礬根胚性愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生

摘要：為了建立礬根組培快繁體系，以礬根去頂尖幼嫩頂芽為外植體，研究不同培養(yǎng)基對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)、胚性愈傷組織增殖以及植株再生的影響。結(jié)果表明，愈傷組織最佳培養(yǎng)基為MS+2.4-D 3.0 mg/L+6-BA 0.3 mg/L，愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到93.0%，團(tuán)塊較大，結(jié)構(gòu)較松散，有顆粒狀態(tài)，個(gè)別團(tuán)塊呈水浸狀；以最優(yōu)胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基為MS+2.4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.2 mg/L進(jìn)行擴(kuò)增，愈傷組織發(fā)育較好，結(jié)構(gòu)較松散，顆粒狀疣突分明，水分較少，呈淡黃綠色。胚狀體分化最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.2 mg/L，胚狀體誘導(dǎo)率達(dá)91.8%。對(duì)幼根發(fā)育不良的植株，在1/2MS+IBA 0.1 mg/L+IAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)效果好，生根率100%，平均根數(shù)5.5條，根長(zhǎng)2～3 cm，苗高4.1 cm。

關(guān)鍵詞：礬根；去頂尖幼嫩頂芽；胚性愈傷組織；誘導(dǎo)；植株再生

中圖分類號(hào)：S682 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2097-2172（2024）08-0747-05

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.08.009

Study on Embryonic Callus Induction and Plant Regeneration of

Heuchera micrantha

REN Yuxin

（Gansu Forestry Professional Technology College， Tianshui Gansu 741020， China）

Abstract： In order to establish tissue culture and rapid propagation system of Heuchera micrantha， using the young terminal buds of Heuchera micrantha as explants， this study investigated the effects of different media on the induction， proliferation， and regeneration of embryogenic callus tissues. The results showed that the medium MS+2.4-D 3.0 mg/L+6-BA 0.3 mg/L had a high callus induction rate of 93.0%. The callus formed was large， loosely structured， and grainy but immature， with some clusters appearing water-soaked. For the proliferation of embryogenic callus tissues， the medium MS+2.4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.2 mg/L resulted in well-developed callus tissues that were loosely structured with distinct granular nodules and less water content， presenting a light yellow-green color. The differentiation medium MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.2 mg/L achieved a differentiation rate of 91.8%. For plants with poorly developed young roots， rooting culture on 1/2 MS+IBA 0.1 mg/L+IAA 0.1 mg/L resulted in a rooting rate of 100%， with an average of 5.5 roots per plant， root lengths of 2 to 3 cm， and plant height of 4.1 cm.

Key words： Heuchera micrantha; Terminal bud; Embryogenic callus; Induction; Plant regeneration

礬根（Heuchera micrantha）又名珊瑚鈴，為虎耳草科礬根屬多年生草本花卉［1 ］，原產(chǎn)美洲中部，近年來(lái)在北方園林綠化中大量應(yīng)用。礬根葉色艷麗繁多，極具觀賞價(jià)值，可盆栽種植后置于室內(nèi)。園林中多在喬灌木下種植，可用于做花境、花壇、地被及庭院綠化等，也可用于土壤修復(fù)［2 ］。礬根耐寒，在肥沃濕潤(rùn)排水良好的土壤中生長(zhǎng)良好，喜中性偏酸、疏松透氣的土壤，適宜半遮陰的生長(zhǎng)環(huán)境，忌強(qiáng)光直射。礬根小苗長(zhǎng)勢(shì)較慢，成苗后生長(zhǎng)旺盛，是少有的彩葉陰生地被植物，能耐-34 ℃低溫［3 ］。礬根品種繁多，種苗生產(chǎn)以組織培養(yǎng)與分株繁殖為主，部分品種可用種子繁殖，但種子發(fā)芽慢而且不整齊［4 ］，關(guān)于礬根組織培養(yǎng)與快速繁殖的研究已有報(bào)道［5 - 7 ］，但對(duì)其胚性愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生的研究還尚未見(jiàn)報(bào)道。為了建立礬根組培快繁體系，筆者于2022 — 2023年以礬根優(yōu)良品種甜茶去頂尖幼嫩頂芽為外植體，優(yōu)化和改良培養(yǎng)基，誘導(dǎo)產(chǎn)生了胚性愈傷組織，并通過(guò)分化培養(yǎng)，建立了胚狀體再生體系，由胚狀體快速發(fā)育成完整植株，為規(guī)?；a(chǎn)種苗奠定基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究礬根體細(xì)胞胚人工種子生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

