基于高溫高濕條件下蘋果加工過程中代謝產(chǎn)物的多樣性分析

摘要：通過分析發(fā)酵對蘋果品質影響的內在機制，為蘋果功能成分及代謝調控機制提供科學依據(jù)，助力蘋果產(chǎn)業(yè)縱深發(fā)展。采用非靶向代謝組學技術分析了高溫高濕條件下蘋果加工過程產(chǎn)生的各類差異代謝化合物，分別使用主成分分析方法、聚類熱圖、偏最小二乘判別方法、KEGG 通路富集等對代謝組數(shù)據(jù)進行分析。結果表明，通過主成分分析（PCA）顯示了不同發(fā)酵過程中蘋果代謝組成的顯著階段性變化，代謝物質鑒定表明，存在334種代謝物，其中脂質和類脂分子所占比例最大，達到44.61%。利用聚類樹圖和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）揭示了在發(fā)酵末期蘋果樣本的代謝物水平明顯高于未發(fā)酵樣本，有效地區(qū)分了不同發(fā)酵階段的蘋果樣本。通過KEGG路徑分析進一步指出，蘋果的苯丙素生物合成和苯丙氨酸代謝途徑在發(fā)酵期間非常活躍，并且在高溫條件下激活了玉米素生物合成和鞘脂代謝的特定途徑，這對蘋果的高溫適應性和風味的形成具有重要影響。

關鍵詞：非靶向代謝組學；蘋果；高溫發(fā)酵；代謝途徑；代謝產(chǎn)物；多樣性；質量控制；風味形成

中圖分類號：S661.1；TS207.3 文獻標志碼：A 文章編號：2097-2172（2024）08-0711-13

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.08.005

Analysis of Metabolite Diversity in Apple Processing Based on High Temperature and High Humidity Conditions

SONG Juan 1， 2， KANG Sanjiang 1， ZHANG Haiyan 1， ZENG Chaozhen 1， YUAN Jing 1， MU Yuwen 1， GOU Lina 1

（1. Agricultural Product Storage and Processing Research Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China; 2. College of Food Science and Engineering， Gansu Agricultural University， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract： By analyzing the intrinsic mechanisms of how fermentation affects apple quality， this study provides a scientific basis for the functional components and metabolic regulation mechanisms of apples， supporting the in-depth development of the apple industry. In this research， non-targeted metabolomics technology was utilized to analyze the diverse differential metabolic compounds generated during the processing of apples under high temperature and high humidity conditions. Various methods such as principal component analysis（PCA）， cluster heat maps， partial least squares discriminant analysis（PLS-DA）， and KEGG pathway enrichment were utilized to evaluate the metabolomic data. PCA revealed significant stage-wise changes in the metabolic composition of apples during different fermentation processes. Metabolite identification indicated the presence of 314 metabolites， with lipids and lipid-like molecules accounting for the largest proportion， reaching 44.61%. Utilizing cluster dendrograms and orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLS-DA）， it was revealed that the metabolite levels in the apple samples at the end of fermentation were significantly higher than those in the unfermented samples， effectively distinguishing apple samples at different fermentation stages. Further， KEGG pathway analysis pointed out that the biosynthesis of phenylpropanoids and the metabolism of phenylalanine in apples were very active during fermentation， and specific pathways for the biosynthesis of cornoside and sphingolipid metabolism were activated under high temperature conditions， which have an important impact on the high-temperature adaptability and flavor formation of apples.

Key words： Non-targeted metabolomics; Apple; High-temperature fermentation; Metabolic pathway; Metabolic product; Diversity; Quality control; Flavor formation

蘋果作為一種全球性的水果，不僅種植遍布世界各地并深受消費者青睞，而且因其豐富的營養(yǎng)價值和在食品工業(yè)中的多樣化用途而備受重視。蘋果在貯藏和加工過程中，微生物發(fā)酵使蘋果經(jīng)歷復雜的代謝變化，涵蓋多個生物化學反應和路徑，對蘋果的質量、口感和風味提升起著決定性作用段［1 - 2 ］。非靶向代謝組學技術正日益成為揭示食品發(fā)酵過程中顯著變化的關鍵手段。該技術不僅顯著增強了食品發(fā)酵的效率與品質，而且在提升食品安全標準方面發(fā)揮了重要作用［3 ］。

