6株多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定

摘要：畜禽是多殺性巴氏桿菌的帶菌者，當(dāng)外界環(huán)境因素發(fā)生劇變，機(jī)體抵抗力低下時(shí)，該菌即侵入體內(nèi)，發(fā)生內(nèi)源性傳染。也可由被污染的飲水，飼料、用具和外界環(huán)境經(jīng)消化道傳染，或由咳嗽、噴嚏排出的病原菌經(jīng)呼吸道傳染，以及經(jīng)損傷的皮膚黏膜而傳染。該病發(fā)生后，同種畜禽間能互相傳染，不同的畜禽種間亦可交叉感染。多殺性巴氏桿菌病分布廣泛，世界各地均有發(fā)生。目前，在我國(guó)多種家畜、家禽和野生動(dòng)物中均有多殺性巴氏桿菌病發(fā)生，給畜禽生產(chǎn)帶來很大的經(jīng)濟(jì)損失。

關(guān)鍵詞：巴氏桿菌；分離；試驗(yàn)

1 材料與方法

1.1 病料來源

2011年9月6日，揚(yáng)州地區(qū)送來1只1.5～2 kg重的麻鴨，飼養(yǎng)主共飼養(yǎng)了200只。根據(jù)病史及流行病學(xué)調(diào)查，該鴨群剛剛購(gòu)回7 d。臨床檢查及病理剖檢可見肝表面有漿液，黃色膠凍樣滲出物覆蓋，腸道黏連，腔內(nèi)有大量纖維素性黏連，心肌出血并有壞死。

2011年9月13日，泰州姜堰送來3只70日齡的鵝，飼養(yǎng)主共飼養(yǎng)1 600只，其中死亡10只。根據(jù)病史及流行病學(xué)調(diào)查，該鵝群于13日齡時(shí)注射新支二聯(lián)苗，未用藥物治療，病程約20 d，突然死亡。臨床檢查及病理剖檢可見心肌有許多出血點(diǎn)，肝臟表面有大量白色壞死點(diǎn)，胰臟有出血，十二指腸出血嚴(yán)重，其他腸段也有出血，喉頭支氣管環(huán)狀出血，脾臟腫大，部分腸段有出血性潰瘍，氣囊出血渾濁，肝臟、腺胃、肌胃均有出血。

2011年10月29日，泰州地區(qū)送來1只90日齡的邵鴨，飼養(yǎng)主共飼養(yǎng)5 200只，其中死亡3～5只。根據(jù)病史及流行病學(xué)調(diào)查，該鴨群中的病鴨，病程長(zhǎng)，呈零星死亡。臨床檢查及病理剖檢可見心肌嚴(yán)重出血，腸道嚴(yán)重出血并出現(xiàn)出血性潰瘍，肝臟密布白色壞死點(diǎn)，胰臟充血，肺部出血，腺胃出血。

2011年10月30日，送來2只3月齡的麻鴨，飼養(yǎng)主共飼養(yǎng)50只。根據(jù)病史及流行病學(xué)調(diào)查，該鴨群有鴨突然死亡，約每天1只。臨床檢查及病理剖檢可見心肌嚴(yán)重出血，漿膜出血，肝臟腫大，密布白色壞死點(diǎn)，腸道彌漫性壞死出血。

2012年1月9日，揚(yáng)州地區(qū)送來4只70日齡的麻鴨，飼養(yǎng)主共飼養(yǎng)2 800只，其中死亡200只。根據(jù)病史及流行病學(xué)調(diào)查，近10 d來相繼突然發(fā)病死亡，已用氟苯尼考、磺胺嘧啶等，未見顯效，40 d前曾注射禽流感苗。臨床檢查及病理剖檢可見心外膜、心肌點(diǎn)狀出血，肝臟腫大，密布白色壞死點(diǎn)，小腸彌漫性出血。

