• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)在植物與微生物互作中的研究進展

    2024-09-03 00:00:00潘麗英白琳琳周慶峰裴冬麗王文靜高航
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2024年16期

    摘要 外泌體內(nèi)含蛋白質(zhì)、核酸、脂類以及小分子化合物等多種生物信息分子,在植物與微生物互作過程中具有重要功能,是當(dāng)前植物與微生物互作研究的前沿?zé)狳c。作為多種生物信息分子的載體,外泌體的組成成分決定其功能。因此,通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析外泌體的蛋白組成有助于深入解析其在植物與微生物互作過程中的功能。系統(tǒng)總結(jié)了外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)在植物與真菌、細菌互作過程中的研究進展,重點闡述外泌體蛋白組成與植物抗病信號傳導(dǎo)及病原菌毒力的相關(guān)性,并在此基礎(chǔ)上提出外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展方向,為深入解析植物與微生物的互作機制提供借鑒。

    關(guān)鍵詞 外泌體;細胞外囊泡;植物免疫;蛋白質(zhì)組學(xué);病原菌

    中圖分類號 S 432.2+3 文獻標識碼 A

    文章編號 0517-6611(2024)16-0013-07

    doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2024.16.003

    開放科學(xué)(資源服務(wù))標識碼(OSID):

    Research Progress of Exosomal Proteomics in Plant-microbe Interactions

    PAN Li-ying,BAI Lin-lin,ZHOU Qing-feng et al

    (College of Biology and Food,Shangqiu Normal University/Henan Provincial Key University Laboratory of Plant-Microbe Interactions,Shangqiu,Henan 476000)

    Abstract Exosomes,a cutting-edge focal point in current research on plant-microbe interactions,are vesicles that encompass diverse biomolecular information including proteins,nucleic acids,lipids,and small molecules.They assume significant roles in the progression of plant-microbe interactions.The composition of exosomes plays a crucial role in determining their function as carriers of various biological information molecules.Therefore,the functional roles of exosomes in the interactions between plants and microorganisms can be revealed by analyzing their protein composition using proteomic techniques.This paper provides a comprehensive overview of the current research advancements in exosome proteomics within the context of plant-fungi and plant-bacteria interactions.The primary focus is on analCc76ydv4XxNdplO5GQbi9Xgb0A0tTfmFtVtM1MxP7+c=yzing the protein composition of exosome and exploring their significance in plant disease resistance signaling and pathogen virulence.Additionally,this article suggests potential future directions for the development of exosomal proteomics,with the aim of shedding light on the underlying mechanisms involved in plant-microorganism interactions.

    Key words Exosome;Extracellular vesicle;Plant immunity;Proteomics;Pathogen

    基金項目 河南省高等學(xué)校重點科研項目(23B210004)。

    作者簡介 潘麗英(1987—),女,河南商丘人,助理實驗師,碩士,從事植物與微生物互作機理研究。*通信作者,講師,博士,碩士生導(dǎo)師,從事植物與微生物互作機理研究。

