)對序列同源性進行比對分析，選擇Nectria berolinensis作為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。結(jié)果表明，菌株TD-5與Trichoderma longibrachiatum（MT 000971）位于同一進化分枝，且序列同源性為99%。結(jié)合形態(tài)學特征和分子生物學鑒定結(jié)果，確定菌株TD-5為長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）。

3 討論與結(jié)論

利用分離自中藥材根際土壤中的生防木霉菌來防治中藥材土傳病害，具有重要的科學研究和應用價值。研究發(fā)現(xiàn)，從藥用植物根際土壤分離篩選出來的生防木霉菌如綠色木霉（Trichoderma viride）、長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）、多孢木霉（Trichoderma polysporum）和哈茨木霉（Trichoderma harzianum）等對中藥材人參、麥冬丹參、川芎和黃芪等土傳病害都有較好的防治效果［5 - 7 ］。本研究以甘肅道地中藥材當歸土傳病害的生物防治研究為切入點，從甘肅省當歸根際土壤中分離篩選出1株拮抗作用好的木霉菌株TD-5，并鑒定為長枝木霉，其對當歸土傳病害的病原菌茄病鐮刀菌拮抗效果達83.31%，生防潛力大。

一般木霉產(chǎn)生的抗生物質(zhì)以吡喃酮類、膠霉毒素等最多，且對植物病原真菌有廣譜拮抗活性。深綠木霉、哈茨木霉和康寧木霉均能產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)吡喃酮-6-戊基-2H-吡喃-2-酮（簡稱6PP），對立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和灰葡萄孢均有抑菌活性，膠霉毒素對終極腐霉和立枯絲核菌等植物病原真菌具有強烈的抑制活性［17 ］。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株TD-5的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對茄病鐮刀菌和三線鐮刀菌的抑制率最高，難揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對三線鐮刀菌的抑制率最高，且抑制率均高于70%。

綜上，分離自甘肅省道地中藥材當歸根際土壤的長枝木霉TD-5拮抗效果好，生防潛力大，可作為當歸土傳病害防治的生防菌資源。

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