2012年2月8日，揚(yáng)州地區(qū)送來3只180日齡的鴨，飼養(yǎng)主共飼養(yǎng)1 900只，其中死亡3只。根據(jù)病史及流行病學(xué)調(diào)查，病情反復(fù)發(fā)生。臨床檢查及病理剖檢可見肝密布白色壞死點(diǎn)，心肌出血，腸道內(nèi)環(huán)狀壞死并出血，氣囊出血。

1.2 試驗(yàn)材料

培養(yǎng)基：普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂，血瓊脂培養(yǎng)基。購(gòu)自上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司，揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室自制。

染色液：革蘭氏染色液、美藍(lán)染色液。

生化發(fā)酵罐：鳥氨酸、阿拉伯糖、硫化氫、葡萄糖、果糖、乳糖、硝酸鹽、衛(wèi)矛醇、甘露醇、尿素、氨對(duì)、麥芽糖、甘露糖、木糖、賴氨酸、棉籽糖，共16種生化管。均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

藥敏試紙片：菌必治（30 μg/片）、諾氟沙星（10 μg/片）、美洛西林（30μg/片）、萘啶酸（30 μg/片）、復(fù)方新諾明（23.75/1.25 μg/片）、卡那霉素（30 μg/片）、丁胺卡那霉素（30 μg/片）、痢特靈（300 μg/片）、羅美沙星（10 μg/片）、多黏霉素B（300 U/片）、左氧氟沙星（5 μg/片）、氯霉素（30 μg/片）、慶大霉素（10 μg/片）、多西環(huán)素（30 μg/片）、鏈霉素（10 μg/片）等，一共15種。購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

陽(yáng)性血清：超級(jí)新生牛血清（Newborn Calf

Serum），購(gòu)自杭州賽樂生物科技有限公司。

試驗(yàn)動(dòng)物：ICR小鼠12只，來自揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心。

其他器材：接種環(huán)、超凈操作臺(tái)、生理鹽水、一次性滅菌注射器、生物顯微鏡、酒精燈、恒溫培養(yǎng)箱、酒精棉球等。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

將患病動(dòng)物解剖檢查，采集動(dòng)物的肝臟、脾臟等內(nèi)臟器官作為病料。在超凈操作臺(tái)中將鑷子用酒精燈燒燙滅菌，然后用該鑷子燙于病料表面，將病料表面的細(xì)菌殺死。然后用滅菌的剪刀在已經(jīng)被滅菌的部位剪一道小口子，接著將在火上烤過的接種環(huán)伸入剪開的部位采集細(xì)菌，使用分區(qū)劃線的方法接種于血清瓊脂培養(yǎng)基。分別采集6個(gè)區(qū)域的病料，接種于血清瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別標(biāo)記為0906、0913、1029、1030、0109、0208，放于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24 h，然后觀察[1]。

1.3.2 染色鏡檢

分離。將已經(jīng)培養(yǎng)出有細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基從溫箱取出，并取一塊干凈的載玻片于實(shí)驗(yàn)操作超凈臺(tái)上。用注射器抽取生理鹽水，并滴1滴于載玻片中央。然后用已經(jīng)在酒精燈上燒紅滅菌的接種環(huán)從培養(yǎng)基上挑取少量細(xì)菌，涂抹在載玻片中央的生理鹽水中，使接種環(huán)上的菌落在生理鹽水中分布均勻，涂成一均勻的薄層。

干燥固定。涂片最好在室溫下使其自然干燥或?qū)?biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)。

染色。在涂片薄膜上滴加1～2滴結(jié)晶紫染色液初染，約1～2 min，沖洗；然后使用1～2滴碘液進(jìn)行媒染，約1～2 min，沖洗；用95%的乙醇進(jìn)行脫色，約1 min，沖洗；最后用1～2滴復(fù)紅染色液進(jìn)行復(fù)染，約1～2 min，沖洗，干燥。

在顯微鏡下用1 000倍油鏡鏡檢。

1.3.3 生化試驗(yàn)