    收稿日期 2023-12-27

    細胞外囊泡(extracellular vesicles)是細胞向外部環(huán)境分泌的脂雙層膜泡,在調(diào)控生長發(fā)育、免疫反應(yīng)、癌癥的發(fā)生發(fā)展以及病毒的轉(zhuǎn)移等過程中具有重要作用[1。細胞分泌3種不同類型的膜泡,包括凋亡小體、細胞微泡和外泌體(exosome)。外泌體是直徑30~150 nm的脂雙層膜泡,其內(nèi)含核酸、蛋白質(zhì)、脂類及小分子化合物等多種生物信息分子,在細胞間通信過程中具有重要功能[2-3。動物細胞分泌的外泌體能夠經(jīng)體液系統(tǒng)被臨近或遠端靶細胞攝取,向靶細胞傳遞生物信息分子,進而調(diào)控靶細胞的功能[4。最新的研究顯示,植物及植物源微生物也能夠分泌外泌體,這些外泌體介導(dǎo)生物信息分子在植物與微生物間的跨界傳遞,從而參與植物與微生物的互作過程5-9。微生物分泌的外泌體中包含多種microRNA、毒力蛋白和病原菌相關(guān)的分子基序(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),從而抑制或誘導(dǎo)植物的抗性[5,10-12。而植物分泌的外泌體能夠向微生物中轉(zhuǎn)運抗病蛋白及靶標微生物毒力基因的microRNA,進而抑制微生物的生長[6,8-9。蛋白質(zhì)是細胞功能的直接執(zhí)行者,在細胞生命活動過程中具有至關(guān)重要的作用。因此,通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析外泌體的蛋白組成有助于深入解析植物與微生物互作的分子機理。該研究系統(tǒng)總結(jié)了外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)在植物與真菌、細菌互作過程中的研究進展,包括植物外泌體的抗菌機制及介導(dǎo)抗病信號的傳導(dǎo)機制、真菌外泌體在真菌侵染植物過程中的功能,以及細菌外泌體激發(fā)植物先天性免疫機制等,以期為深入揭示外泌體在植物與微生物互作過程中的功能提供參考。

    1 外泌體分離技術(shù)

    1.1 植物外泌體的分離方法

    目前,提取植物外泌體使用最多的方法是超速離心法,其首要步驟是獲得高質(zhì)量的植物質(zhì)外體液[6-9,13。具體分離方法為:①將植物葉片浸入至滲透液中,抽真空至葉片呈浸潤狀,700 g離心分離植物質(zhì)外體液;②0.45 μm濾膜過濾去除細胞雜質(zhì)和大囊泡;③5 000、10 000 g差速離心進一步去除細胞碎片和雜質(zhì);④100 000 g超速離心沉淀外泌體(圖1)。所獲得的外泌體經(jīng)重懸后可進一步使用密度梯度離心純化。此外,He等[14使用免疫親和捕獲的方法純化出擬南芥富含四跨膜蛋白TET8的外泌體。此方法能夠獲得具有特定特征的外泌體亞類。在動物系統(tǒng),提取外泌體方法還有微流體分離、體積排阻色譜等[15。但目前尚未見使用此類方法分離植物外泌體的相關(guān)報道。

    1.2 微生物外泌體的分離方法

    與植物類似,超速離心法是分離細菌及真菌外泌體最常用的方法(圖1)。其具體分離方法為:①獲得細菌、真菌的培養(yǎng)液;②差速離心去除培養(yǎng)液中的雜質(zhì)及細胞碎片;③0.45 μm濾膜過濾進一步去除雜質(zhì)及大的胞外囊泡;④100 000~150 000 g超速離心沉淀外泌體。目前已使用超速離心法成功從多種細菌、真菌及卵菌中成功分離出外泌體(圖1)。此外,研究人員使用體積排阻色譜法從鐮刀菌培養(yǎng)液中提取出外泌體[16。而Rutter等[17通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)炭疽病菌分泌的外泌體被限制在細胞壁與細胞膜之間,僅能從炭疽病菌原生質(zhì)體的培養(yǎng)上清中分離到外泌體,說明少數(shù)真菌的細胞壁會阻礙外泌體的分泌。