目前，眾多學者采用一系列尖端分析技術，包括高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜-質譜聯(lián)用（GC-MS）以及液相色譜-質譜聯(lián)用（LC-MS）等，對食品發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進行深入的定性與定量分析，旨在揭示其內在特性和生物學功能［4 - 6 ］。在對食品發(fā)酵過程的研究主要集中在代謝物的分析和形成機理方面，Salazar-Orbea等［7 ］利用非靶向代謝組學技術，識別出在高溫加工過程中草莓的關鍵代謝標記物，包括丙氨酸、蝶酰谷氨酸、2-羥基-5-甲氧基苯甲酸以及2-羥基苯甲酸β-D-葡萄糖苷。Markkinen等［8 ］通過核磁共振代謝組學方法分析了植物乳桿菌對沙棘汁發(fā)酵過程中的46種代謝物的變化，在發(fā)酵的早期階段，L-蘋果酸、多種必需氨基酸和核苷類物質被大量利用，而糖類物質則主要在發(fā)酵末期被消耗。彭玉嬌等［9 ］運用液相色譜-質譜聯(lián)用技術（LC-MS）識別出6982種代謝物，其中7種黃酮類化合物和6種氨基酸及多肽類化合物對黑果枸杞與紅果枸杞的氨基酸代謝過程具有顯著影響。陳云麗等［10 ］采用廣泛靶向代謝組學技術分析了陳化7～11 a的廣陳皮中的化學成分變化，觀察到陳化時間對陳皮中黃酮類、萜類、氨基酸及其衍生物的含量有顯著的影響。然而，關于蘋果在高溫條件下發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物多樣性的系統(tǒng)分析仍相對缺乏，限制了對蘋果發(fā)酵機制的深入理解和產(chǎn)品品質的精準控制。

本研究通過建立蘋果高溫發(fā)酵過程中的代謝圖譜以揭示發(fā)酵對蘋果品質影響的內在機制；并綜合運用液相色譜-串聯(lián)質譜分析技術（LC-MS/MS）對蘋果在各個發(fā)酵階段的代謝物質進行細致的分析和持續(xù)監(jiān)控。利用主成分分析（PCA）、聚類分析和KEGG代謝途徑等復雜多元統(tǒng)計方法，準確地識別和定量評估蘋果在發(fā)酵過程中的關鍵代謝物。不僅增進了對蘋果在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物多樣性的理解，而且為蘋果的長期保鮮及加工利用提供了理論依據(jù)。這對于后期蘋果的開發(fā)利用和增強蘋果相關產(chǎn)品在市場中的競爭力，以及滿足消費者對高端蘋果產(chǎn)品的追求均具有極其重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試劑

供試蘋果品種為紅富士，由甘肅省靜寧縣靜寧蘋果試驗站提供。

蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉由國藥集團化學試劑有限公司提供，檸檬酸（色譜純）、3-辛醇（色譜純）由美國Sigma公司提供，葡萄糖、磷酸氫二鉀、醋酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、甲醇、乙腈、甲酸（色譜純）均由上海源葉生物科技有限公司提供。

MRS肉湯液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10 g，牛肉浸粉10 g，酵母浸粉5 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀2 g，醋酸鈉5 g，檸檬酸2 g，硫酸鎂0.1 g，硫酸錳0.05 g，吐溫801.0 g，pH 6.2±0.2（25 ℃），蒸餾水1 000 mL，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

DHG-9003電加熱恒溫干燥箱由上海景宏實驗室儀器有限公司提供，HH-2恒溫水浴鍋由赫維生物科技股份有限公司提供，AE1204J電子天平由上海研豐電子科技有限公司提供，UV-6100BS紫外可見分光光度計由上海子期實驗設備有限公司提供，Scientz-10ND原位普通型真空冷凍干燥機由寧波新芝凍干設備股份有限公司提供，TGL-22S高速冷凍離心機由上海錦玟儀器設備有限公司提供，ICS-3000離子色譜儀由美國Dionex公司提供，TSQ Quantum Access液相色譜-質譜聯(lián)用儀由美國Thermo Scientific公司提供。