材料來(lái)源于甘肅林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院校區(qū)實(shí)訓(xùn)基地，選擇礬根優(yōu)良種苗，剪取頂芽，剝?nèi)バ∪~，用清水沖洗干凈后待用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌體系建立 4月中旬剪取幼嫩頂芽，剝除全部葉片，用毛刷蘸1%的洗衣粉水刷掉上面的灰塵微粒，然后用清水將洗衣粉溶液清洗干凈。切去根莖部，保留錐形芽體，在超凈工作臺(tái)上用75%酒精浸泡30 s，用無(wú)菌水沖洗5遍，再轉(zhuǎn)入1 g/kg升汞溶液＋吐溫-80（2滴）中浸泡5 min，再用無(wú)菌水沖洗5遍，然后置于高壓滅菌過(guò)鋪有濾紙的接種盤中，切去頂尖和底部致褐部分，接種于無(wú)激素的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行無(wú)菌材料的篩選，培養(yǎng)基中附加蔗糖3%、高強(qiáng)瓊脂0.6%、pH為5.8～6.0，培養(yǎng)溫度22 ℃，光照強(qiáng)度1 000 Lx，光照時(shí)間12 h/d，7 d后選擇無(wú)污染的外植體材料，進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.2.2 胚性愈傷組織誘導(dǎo) 將1.2.1培養(yǎng)所得的無(wú)菌材料接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，愈傷誘導(dǎo)以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA和2，4-D，設(shè)計(jì)兩因素三水平共9個(gè)隨機(jī)處理（表1）， 每處理10瓶培養(yǎng)基， 每瓶接種1個(gè)外植體， 3次重復(fù)。暗培養(yǎng)15 d再轉(zhuǎn)入500 Lx弱光培養(yǎng)［8 ］，光照時(shí)間10 h/d，培養(yǎng)基中附加蔗糖3%，高強(qiáng)瓊脂0.6%，pH為5.8～6.0，培養(yǎng)溫度22～25 ℃，40 d后觀察并統(tǒng)計(jì)愈傷組織。

愈傷組織誘導(dǎo)率=（形成胚性愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%。

1.2.3 胚性愈傷組織增殖培養(yǎng) 為促進(jìn)胚性愈傷組織的成熟，提高胚狀體在愈傷組織中的比例，可采用降低激素濃度或沒(méi)有生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織的增殖和成熟培養(yǎng)［9 ］，增殖培養(yǎng)基以愈傷誘導(dǎo)結(jié)果為依據(jù)，選擇愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)的最佳組合，適當(dāng)降低培養(yǎng)基中6-BA和2，4-D的濃度組成增殖培養(yǎng)基。挑選發(fā)育較好，團(tuán)塊較大的愈傷組織，切分成直徑為3～5 mm的小塊接種于增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中附加蔗糖3%，高強(qiáng)瓊脂0.6%，pH為5.8～6.0。光照強(qiáng)度為1 500 Lx，光照時(shí)間12 h/d，培養(yǎng)溫度22～25 ℃，以20 d為培養(yǎng)周期，增殖培養(yǎng)兩代后轉(zhuǎn)入再分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)植株再生。

1.2.4 植株再生培養(yǎng) 將增殖培養(yǎng)形成的大塊愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基， 添加不同濃度的6-BA、NAA和IBA，設(shè)計(jì)三因素兩水平共8個(gè)隨機(jī)處理（表2）， 每處理10瓶， 每瓶接種3塊愈傷組織， 重復(fù)3次， 培養(yǎng)基中附加蔗糖3%，高強(qiáng)瓊脂0.6%，pH為5.8～6.0，培養(yǎng)溫度20～22 ℃，光照強(qiáng)度為1 500 Lx，光照時(shí)間12 h/d，40 d后觀察統(tǒng)計(jì)胚狀體誘導(dǎo)率。

