加州鱸p65基因克隆及表達(dá)分析

摘要 從加州鱸（Micropterus salmoides）腦組織中克隆獲得NF-κB家族中p65基因的編碼區(qū)序列，該基因cDNA全長(zhǎng)1 944 bp，ORF為1 899 bp，可編碼632個(gè)氨基酸。理論分子質(zhì)量為69.61 ku，理論等電點(diǎn)（PI）為5.66，通過(guò)生信學(xué)分析工具對(duì)p65基因蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)其蛋白功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示：該基因不含有信號(hào)肽序列，同時(shí)不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，但存在1個(gè)NF-κB家族保守的結(jié)構(gòu)域。多序列比對(duì)結(jié)果顯示，加州鱸（Micropterus salmoides）p65與小口黑鱸（Micropter us dolomieu）的相似度最高，達(dá)99.30%；構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，加州鱸（Micropterus salmoides）p65與小口黑鱸（Micropter us dolomieu）聚為一支。通過(guò)qRT-PCR結(jié)果表明，加州鱸p65基因在所取組織均有表達(dá)，在腦組織中表達(dá)量最高，其次是頭腎、胸腺和心臟，在脾臟組織中的表達(dá)量最低。

關(guān)鍵詞 加州鱸；p65；生物信息學(xué)；組織表達(dá)分析

中圖分類號(hào) S 917.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2024）16-0091-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.16.019

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Cloning and Expression Analysis of p65 Gene in Micropterus salmoides

QIU Jin-zhu， TANG Huai-qing， SONG Hai-xia et al

（Zhongshan Agricultural Product Quality and Safety Inspection Institute， Zhongshan， Guangdong 528400）

Abstract Cloning and obtaining the coding region sequence of the p65 gene in the NF-κ B family from the brain tissue of Micropterus salmoides， with a total cDNA length of 1 944 bp， the ORF is 1 899 bp and can encode 632 amino acids. The theoretical molecular weight is 69.61 ku， and the theoretical isoelectric point （PI） is 5.66. The protein structure of the p65 gene was analyzed using bioinformatics analysis tools， and its protein function was predicted.The results showed that the gene does not contain a signal peptide sequence and does not have a transmembrane domain， but there is a conserved domain in the NF-κ B family. The results of multiple sequence alignment show that the similarity between Micropterus salmoides p65 and Micropterus dolomieu is the highest， at 99.30%; constructing a phylogenetic tree， it was discovered that the Micropterus salmoides p65 and Micropterus dolomieu clustered together.The results of qRT PCR indicate that the Micropterus salmoides p65 gene is expressed in all selected tissues， with the highest expression level in brain tissue， followed by the head kidney， thymus， and heart， and the lowest expression level in spleen tissue.

Key words Micropterus salmoides;p65;Bioinformatics;Organizational expression analysis

基金項(xiàng)目 中山市2021年第二批社會(huì)公益與基礎(chǔ)研究項(xiàng)目“加州鱸虹彩病毒病發(fā)病規(guī)律與防控技術(shù)研究”（2021B2056）。

作者簡(jiǎn)介 丘金珠（1989—），女，廣東梅州人，工程師，碩士，從事水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害防治研究。

*通信作者，高級(jí)工程師，從事水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害防治研究。

收稿日期 2023-09-22

細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）是免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)中一種重要的調(diào)控蛋白，最初被發(fā)現(xiàn)能夠與免疫球蛋白κ基因上的增強(qiáng)子特定序列（GGGACTTTCC，κB序列）結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控B細(xì)胞內(nèi)κB輕鏈的表達(dá)^［1］。NF-κB家族由5個(gè)成員蛋白單體（p50、p52、p65 ［RelA］、Rel B和c-Rel）組成，均由N末端DNA結(jié)合域，即Rel同源結(jié)構(gòu)域（Rel homology domain，RHD）形成15種具有不同功能的同源或異源二聚體^［2-3］。有研究表明，NF-κB信號(hào)通路有2種途徑，其中經(jīng)典途徑是由病原體激活炎癥分子引發(fā)，而非經(jīng)典途徑是由細(xì)胞發(fā)育激活^［4］。通過(guò)NF-κB經(jīng)典途徑活化的產(chǎn)物多以p50和p65的異源二聚體出現(xiàn)^［5］。