1.3 測定方法

將供試紅富士蘋果隨機分為4組，分別為A組（對照組，未添加乳酸菌組）、B組（乳酸菌發(fā)酵前期，1～30 d）、C組（乳酸菌發(fā)酵中期，30～60 d）和D組（乳酸菌發(fā)酵末期，60～90 d）。對照組的前處理是蘋果未添加乳酸菌，處理組的前處理是蘋果經(jīng)過徹底清潔并添加活性乳酸菌，啟動24 ～48 h的基礎發(fā)酵過程?？刂茰囟葹?0～90 ℃、相對濕度維持在50%～90%的環(huán)境條件下蘋果按實驗設計持續(xù)發(fā)酵，分別提取各處理組蘋果樣品以進行分析研究。

1.3.1 樣本前處理 參照周春娜等［11 ］的方法，稍有改動。在對蘋果樣本進行質量評估時，確保取樣環(huán)境嚴格無菌，以消除樣本間可能的交叉污染。精確量取100 μL樣本通過冷凍干燥法或使用液氮迅速凍結，磨成細粉狀，用甲醇和乙腈的混合液（體積比例為1∶1）進行混合后放置于超聲波浴中持續(xù)震蕩30 min后，在4 ℃的條件下用高速離心機14 000 r/min處理10 min，利用0.22 μm孔徑的過濾膜進行過濾，將得到的清液放入旋轉蒸發(fā)器中，保留干燥的樣品供后續(xù)的液相色譜-串聯(lián)質譜分析（LC-MS/MS）使用。

1.3.2 QC制備 參照董春濤等［12 ］的方法，稍有改動。從各個樣本中提取10 μL稀釋液，將其混合以制備質量控制樣本（QC樣本）進行持續(xù)跟蹤和監(jiān)控分析，確保實驗過程中數(shù)據(jù)的一致性和可復制性。

1.3.3 色譜條件 參照Cortada-Garcia［13 ］、魏夢媛［14 ］的方法，稍有改動。使用Acquity UPLC BEH C18色譜柱（Waters Corporation，Milford，USA）進行液相色譜時，采用兩種流動相進行梯度洗脫。流動相A為含有0.1%甲酸的超純水，流動相B為含0.1%甲酸的乙腈。設置的梯度洗脫起始于95%的流動相A，持續(xù)5 min，隨后在10 min內過渡至40% A，并在接下來的5 min內進一步減少至5% A，最后在5 min內恢復至95% A并對色譜柱進行平衡。設定流速為0.4 mL/min，色譜柱的溫度控制在40 ℃，每次注入5 μL的樣品進行色譜分析。

1.3.4 質譜條件 使用Q-Exactive Orbitrap質譜儀（Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany）進行代謝物的精確檢測［15 - 16 ］。離子源（ESI）參數(shù)設置：噴霧電壓3.5 KV，輔助氣體溫度400 ℃，鞘氣的流速為52 Arb，輔助氣的流速為14 Arb，儀器掃描的質量范圍150～1 500 m/z，對每個檢測周期內最高豐度的離子進行5次的MS/MS掃描。

1.4 數(shù)據(jù)分析

代謝組學原始數(shù)據(jù)導入Proteowizard V3.0.8789軟件進行數(shù)據(jù)預處理，通過保留時間（RT）和 m/z數(shù)據(jù)識別不同離子，記錄每個離子峰強度并最終輸出分子量、保留時間（RT）、峰面積和鑒定結果等信息。利用t檢驗檢測兩組樣本之間代謝物豐度差異，使用 FDR 對p值進行多次校正（Benjamini-Hochberg）。利用主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）對代謝物進行多變量分析，得到每個代謝物的變量投影重要度值（VIP）。同時滿足篩選條件 BenjaminiHochberg 校正值p -value < 0.05、PLS-DA 變量投影重要度值（VIP）>1、物質倍數(shù)比值ratio≥2或者ratio≤1/2的代謝物被認為是顯著差異代謝物。采用KEGG Mapper對篩選出的顯著差異代謝物進行代謝通路分析。所有實驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 實驗質控