胚狀體誘導(dǎo)率=（形成胚狀體的愈傷塊數(shù)/接種愈傷組織數(shù)）×100%

1.2.5 壯苗與生根 再分化產(chǎn)生的幼苗，有部分太弱小或無(wú)根，還需通過(guò)壯苗培養(yǎng)形成健壯幼莖后，以便生根和移栽，壯苗培養(yǎng)基采用無(wú)激素添加的MS培養(yǎng)基［10 ］，并增加蔗糖和瓊脂的添加量［11 ］，即MS+蔗糖5%+高強(qiáng)瓊脂0.7%，pH為5.8～6.0，培養(yǎng)溫度20～22 ℃，光照強(qiáng)度為2 000 Lx［12 ］，光照時(shí)間12 h/d，壯苗培養(yǎng)25～30 d將健壯幼莖切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中。生根培養(yǎng)可選用1/2MS為基本培養(yǎng)基添加不同濃度的IBA和IAA，設(shè)計(jì)兩因素兩水平共4個(gè)隨機(jī)處理（表3），培養(yǎng)基中均附加蔗糖2%，其他條件與前述同，30 d后觀察生根情況，并統(tǒng)計(jì)生根率。

生根率=（生根苗數(shù)/接種苗數(shù)）×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Excel 2021進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚性愈傷組織誘導(dǎo)與增殖

根據(jù)觀察，外植體接種7 d后開(kāi)始膨大（圖1），14 d后膨大部位快速生長(zhǎng)并逐漸形成淡黃色的愈傷組織，隨著細(xì)胞團(tuán)的不斷形成，整個(gè)芽體變成了愈傷組織塊。從表1可以看出，不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2，4-D與6-BA對(duì)愈傷組織的形成都有一定影響，在相同6-BA濃度下，隨著2，4-D濃度增大愈傷誘導(dǎo)率也增加，培養(yǎng)基MS+6-BA 0.3 mg/L+2，4-D 3.0 mg/L下外植體發(fā)育良好，愈傷誘導(dǎo)率較高，為93.0%，團(tuán)塊較大，40 d后平均直徑為2.22 cm。結(jié)構(gòu)較松散，有顆粒狀態(tài)，個(gè)別塊呈水浸狀（圖2），綜合分析，MS+6-BA 0.3 mg/L+2，4-D 3.0 mg/L為較適合的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基。根據(jù)胚性愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果，適當(dāng)降低培養(yǎng)基濃度，即6-BA濃度為0.2 mg/L、2，4-D濃度為2.0 mg/L下進(jìn)行增殖培養(yǎng)，從圖3可以看出，在降低激素濃度的MS+6-BA 0.2 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L上增殖培養(yǎng)的愈傷組織發(fā)育較好，結(jié)構(gòu)較松散，顆粒狀疣突分明，水分較少，呈淡黃綠色。

2.2 植株再生

將增殖后的大塊愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上。培養(yǎng)20 d后顆粒狀的愈傷組織表面疣突逐漸增大并轉(zhuǎn)綠，繼而形成小植株，40 d后可以看出，8種培養(yǎng)基上愈傷組織都能分化出小植物株，但隨著激素配比不同分化效果存在差異。以MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.2 mg/L組合的胚狀體誘導(dǎo)效果較好，占比較高，胚狀體誘導(dǎo)率達(dá)91.8%；且生長(zhǎng)均勻，無(wú)根苗很少，大部分幼苗可直接進(jìn)行煉苗與移栽（表2、圖4）。MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.2 mg/L、MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.2 mg/L處理雖然分化率也較高，但再生植株幼根發(fā)育不良，或有少量玻璃化苗，需進(jìn)行壯苗與生根培養(yǎng)后才能進(jìn)行煉苗與移栽。

2.3 壯苗與生根培養(yǎng)

從表3可以看出，將胚狀體發(fā)育過(guò)程中形成的弱小株、無(wú)根幼芽轉(zhuǎn)接于無(wú)激素的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 d后苗壯葉茂，大多根系發(fā)育良好。健壯無(wú)根幼苗在添加IBA和IAA的1/2MS培養(yǎng)基上都能生根，其中培養(yǎng)基1/2 MS+IBA 0.1 mg/L+ IAA 0.1 mg/L上生根率100%，幼苗生長(zhǎng)較好，苗莖均勻直立，苗高可達(dá)4.1 cm，且有新根4～6條帶側(cè)根，長(zhǎng)約2～3 cm（表3、圖5）。