以往研究發(fā)現(xiàn)，p65基因是NF-κB的一個(gè)亞單位，經(jīng)翻譯修飾后可以嚴(yán)格調(diào)控NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活，在炎癥反應(yīng)或經(jīng)由炎癥反應(yīng)引發(fā)的相關(guān)疾病發(fā)生期間起到調(diào)控作用^［6］。p65可以調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、iNOS、IFN-β和β-防御素等免疫相關(guān)基因的表達(dá)，作為經(jīng)典NF-κB家族的成員，p65也被認(rèn)為是病毒感染誘導(dǎo)的I型和III型IFN和促炎細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子^［7］。在Ouyang等^［2］研究表明，p65除了促炎免疫應(yīng)答之外，還在抗病毒和IFN應(yīng)答中起作用。還有研究表明，使p65的R30去甲基化后的精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶PRMT5在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥、增殖和分化中也起到關(guān)鍵作用^［8］。還有研究發(fā)現(xiàn)，在淡水和海洋生物中存在NF-κB途徑，其中圓尾鱟具有原始的NF-κB信號(hào)通路，該通路在調(diào)節(jié)關(guān)鍵免疫防御分子的表達(dá)中起著重要作用^［9］；鱖魚(yú)的NF-κB信號(hào)通路可能參與鱖魚(yú)抗病毒感染的免疫應(yīng)答^［10］。

加州鱸（Micropterus salmoides）原產(chǎn)于美國(guó)，中文學(xué)名大口黑鱸，自20世紀(jì)80年代引入我國(guó)后，因其生長(zhǎng)迅速，抗病力強(qiáng)，適溫性廣，肉質(zhì)鮮美，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高^［11］等特點(diǎn)，逐漸成為我國(guó)主要養(yǎng)殖品種之一。但由于養(yǎng)殖規(guī)模和密度的增加以及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，加州鱸養(yǎng)殖病害頻發(fā)，病原種類復(fù)雜多樣，涵蓋鰻弧菌、鰤?mèng)~諾卡氏菌、嗜水氣單胞菌等細(xì)菌類，虹彩病毒、彈狀病毒和雙RNA病毒等病毒類，以及主要由纖毛蟲(chóng)引起的寄生蟲(chóng)類疾病^［12］，一旦處理不及時(shí)，將會(huì)給加州鱸產(chǎn)業(yè)造成巨大影響。p65基因在不同物種上發(fā)揮的主要功能仍需探索，目前已在部分魚(yú)類中研究了p65基因，但p65基因在魚(yú)類免疫中的定位尚不明確。筆者克隆加州鱸p65基因開(kāi)放閱讀框（ORF），對(duì)其基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析其基因結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)其蛋白功能，檢測(cè)該基因在各組織的分布，以期為后續(xù)深入研究加州鱸p65基因提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從中山某養(yǎng)殖場(chǎng)采集的健康加州鱸［（200±10） g/尾］。所用常規(guī)試劑均從深圳市科普生物有限公司購(gòu)買(mǎi)；RNA提取及cDNA反轉(zhuǎn)試劑盒，DNA凝膠回收純化試劑盒和qPCR相關(guān)試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 加州鱸Total RNA的提取和cDNA的合成。

撈取暫養(yǎng)的健康加州鱸3尾，收集心臟、鰓、眼和肝臟等10 個(gè)器官的組織各10 ～ 20 mg，迅速放入裝有Trizol的無(wú)RNA酶管中，用已消毒DEPC水處理過(guò)的鋼柱打碎組織，然后置于-80 ℃保存。待樣品處理完畢后，取出冷凍保存的組織樣品，參照TransZol Up Plus RNA Kit 說(shuō)明書(shū)提取加州鱸總RNA，再參照北京全式金EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 加州鱸p65基因全長(zhǎng)的克隆。

根據(jù)NCBI上已知加州鱸基因組信息，設(shè)計(jì)克隆p65基因ORF序列的引物p65-F和p65-R（表1），隨后將PCR產(chǎn)物送至廣州生工測(cè)序。

1.2.3 加州鱸p65基因的生物信息學(xué)分析。

用生物學(xué)軟件對(duì)加州鱸p65測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列拼接，并將拼接結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。隨后利用生物信息學(xué)網(wǎng)站在線分析加州鱸p65氨基酸理化性質(zhì)分析、涉及的通路、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位，并構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)。在NCBI上下載與加州鱸p65氨基酸相似其他物種p65序列，利用生信分析軟件對(duì)這些氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化分析。