    2 基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法

    傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究是采用雙向電泳根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點和分子量分離蛋白質(zhì),經(jīng)過圖像對比分析后采用質(zhì)譜鑒定差異點中的蛋白。由于雙向電泳技術(shù)具有通量低、分辨率低、重復(fù)性差等缺點[18,目前已逐漸被基于高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)所替代。隨著質(zhì)譜精度和掃描速度的提升,可對樣本中上萬個蛋白質(zhì)進行定性和定量分析[19。基于LC-MS/MS蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的核心流程為:①抽提樣本蛋白質(zhì);②采用蛋白酶將蛋白質(zhì)酶解為肽段;③使用高效液相色譜分離肽段,肽段經(jīng)離子化后進入質(zhì)譜;④通過一級和二級質(zhì)譜對肽段進行定性和定量;⑤檢索數(shù)據(jù)庫并進行生物信息學(xué)分析。根據(jù)檢測目的不同,蛋白質(zhì)組學(xué)可分為定性蛋白質(zhì)組學(xué)和相對定量蛋白質(zhì)組學(xué)。定性蛋白質(zhì)組學(xué)主要用于檢測樣品中的蛋白成分或含有某種翻譯后修飾蛋白質(zhì)的種類,而定量蛋白質(zhì)組學(xué)主要用于檢測蛋白質(zhì)含量或修飾蛋白質(zhì)的含量在不同樣本中的變化。與常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)不同,由于在總蛋白中含有某一特定修飾的蛋白質(zhì)所占比例較低,因此修飾蛋白質(zhì)組學(xué)需要從總肽段中富集目標修飾肽段。其基本原理為使用能夠特異吸附修飾肽段的材料富集修飾肽段。如采用含有陽離子親和吸附磷酸基團的 IMAC(Fe3+)技術(shù)富集磷酸化肽段,采用特異性抗體富集泛素化肽段、乙?;亩?、甲基化肽段,采用凝集素富集糖基化肽段等20。目前,常用的基于LC-MS/MS的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法有非標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)和標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)。

    非標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)是指每個樣品的肽段單獨上機,經(jīng)高效液相色譜分離、離子化后進入質(zhì)譜,通過肽段一級質(zhì)譜(MS1)的峰面積定量肽段,通過肽段的二級碎裂(MS2)模式定性肽段。通常采用數(shù)據(jù)依賴模式(DDA)采集肽段的MS2信息。在DDA模式下,質(zhì)譜僅能采集豐度較高肽段的MS2信息,而漏掉大量低豐度肽段的MS2信息。因此,基于DDA模式的非標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)穩(wěn)定性較差,數(shù)據(jù)量較小[21。目前幾乎所有的植物及植物源病原菌外泌體蛋白成分的鑒定均采用此方法(表1)。近年來隨著質(zhì)譜性能的提升,在數(shù)據(jù)非依賴模式(DIA)下采集肽段的MS2信息成為現(xiàn)實。在DIA模式下,質(zhì)譜能采集所有的MS2信息,極大提升了數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性及數(shù)據(jù)量[31。

    標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)是指采用含有不同報告基團的同位素標記不同樣品的肽段,通過質(zhì)譜對樣品中的肽段進行定性和定量分析。常用的商業(yè)化同位素標記試劑有ITRAQ、TMT和SILAC[32。其中ITRAQ和TMT試劑用于體外標記,即直接標記酶解后的肽段。而SILAC試劑主要用于體內(nèi)標記,即在細胞培養(yǎng)過程中將含有同位素標記的氨基酸加入培養(yǎng)基,通過細胞代謝將同位素標記的氨基酸引入新合成的蛋白質(zhì)中。ITRAQ和TMT試劑最多可同時標記8和16個樣品,而SILAC試劑最多可同時標記3個樣品。與非標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)相比,同位素標記蛋白質(zhì)組學(xué)有如下優(yōu)勢:①重現(xiàn)性好。不同樣品肽段被同位素標記后,質(zhì)譜可根據(jù)同位素的不同區(qū)分相同肽段屬于哪組樣品,因此可將同位素標記的不同樣本的肽段混合后通過一次上機試驗對所有樣本中的肽段進行定性和定量分析,避免由于質(zhì)譜的穩(wěn)定性所引入的誤差;②數(shù)據(jù)量大。將同位素標記的不同樣本肽段混合后可進行二維高效液相色譜分離,即首先根據(jù)肽段特性(如離子特性、pH等)將肽段分為不同組分,然后將不同組分分別進行LC-MS/MS分析。此方法能有效降低高豐度肽段對低豐度肽段檢測的干擾[33。然而,由于同位素標記技術(shù)需要較大的樣本量,目前尚未見采用此方法對植物及植物源病原菌外泌體進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析的相關(guān)報道。