3 討論與結(jié)論

研究表明，組織培養(yǎng)是礬根高效快繁的最佳途徑，而在外植體的選擇上有莖尖、莖段、葉片、葉柄等材料，但以莖尖為外植體誘導(dǎo)效果較好，因莖尖內(nèi)含芽原基細(xì)胞，有潛在的不定芽分化能力，具誘導(dǎo)速度較快，誘導(dǎo)成功率較高等優(yōu)點(diǎn)［13 ］，且莖尖培養(yǎng)有脫病毒、復(fù)壯優(yōu)良種性的特點(diǎn)［14 ］，此外，分生組織細(xì)胞還具胚狀體發(fā)生能力。本次試驗(yàn)選用了莖尖為外植體材料，對(duì)愈傷誘導(dǎo)和胚狀體分化都產(chǎn)生了顯著影響。愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)中2，4-D是較理想的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，但其不能較好的促進(jìn)胚性細(xì)胞的形成，通常采用生長(zhǎng)素2，4-D 與低濃度細(xì)胞分裂素 6-BA配合使用，才能有效促進(jìn)胚性細(xì)胞的發(fā)育［15 ］，本試驗(yàn)在培養(yǎng)基MS+6-BA 0.3 mg/L+2，4-D 3.0 mg/L條件下愈傷組織誘導(dǎo)效果最好。增殖培養(yǎng)周期對(duì)體胚發(fā)生具有顯著影響［16 ］，因此為了獲得優(yōu)質(zhì)胚性細(xì)胞以促進(jìn)胚狀體的形成，可適當(dāng)縮短愈傷組織的培養(yǎng)周期，增加其培養(yǎng)代數(shù)，本試驗(yàn)以20 d為周期，增殖兩代后進(jìn)行再分化培養(yǎng)，有助于提高芽苗的再生能力。再分化過(guò)程中，以MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.2 mg/L的組合胚狀體分化效果較好，分化率較高，但MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.2 mg/L的幼苗不同程度上存在愈傷和玻璃化情況。降低培養(yǎng)基中6-BA的濃度，提高瓊脂和蔗糖的添加量對(duì)芽苗的玻璃化有一定的控制作用，但瓊脂濃度過(guò)高，硬化的培養(yǎng)基會(huì)影響試管苗對(duì)養(yǎng)分的吸收，蔗糖濃度過(guò)高時(shí)水解緩慢，同時(shí)也影響其他物質(zhì)的吸收。無(wú)根不定芽在試驗(yàn)生根培養(yǎng)基上都可誘導(dǎo)生根，但從生根率、平均根數(shù)及平均苗高數(shù)據(jù)分析，IBA與IAA對(duì)幼根發(fā)生率都有顯著影響，但I(xiàn)AA影響大于IBA，且低濃度組合更有助于幼根發(fā)生，1/2 MS+IBA 0.1 mg/L+IAA 0.1 mg/L誘導(dǎo)根的數(shù)量較多且質(zhì)量較好。

本試驗(yàn)在胚性愈傷誘導(dǎo)過(guò)程中，MS+2，4-D 3.0 mg/L+6-BA 0.3 mg/L是較理想的培養(yǎng)基組合，誘導(dǎo)率可達(dá)93.0%，愈傷組織在MS+2，4-D 2.0 mg/L+ 6-BA 0.2 mg/L上進(jìn)行擴(kuò)增后，組織塊結(jié)構(gòu)松散，顆粒分明，水分較少，有利于胚狀體分化；胚狀體誘導(dǎo)過(guò)程中，培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.1 mg/L+IBA 0.2 mg/L上分化效果較好，胚狀體誘導(dǎo)率達(dá)91.8%；且芽苗生長(zhǎng)均勻健壯，大多無(wú)需生根培養(yǎng)；對(duì)于弱小株和無(wú)根幼芽需轉(zhuǎn)接于無(wú)激素的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 d后苗壯葉茂，大多根系發(fā)育良好；在生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA 0.1 mg/L+IAA 0.1 mg/L上，礬根幼苗生根率100%，生長(zhǎng)健壯，苗體均勻，高達(dá)4.1 cm，且有新根4～6條帶側(cè)根，長(zhǎng)約2～3 cm。

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