1.2.4 加州鱸p65基因的組織表達(dá)分析。

根據(jù)p65基因序列，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物pMs-p65-F和qMs-p65-R（表1），使用德國(guó)耶拿qTower3.0熒光定量?jī)x進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，分析p65基因在健康加州鱸各組織的特異性分布，qRT-PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)［1］研究方法。qRT-PCR以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因（表1），每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，試驗(yàn)結(jié)果采用2^-ΔΔCt法計(jì)算，用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 加州鱸p65基因的克隆

用p65-F、p65-R作為引物，加州鱸腦組織cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的產(chǎn)物測(cè)序后經(jīng)NCBI Blast分析判定該擴(kuò)增產(chǎn)物為加州鱸p65基因。ORF為1 899 bp，可編碼632個(gè)氨基酸（圖1）。

2.2 加州鱸p65的生物信息學(xué)分析

加州鱸p65基因編碼蛋白的理論分子質(zhì)量為69.61 ku，理論等電點(diǎn)（PI）為5.66，脂肪指數(shù)（aliphatic index）為64.53，不穩(wěn)定指數(shù)為45.54，總體平均親水性（GRAVY）為-0.616，屬于親水性蛋白（圖2）。

該蛋白主要存在于細(xì)胞膜表面，為胞外蛋白；不存在跨膜區(qū)（圖3），這與TMHMM Server 2.0 預(yù)測(cè)結(jié)果一致。該基因經(jīng)Signal P 4.1 Server預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，其不存在信號(hào)肽序列（圖4），為胞外蛋白。

蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)p65蛋白在細(xì)胞中各位置的分布概率：73.9%（細(xì)胞核）、17.4%（線粒體）、8.7%（細(xì)胞質(zhì)），Cell-PLoc對(duì)p65進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)的結(jié)果為細(xì)胞核。SoftBerry-Psite預(yù)測(cè)該序列功能位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)該序列N-糖基化位點(diǎn)9個(gè)和蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)8個(gè)，N-豆蔻?；稽c(diǎn)和C末端定位信號(hào)序列微體各6個(gè)，酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)5個(gè)，cAMP 和 cGMP相關(guān)磷酸化位點(diǎn)2個(gè)，CAAX box 2個(gè)，糖胺聚糖附著位點(diǎn)和NF-kb背側(cè)結(jié)構(gòu)域信號(hào)各1個(gè)。

通過(guò) SOPMA 分析加州鱸p65蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)無(wú)規(guī)則卷曲由394個(gè)氨基酸組成，占62.35%；α-螺旋由95個(gè)氨基酸組成，占15.03%；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)由20個(gè)氨基酸組成，占3.16%；延伸鏈由123個(gè)氨基酸組成，占19.46%（圖5）。利用 SWISS-MODLE 在線構(gòu)建蛋白質(zhì)3級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖6所示。

2.3 同源性及系統(tǒng)進(jìn)化

多序列比對(duì)結(jié)果顯示，加州鱸p65與小口黑鱸（Micropter us dolomieu）的相似度最高，達(dá)99.30%；與褐點(diǎn)石斑魚(yú)（Epinephelus fuscoguttatus）、蒼白矛吻蝠（Phyl-lostomus discolor）、鸮鸚鵡（Strigopshabroptila）、束帶蛇（Thamnophis elegans）的相似度分別是87.14%、72.84%、72.36%、70.14%（圖7），其中存在高度保守序列，如轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號(hào)序列。將NCBI上已知其他物種的p65基因和加州鱸p65基因，通過(guò)N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)加州鱸與小口黑鱸（Micropter us dolomieu）聚為一支（圖8），這與多序列比對(duì)結(jié)果相符。

2.4 加州鱸p65基因的組織分布

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測(cè)p65基因在加州鱸所有待測(cè)組織中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，該基因在各個(gè)組織中均能表達(dá)，但在腦組織中相對(duì)表達(dá)量最高，其次為頭腎、胸腺、心臟，在脾臟中相對(duì)表達(dá)量最低（圖9）。