先準(zhǔn)備生化管6組，每組生化管包括鳥氨酸、阿拉伯糖、硫化氫、葡萄糖、果糖、乳糖、硝酸鹽、衛(wèi)矛醇、甘露醇、尿素、氨對(duì)、麥芽糖、甘露糖、木糖、賴氨酸、棉籽糖，共16種。將其打開，并將開頭端在火上烤過以便消毒。用一次性滅菌注射器于每根生化管中滴加2～3滴犢牛血清，然后用接種環(huán)將六組細(xì)菌分別接種入每一組生化管中，每根生化管口用小團(tuán)棉球堵口，防止其他細(xì)菌進(jìn)入生化管，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，觀察結(jié)果。

判定標(biāo)準(zhǔn)參照該生化管生產(chǎn)廠家給出的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.4 藥敏試驗(yàn)

采用紙片瓊脂擴(kuò)散法，首先用棉棒蘸取傳代血清瓊脂平板上的菌落涂布整個(gè)血清培養(yǎng)基表面，反復(fù)幾次，保證涂均勻。用無菌鑷子取藥敏紙片貼在平板表面，紙片一貼就不可再拿起。每個(gè)平板貼5張紙片，每張紙片間距不少于24 mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15 mm。在菌接種后15 min內(nèi)貼完紙片。將平板翻轉(zhuǎn)，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱，孵育18～24 h后取出，用尺測(cè)量抑菌圈直徑，從平板背面測(cè)量最接近的整數(shù)毫米數(shù)并記錄。抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)為限。有的菌株可出現(xiàn)蔓延生長(zhǎng)，進(jìn)入抑菌環(huán)，這些都不作為抑菌環(huán)的邊緣。藥敏紙片有菌必治、氟羅沙星、美洛西林、萘啶酸、復(fù)方新諾明、卡那霉素、丁胺卡那霉素、痢特靈、羅美沙星、多黏霉素B、左氧氟沙星、氯霉素、慶大霉素、強(qiáng)力多西環(huán)素、鏈霉素，一共15種。

操作方法和判定標(biāo)準(zhǔn)參照該公司操作方法與標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.5 致病性試驗(yàn)

將分離得到的多殺性巴氏桿菌菌株分別用生理鹽水稀釋。將每一株細(xì)菌分別以0.3 mL/只和0.1 mL/只腹腔注射于2只小鼠，總共接種12只小鼠。

觀察小鼠12 h后的狀況，并將其解剖，觀察它們的病理變化。

2 結(jié)果

2.1 涂片鏡檢結(jié)果

分離菌株在血瓊脂上生成灰白色，濕潤(rùn)而黏稠的菌落，不溶血。分離菌涂片經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢可見革蘭氏陰性的球桿菌，單個(gè)或成對(duì)，偶爾呈鏈狀或絲狀。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)微量生化發(fā)酵管試驗(yàn)結(jié)果（表1）可以看出這甘露糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、阿拉伯糖、甘露醇、尿素、硝酸鹽還原和鳥氨酸這9種生化管反應(yīng)為陽(yáng)性，棉籽糖、乳糖、木糖、衛(wèi)矛醇、硫化氫、賴氨酸和氨基酸對(duì)照這7種生化管反應(yīng)為陰性。因此這6株多殺性巴氏桿菌的菌株都基本符合巴氏桿菌的特征，包括顯微特點(diǎn)和生化特點(diǎn)等。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，多殺性巴氏桿菌對(duì)丁胺卡那霉素為高度敏感；菌必治、美洛西林、卡那霉素、痢特靈、多年霉素B、左氧氟沙星、氯霉素、慶大霉素等藥物為中度敏感，而對(duì)羅美沙星和多西環(huán)素為低度敏感，對(duì)氟羅沙星、萘啶酸、復(fù)方新諾明和鏈霉素耐藥。