2.1.1 QC相關性分析 在代謝組學的研究領域中，使用質量控制樣本（簡稱QC樣本）不僅可以評估實驗過程的穩(wěn)定性以及儀器性能，還可以確保實驗的一致性和數(shù)據(jù)的可靠性。從高溫發(fā)酵處理對蘋果樣品QC相關性分析（圖1）可以看出，QC樣本QC-1、QC-2、QC-3的相關性分別為0.96、0.96、0.97，說明實驗采取的質量控制措施非常有效，保證了得到的數(shù)據(jù)真實可靠。

2.1.2 樣本總體PCA分析 采用主成分分析（PCA）研究蘋果在發(fā)酵周期不同階段的代謝特征，由高溫發(fā)酵處理對蘋果樣本總體PCA分析（封三圖2）可知，蘋果樣本在2個主成分上共解釋了72.4%的數(shù)據(jù)變異，表明PCA技術能夠有效揭示蘋果在發(fā)酵過程中的主要代謝變化。特別是未添加乳酸菌的高溫發(fā)酵（A組）與乳酸菌高溫發(fā)酵末期（D組）的蘋果之間分離度顯著提高，表明發(fā)酵過程中蘋果的代謝特性發(fā)生了顯著的變化。然而，乳酸菌高溫發(fā)酵前期（B組）和中期（C組）的樣本雖然在PCA圖上有區(qū)別，但這些區(qū)別比較微小。這可能表明在發(fā)酵的前中期階段，蘋果的代謝路徑變化不夠劇烈，或者變化程度還沒有達到在PCA圖上能夠清晰區(qū)分的水平。用于質量控制（QC）的樣本點聚集緊密，表明實驗操作的一致性。

2.2 代謝物鑒定分析

通過代謝物鑒定分析可以了解蘋果發(fā)酵過程中的生化反應和代謝途徑的變化。從高溫發(fā)酵處理對蘋果樣品的代謝物鑒定分析結果（封三圖3）可以看出，在高溫發(fā)酵條件下，蘋果樣本中檢測到的代謝物種類高達334種，覆蓋了蘋果中眾多的生物化學反應和代謝通道。在這些代謝物中，脂質和類脂物質占據(jù)了顯著的比例，達到44.61%，這些成分在蘋果的氧化和水解等關鍵反應中起著中心作用。苯丙素和聚酮類占比18.56%，主要包括黃酮和木質素等成分，對蘋果的色澤和香氣等感官品質有著重要影響。此外，有機含氧化合物和苯類化合物分別占11.98%和11.38%，這些物質在蘋果的抗氧化防御和植物保護方面發(fā)揮著關鍵作用。有機酸及其衍生物和雜環(huán)化合物均占比5.99%，它們對于維持生物體內的酸堿平衡和促進代謝反應的順利進行起著至關重要的作用。盡管生物堿、核苷及均相非金屬化合物的比例較小，分別為0.60%、0.30%，但它們在細胞內的信號傳遞和基因表達調控中扮演著關鍵角色。這些發(fā)現(xiàn)不僅在蘋果的研究中具有重要價值，而且與枸杞、鱖魚、桃紅葡萄酒等其他食品體系中的研究結果類似［9， 17 - 18 ］，進一步證實了代謝物在多種食品加工和質量控制中的普遍性和重要性。代謝物的這些功能對于提升食品的風味特性和營養(yǎng)價值起著核心作用。

2.3 兩兩比較分析

2.3.1 正交偏最小二乘判別分析 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）作為一種有效的監(jiān)督學習工具，在識別樣本間差異及驗證模型穩(wěn)定性方面展現(xiàn)出了顯著的優(yōu)勢。由高溫發(fā)酵處理對蘋果正交偏最小二乘判別分析（圖4）可知，未添加乳酸菌的高溫發(fā)酵蘋果（A組）與乳酸菌發(fā)酵不同階段的蘋果樣本（B組、C組、D組）之間存在顯著性差異（P < 0.05），表明了發(fā)酵過程對蘋果樣本的化學組成產(chǎn)生了顯著影響。這些樣本之間的差異貢獻率則體現(xiàn)了發(fā)酵過程中化學成分變化程度，其中A組與B組、C組、D組的差異貢獻率分別是64.1%、69.6%、81.8%；而從發(fā)酵前期（B組）到中期（C組），再到發(fā)酵末期（D組）的差異貢獻率分別增加至68.7%和77.4%，尤其是在乳酸菌發(fā)酵末期的樣本（D組）的差異貢獻率達到83.1%，表明在乳酸菌發(fā)酵的最后階段，蘋果的化學成分變化最為劇烈。這一發(fā)現(xiàn)與其他食品如陳皮、石榴汁、黑糯米酒、牛奶等研究所得結果相似［10， 19 - 21 ］，表明在食品發(fā)酵的末期可能形成了一些關鍵生物標志物，這些標志物在評價樣本的化學變異性中起了決定性的作用。