3 討論

該研究克隆加州鱸p65基因ORF序列，全長(zhǎng)1 899 bp，編碼632個(gè)氨基酸。其蛋白不存在信號(hào)肽序列；其不穩(wěn)定指數(shù)超過(guò)40，屬于不穩(wěn)定蛋白；p65蛋白氨基酸序列親水性殘基多于疏水性殘基，表現(xiàn)為親水性，進(jìn)一步說(shuō)明p65屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白；p65蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲組成，占比超過(guò)60%，與蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示p65蛋白主要位于細(xì)胞核，在蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析中發(fā)現(xiàn)加州鱸p65不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，這也進(jìn)一步證實(shí)亞細(xì)胞定位的結(jié)果，說(shuō)明p65蛋白可能在細(xì)胞核中合成。在推定的加州鱸p65氨基酸序列中預(yù)測(cè)了24個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，可作為與IκBs進(jìn)行蛋白互作的結(jié)構(gòu)域?？傊瑢?duì)加州鱸p65蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析有利于揭示其可能參與的生物進(jìn)程，也為后續(xù)研究p65在加州鱸中的其他功能提供理論基礎(chǔ)。

將加州鱸p65核苷酸序列上傳NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示，加州鱸p65基因與硬骨魚(yú)類序列非常相似，與小口黑鱸相似度最高，高達(dá)99.30%；與哺乳類和爬行類相似度較低，分別為72.36%和70.14%，這可能是由于它們之間的進(jìn)化方向不同。構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明，加州鱸p65與M.dolomieu聚為一支，表明它們可能來(lái)源于一個(gè)祖先，且與BLAST結(jié)果相符，同時(shí)不同物種的p65氨基酸序列間都具有高度保守序列，說(shuō)明該基因在進(jìn)化過(guò)程中十分保守。綜合以上結(jié)果說(shuō)明，加州鱸p65與其他魚(yú)類p65蛋白在結(jié)構(gòu)上具有一定相似性，由此推測(cè)它們?cè)诠δ苌暇哂泄餐c(diǎn)。

近年來(lái)，p65已經(jīng)在多種魚(yú)類物種中被克隆和鑒定，如鱖魚(yú)（Siniperca chuatsi）^［10］、褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）^［13］、草魚(yú)（Ctenopharyngodon idella）^［14］、黃顙魚(yú)（Pelteobagrusfulvidraco）^［14］、鯉魚(yú)（Cyprinus carpio L.）^［15］、卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）^［16］和斜帶石斑魚(yú)（Epinephelus coioides）^［17］。最近，一項(xiàng)研究還報(bào)道了p65缺失的斑馬魚(yú)（Danio rerio）^［2］，與野生型斑馬魚(yú)相比，p65缺失的斑馬魚(yú)對(duì)病毒感染更加敏感，并表現(xiàn)出更高的致死率和更嚴(yán)重的病理癥狀，表明與p65相關(guān)的經(jīng)典NF-kB途徑不僅對(duì)促炎反應(yīng)重要，而且對(duì)與抗病毒免疫反應(yīng)來(lái)說(shuō)也是必不可少的。加州鱸p65組織定量分布結(jié)果顯示，該基因廣泛分布于各檢測(cè)組織中。其中p65在腦中表達(dá)量最高，頭腎、胸腺、心臟的表達(dá)量次之，脾臟的表達(dá)量最低。目前已報(bào)道的不同魚(yú)類的p65基因在各組織中的表達(dá)情況差異較大，金鯧魚(yú)^［16］p65在肝臟高水平表達(dá)，在腸、心臟和胃低表達(dá)，牙鲆^［13］ p65在腸、鰓和胃中高水平表達(dá)，在肝臟、眼、皮膚低表達(dá)，稀有鮈鯽^［18］ p65在肝臟中表達(dá)最高，在腎臟中表達(dá)最低。加州鱸的肝臟表達(dá)量較低與牙鲆相符，與稀有鮈鯽結(jié)果相反。目前p65在魚(yú)類中研究較少，已報(bào)道研究中魚(yú)類各組織表達(dá)量差異較大，難以進(jìn)行比較，探究p65在病毒感染中的作用需在后續(xù)試驗(yàn)中加以驗(yàn)證。

4 結(jié)論

該研究成功克隆加州鱸p65基因，該基因cDNA全長(zhǎng)1 944 bp，ORF為1 899 bp，可編碼632個(gè)氨基酸。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該基因不具有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，但存在一個(gè) NF-κB家族保守背側(cè)結(jié)構(gòu)域。熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，加州鱸p65在所測(cè)組織中均有表達(dá)，在腦、頭腎、胸腺、心臟中表達(dá)水平較高，在脾臟組織中的表達(dá)量最低。

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