2.4 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果見圖1。6組小鼠在接種后均表現(xiàn)出精神沉郁、食欲廢絕的癥狀。接種細(xì)菌的小鼠在12 h內(nèi)先后死亡，剖檢所見病理變化為呼吸道有出血點(diǎn)，消化道黏膜也有出血點(diǎn)，肝臟充血并且腫大，其表面和實(shí)質(zhì)內(nèi)都散布有針尖大小的灰白色或灰色的壞死點(diǎn)。解剖小鼠后，取病變臟器進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，并染色鏡檢，培養(yǎng)出來的細(xì)菌菌株的基本特征與所采集的6株多殺性巴氏桿菌菌株一致。在鏡下可見革蘭氏陰性球桿菌，美藍(lán)染色呈兩極濃染的小桿菌，血液培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，見有表面光滑、邊緣整齊的露珠狀小菌落，不溶血，與先前分離出來的6株多殺性巴氏桿菌的菌株一致。

3 討論

此次收集的病例均有胃腸道出血的特征，符合水禽類很多疾病的急性死亡的特點(diǎn)，無法只根據(jù)臨床剖檢，觀察病理變化就做出診斷。所以，進(jìn)行了病料的采集和細(xì)菌的分離培養(yǎng)，并且進(jìn)行了這些菌株的染色鏡檢，生化試驗(yàn)，從而根據(jù)菌株的微生物特點(diǎn)和生化特性，結(jié)合了臨床解剖，流行病學(xué)調(diào)查和病理癥狀，證實(shí)了這些病例均為多殺性巴氏桿菌感染，從而診斷這些禽病為巴氏桿菌病。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，多殺性巴氏桿菌對(duì)丁胺卡那霉素為高度敏感，故可用此藥對(duì)該病進(jìn)行治療；菌必治、美洛西林、卡那霉素、痢特靈、多年霉素B、左氧氟沙星、氯霉素、慶大霉素等藥物為中度敏感，而對(duì)羅美沙星和多西環(huán)素為低度敏感，對(duì)氟羅沙星、萘啶酸、復(fù)方新諾明和鏈霉素耐藥，治療效果不明顯。

給動(dòng)物接種的多殺性巴氏桿菌，導(dǎo)致小鼠在12 h內(nèi)相繼死亡，并且發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟出血、壞死，呼吸道和消化道都有出現(xiàn)出血點(diǎn)，而且可以在死亡的小鼠體內(nèi)分離得到多殺性巴氏桿菌，說明多殺性巴氏桿菌具有較強(qiáng)的致病性，可以導(dǎo)致動(dòng)物的急性死亡。因此可以判定，該病對(duì)動(dòng)物具有一定的危害性，在動(dòng)物與動(dòng)物之間具有較強(qiáng)的傳染性，會(huì)給畜禽生產(chǎn)帶來很大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，常用于防控禽類多殺性巴氏桿菌的疫苗主要有弱毒苗、滅活苗和亞單位疫苗等，對(duì)降低禽霍亂造成的損失有一定的作用，但因?yàn)槎鄽⑿园褪蠗U菌的血清型較多、交叉免疫力差、保護(hù)期短，導(dǎo)致疫苗的免疫效果不理想，使該病在禽類群體中仍然時(shí)有發(fā)生。也有很多禽類的養(yǎng)殖場(chǎng)未經(jīng)過巴氏桿菌疫苗的免疫，這也是該病發(fā)生的原因之一。近年來，禽霍亂出現(xiàn)了一些新的現(xiàn)象，如禽類多殺性巴氏桿菌與其他病原的混合感染現(xiàn)象較為普遍、抗生素濫用致使細(xì)菌的耐藥性越來越強(qiáng)，癥狀的非典型化等，給該病的防控帶來了新的難度。因此，當(dāng)禽類的養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)細(xì)菌性疾病時(shí)，應(yīng)該及時(shí)進(jìn)行細(xì)菌分離和藥敏試驗(yàn)，篩選高敏藥物，進(jìn)行針對(duì)性的治療，才能取得良好治療和防控效果。

參考文獻(xiàn)

[1] 楊寶鳳，鄒靈秀，李能章，等.6株牛源多殺性巴氏桿菌A型的分離鑒定及其部分生物學(xué)特性比較分析[C]//國(guó)家肉牛/牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疾病控制研究室.第四屆全國(guó)牛病防治及產(chǎn)業(yè)發(fā)展大會(huì)論文集.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院重慶市牧草與草食家畜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2012.