2.3.2 差異物質篩選 差異物質篩選作為一種強有力的可視化工具，有效地揭示了不同樣本間代謝物差異的數(shù)量。由高溫發(fā)酵處理對蘋果樣品差異物質篩選分析（圖5）可知，蘋果在不同發(fā)酵階段存在顯著的代謝物差異（P < 0.05）。特別是在未添加乳酸菌的高溫發(fā)酵階段（A組）與乳酸菌發(fā)酵前期階段（B組）的轉變期間，有242種代謝物表現(xiàn)出顯著變化。其中193種代謝物表達上調，49種代謝物表達下調，表明在發(fā)酵前期階段，代謝活動非?；钴S，新的代謝物產(chǎn)生很可能是微生物活動和酶促反應共同作用的結果。這一階段對于蘋果代謝途徑的轉換及其代謝物的多樣性顯得尤為關鍵。然而，在蘋果的發(fā)酵過程中，從乳酸菌發(fā)酵前期階段（B組）到中期階段（C組）的轉變，發(fā)酵中的代謝物種類和數(shù)量并未出現(xiàn)明顯的變化，表明蘋果在此發(fā)酵階段的代謝系統(tǒng)展現(xiàn)了一定的穩(wěn)定性。這可能是蘋果適應持續(xù)高溫環(huán)境的結果，同時也反映了代謝物可能在此階段繼續(xù)累積。當進入到乳酸菌發(fā)酵的末期階段（D組），差異代謝物的總數(shù)減少至125種，其中111種差異代謝物表達上調，14種差異代謝物表達下調，表明蘋果在發(fā)酵的末期階段的代謝活動開始趨于平穩(wěn)，代謝途徑和代謝物的組成可能已經(jīng)形成一種動態(tài)平衡。這一發(fā)現(xiàn)與咖啡、發(fā)酵糙米等研究的結果類似［22 - 23 ］，表明食品的代謝穩(wěn)定性及其累積可能與其處于高溫發(fā)酵條件時的生理調整有著密切關系。

2.3.3 差異物質聚類分析 差異物質聚類分析是一種揭示發(fā)酵過程中關鍵代謝物和生物途徑的重要工具。從高溫發(fā)酵處理對蘋果樣品代謝物差異物質聚類分析（封三圖6）可知，蘋果樣本在未添加乳酸菌（A）以及添加乳酸菌發(fā)酵前期（B）、發(fā)酵中期（C）和發(fā)酵末期（D）的代謝物表達量變化顯著（P <0.05），顏色從藍色漸變到紅色，形象地表現(xiàn)了隨著發(fā)酵進程的推移，代謝物表達量的顯著變化。特別是在乳酸菌發(fā)酵末期（D），樣本普遍呈現(xiàn)出濃烈的紅色，表明這一階段代謝活動的顯著增強。此外，聚類圖中發(fā)現(xiàn)未添加乳酸菌發(fā)酵的蘋果樣本（A1、A2、A3）在聚類中分布緊密，表明這些樣本的代謝物組成具有較高的一致性和穩(wěn)定性，主要由基礎代謝產(chǎn)物如糖和有機酸構成。乳酸菌發(fā)酵前期（B1、B2、B3）和中期樣本（C1、C2、C3）也形成了清晰的集群，表明代謝物在發(fā)酵過程中的動態(tài)變化，可能與代謝活動的增強或降低有關。然而，乳酸菌發(fā)酵末期樣本（D1、D2、D3）展現(xiàn)了一個獨立的分支，表明在發(fā)酵的最后階段，蘋果內部代謝物的組成變得更加多樣化和穩(wěn)定，這與板芪研究結果類似［24 ］，表明這些代謝物與可能對食品形成獨特的發(fā)酵風味起到關鍵作用。此外，圖中的質量控制樣本（QC）的集中分布進一步證實了實驗操作和分析的高度一致性，這對于確保研究結果的準確性和可靠性至關重要。