    3 植物EVs蛋白質(zhì)組學(xué)與植物免疫

    3.1 植物外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)與植物抗病成分的跨界傳遞

    在植物與微生物互作過程中,核酸和蛋白質(zhì)等生物信息分子的跨界傳遞對于微生物的侵染及植物免疫至關(guān)重要。如病原菌向宿主細胞分泌效應(yīng)蛋白及毒力因子促進侵染,而植物細胞向病原菌分泌核酸、抗菌肽和抗病蛋白等抑制病原菌的生長。然而,這些生物信息分子通過植物或微生物細胞膜屏障的機制仍舊未知34。最新的研究結(jié)果顯示,外泌體在介導(dǎo)生物信息分子跨界傳遞的過程中具有重要作用[6,11。Regente等8通過蛋白質(zhì)組學(xué)在向日葵外泌體中鑒定到237個蛋白質(zhì)。除與糖酵解/三羧酸循環(huán)、囊泡運輸?shù)壬飳W(xué)過程相關(guān)的蛋白質(zhì)外,向日葵外泌體中還包含病程相關(guān)蛋白PR4(pathogenisis-related protein 4)、PR5、PR6、PR9、PR14等多種抗病相關(guān)的蛋白質(zhì)(圖2)。進一步將向日葵外泌體與核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)孢子孵育發(fā)現(xiàn)向日葵外泌體能被核盤菌孢子攝取,并抑制核盤菌孢子的生長,說明植物外泌體介導(dǎo)抗病蛋白質(zhì)由植物向真菌細胞的跨界傳遞。與蛋白質(zhì)的傳遞過程類似,研究人員發(fā)現(xiàn)擬南芥外泌體能將靶標真菌毒力基因的microRNA轉(zhuǎn)運至灰霉菌(Botrytis cinerea),從而抑制灰霉菌毒力基因的表達6。為探索外泌體裝載microRNA的機制,He等[14通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析了擬南芥外泌體的蛋白質(zhì)組成,挖掘出 Argonautes(AGOs)、RNA helicases(RHs)以及Annexins(ANNs)等多種RNA結(jié)合蛋白。進一步結(jié)合反向遺傳學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)AGO1、RH11和RH37向外泌體中裝載microRNA,說明外泌體蛋白質(zhì)同樣介導(dǎo)microRNA的跨界傳遞。

    此外,研究人員對外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示外泌體可能與植物的化學(xué)防衛(wèi)相關(guān)[9。芥子油苷是十字花科植物特有的次生代謝產(chǎn)物,其水解產(chǎn)物是多種細菌和真菌的天然毒素。早期的研究結(jié)果顯示,芥子油苷和其水解酶分別儲存在液泡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小體(ER body),病原菌的侵染導(dǎo)致芥子油苷和水解酶被釋放,進而發(fā)生反應(yīng)抑制病原菌的侵染。研究人員通過對擬南芥外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)擬南芥外泌體中包含芥子油苷水解酶Epithiospecific modifier 1、Myrosinase 1、Myrosinase 2以及芥子油苷轉(zhuǎn)運蛋白Pentacyclic triterpene synthase 3、PTR Family 2.10[9,22(圖2),說明植物外泌體可能參與芥子油苷的代謝及轉(zhuǎn)運,當(dāng)病原菌侵染植物后,芥子油苷被轉(zhuǎn)運至外泌體并被水解為毒素,進而經(jīng)外泌體被轉(zhuǎn)運至病原菌行使抑菌功能。