2.3.4 差異物質相關性分析 在研究蘋果發(fā)酵過程中代謝物關系的趨勢圖中，用灰色表示正相關性，即代謝物之間的協(xié)同作用；用黑色表示負相關性，反映了代謝物之間的抑制作用。由高溫發(fā)酵蘋果的差異物質相關性分析（圖7）可知，隨著蘋果從未添加乳酸菌發(fā)dPdkOblaIDe4N83ZoMf3pA==酵狀態(tài)到乳酸菌發(fā)酵各階段的轉變，代謝物間的相互作用也發(fā)生了顯著變化（P <0.05）。從未添加乳酸菌發(fā)酵狀態(tài)到乳酸菌發(fā)酵的早期階段（A-vs-B），觀察到多個代謝物間的正相關性顯著增強，表明在發(fā)酵前期，新的代謝途徑被激活，代謝活動開始加速。隨著乳酸菌發(fā)酵進入中期（A-vs-C）和末期（A-vs-D）時，這種正相關性進一步加強，達到頂峰，這可能與蘋果對高溫環(huán)境的響應以及代謝物的調整有關，反映了代謝過程中對環(huán)境變化的適應性。然而，隨著發(fā)酵過程的延長，負相關性有所減少，這可能與某些代謝通路的阻斷或者代謝物積累相關。從乳酸菌發(fā)酵前期到中期（B-vs-C），代謝物間的協(xié)作持續(xù)增強，而競爭關系逐步消退，顯示了代謝過程從競爭性向合作性轉變，表明代謝網(wǎng)絡在自我優(yōu)化以提高效率。當從乳酸菌發(fā)酵前期到末期（B-vs-D），雖然正相關性有所下降，負相關性可能略有上升。最終從乳酸菌發(fā)酵中期到末期（C-vs-D），代謝物間的正負相關性趨于平穩(wěn)，表明代謝路徑已經(jīng)成熟，代謝活動達到了一種穩(wěn)定狀態(tài)，這與脫水蘋果的研究結果類似［26 ］，顯示了代謝過程在長期發(fā)酵中的穩(wěn)定性。此外，研究中還識別出了一些在整個發(fā)酵過程中普遍存在的代謝物，如糠醇乙酸酯、草蒿素以及酪氨酸等，它們可能對蘋果發(fā)酵產(chǎn)品的整體品質有重要貢獻。同時，也發(fā)現(xiàn)了一些特定階段特有的代謝物，例如1，2-十七烷酰磷脂酰膽堿在乳酸菌發(fā)酵末期（A-vs-D）階段特有；而4-羥基香豆素和6-羥基麥角甾-4，22-二烯-3-酮分別在乳酸菌發(fā)酵中期到末期（C-vs-D）和乳酸菌發(fā)酵的早期（A-vs-B）階段特有；紅藻素 F的出現(xiàn)則在乳酸菌發(fā)酵的早期（A-vs-B）和乳酸菌發(fā)酵進入中期（A-vs-C）階段，這可能暗示了這些代謝物在特定發(fā)酵階段的生物學功能和重要性。

2.3.5 差異代謝物富集 通過全面分析蘋果在不同發(fā)酵階段的KEGG代謝路徑，揭示蘋果在發(fā)酵過程中顯著的代謝適應性和變化規(guī)律。由高溫發(fā)酵蘋果的差異代謝物富集分析（圖8）可知，在整個發(fā)酵過程中，蘋果通過激活或抑制特定的生物合成和代謝通路來應對環(huán)境的變化，尤其對高溫環(huán)境的適應和特殊風味的形成起到了關鍵作用。特別是苯丙素的合成路徑在發(fā)酵過程的多個階段都表現(xiàn)出高活性，說明它對蘋果的適應性至關重要。這一路徑不僅助于蘋果抵抗高溫壓力，還直接貢獻于其風味和香氣的形成。另一方面，苯丙氨酸的代謝涉及生成多種生物活性分子，進而促進蘋果風味的形成。在發(fā)酵的不同階段，還有其他幾個關鍵路徑顯示出活性變化。例如，代謝過程中甘油磷脂和輔酶的生物合成路徑保持活躍，這對于維護細胞結構的穩(wěn)定性和基本的代謝功能至關重要。此外，環(huán)境信息處理機制也顯示了蘋果能夠感知并響應發(fā)酵過程中的環(huán)境變化。和未添加乳酸菌的蘋果相比，乳酸菌發(fā)酵過程中特定的代謝路徑如玉米素生物合成在發(fā)酵前期（A-vs-B）和中期階段（A-vs-C）得到了激活，這可能與其在蘋果適應高溫環(huán)境緊密相關。同樣，鞘脂代謝路徑在乳酸菌發(fā)酵的末期階段（A-vs-D）特別活躍，表明它在細胞信號傳遞中可能發(fā)揮重要作用。在經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵前期轉變到中期階段（B-vs-C）時，特定的抗氧化化合物如芪類和二苯庚烷類的活性表現(xiàn)出明顯增強，表明這些成分可能在蘋果的防御體系中具有重要的保護功能。同時，嘌呤代謝路徑在乳酸菌發(fā)酵前期轉變到末期階段（B-vs-D）得到顯著提升，這關系到嘌呤類物質的生產(chǎn)與分解，推測與DNA的合成和能量轉換過程緊密相關。此外，丁酸代謝在乳酸菌發(fā)酵中期轉變到發(fā)酵末期階段（C-vs-D）也有明顯上升，這可能與DNA合成及細胞內信號的傳遞機制關聯(lián)。這些發(fā)現(xiàn)與其他發(fā)酵食品如發(fā)酵茶、發(fā)酵紅豆、刺梨汁、蘋果渣等的研究結果相似［26 - 29 ］，反映了某些代謝路徑在多種發(fā)酵食品間的一致特征，表明食品在不同生長環(huán)境中的適應性以及風味的多樣性。

3 結論與討論

為揭示發(fā)酵對蘋果品質影響的內在機制，為蘋果功能成分及代謝調控機制提供科學依據(jù)，本研究通過非靶向代謝組學技術，對高溫高濕條件下未添加乳酸菌的發(fā)酵蘋果（對照組）以及添加乳酸菌的發(fā)酵前期（1～30 d）、中期（30～60 d）和末期（60～90 d）的蘋果樣本在發(fā)酵過程產(chǎn)生的各類差異代謝化合物進行了深入的代謝途徑分析，通過精確的實驗設計與嚴格的質量監(jiān)控，保障了分析結果的準確性。利用主成分分析（PCA），揭示了蘋果在不同發(fā)酵階段的代謝活動存在顯著差異。通過代謝物的鑒定，發(fā)現(xiàn)在整個高溫高濕發(fā)酵過程中，共識別出334種代謝物，其中脂質和類脂分子子所占比例最大，占比高達44.61%。采用聚類熱圖和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）更進一步有效地區(qū)分了不同發(fā)酵階段的蘋果樣本和不同發(fā)酵階段間的顯著代謝差異，特別是在乳酸菌發(fā)酵的末期階段蘋果樣本的代謝物水平明顯高于未發(fā)酵樣本。通過KEGG代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)，苯丙素的生物合成和苯丙氨酸的代謝在蘋果的整個發(fā)酵過程中非?；钴S，并且在高溫條件下激活了玉米素生物合成和鞘脂代謝的特定途徑，推測與蘋果適應高溫環(huán)境以及最終產(chǎn)品的風味形成密切相關。特別指出，高溫發(fā)酵有助于激活特定的代謝途徑，如玉米素的生物合成及鞘脂的代謝，這可能與發(fā)酵過程中的高溫應激響應有關，這對蘋果的高溫適應性和風味的形成具有重要影響。本研究不僅拓展了對蘋果在高溫發(fā)酵過程中的代謝變化的理解，還提供了通過代謝工程優(yōu)化蘋果發(fā)酵產(chǎn)品品質和功能的理論依據(jù)。未來的研究將可能深入探討脂質代謝在蘋果發(fā)酵中的角色，以及如何通過調節(jié)這些關鍵代謝途徑以提升蘋果發(fā)酵產(chǎn)品的風味和營養(yǎng)價值。

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