    3.2 植物外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)與PTI

    盡管目前對外泌體在植物與微生物互作過程中的功能研究已取得一定進展,但尚未見有關(guān)外泌體是否參與植物抗病信號傳導(dǎo)過程的相關(guān)報道。而對擬南芥、向日葵及煙草外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示,植物外泌體中裝載多種與先天性免疫信號傳導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì),說明植物外泌體極有可能介導(dǎo)抗病信號的傳導(dǎo)[8-9,14,22。當(dāng)病原菌侵染植物后,位于細胞膜上的模式識別受體(pattern-recognition receptors,PRRs)識別病原菌的PAMPs(pathogen-associated molecular patterns),進而激發(fā)植物的PTI(PAMP-triggered immunity)[35。PRRs主要包括類受體蛋白激酶(receptor-like kinases,RLKs)和類受體蛋白(receptor-like protein,RLPs)。其中RLKs包含胞外的一段能夠結(jié)合PAMPs的配體識別結(jié)構(gòu)域及胞內(nèi)的激酶結(jié)構(gòu)域,而RLPs僅含有胞外的配體識別結(jié)構(gòu)域[36-37。蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),植物外泌體中含有多種類型的PTI信號傳導(dǎo)相關(guān)蛋白[8-9,14,22(圖2):①類受體蛋白激酶(receptor-like kinases,RLKs),包括FLS2(flagellin-sensitive 2)、EFR(CEwulElQbu3wJFW/2kHkLw==EF-Tu receptor)、CERK1(chitin elicitor receptor kinase 1)、LYK4(LysM-containing receptor-like kinase 4)、LYK5、KIN7(kinase 7)、NILR2(nematode-induced LRR-RLK 2)等。RLKs主要介導(dǎo)PAMPs的識別,通過磷酸化向細胞內(nèi)部傳遞PTI信號。其中,F(xiàn)LS2、ERF、KIN7/NILR分別識別細菌的鞭毛蛋白、延伸因子EF-Tu以及脂多糖,LYK4/5和CERK1主要識別真菌的幾丁質(zhì)[36,38。②類受體蛋白(receptor-like protein,RLPs)RLP23 和RLP54。與RLKs類似,RLPs通過其胞外配體識別結(jié)構(gòu)域識別病原菌的PAMPs,介導(dǎo)PTI信號的傳導(dǎo)。③PTI共受體 BAK1(BRI-associated receptor kinase)、BKK1和適配蛋白SOBIR1(Suppressor of BIR1 1)。RLKs胞外配體識別結(jié)構(gòu)域識別PAMPs后會與BAK1和BKK1形成復(fù)合體,進而通過磷酸化級聯(lián)向細胞核傳遞PTI信號。而RLPs沒有胞內(nèi)的激酶結(jié)構(gòu)域,因此要先與適配蛋白SOBIR1結(jié)合后再與BAK1和BKK1形成復(fù)合體,進而傳遞PTI信號[36,39-40。④假激酶BRI1(Brassinosteroid insensitive 1)、BRI2和BRI3。在正常狀態(tài)下,BRI蛋白與BAK1互作,從而阻礙RLKs與BAK1形成復(fù)合體激活PTI。而RLKs/RLPs與PAMPs的識別會誘導(dǎo)BAK1從BIR-BAK1復(fù)合體中解聚,從而與RLKs/RLPs形成復(fù)合體進而激活PTI[41-42。以上蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果說明外泌體可能介導(dǎo)植物PTI信號的傳導(dǎo),即外泌體中的PTI相關(guān)激酶復(fù)合體識別病原菌的PAMPs后被激活,隨后外泌體被植物細胞攝取,向細胞核傳遞PTI信號。在哺乳動物系統(tǒng),細胞分泌的外泌體能夠經(jīng)體液系統(tǒng)長距離轉(zhuǎn)運,從而被遠端的靶細胞攝取,調(diào)控遠端靶細胞的功能[4。因此,植物外泌體可能作為PTI信號復(fù)合體的載體,介導(dǎo)PTI信號由病原菌侵染位點向臨近或遠端未被病原菌侵染細胞的傳導(dǎo)。

    3.3 植物外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)與DTI

    除PAMPs外,病原菌的侵染會導(dǎo)致植物細胞降解進而產(chǎn)生損傷相關(guān)的分子(damage-associated molecular patterns,DAMPs)。DAMPs能夠被位于細胞膜上的受體識別,激發(fā)植物的DTI(DAMP-triggered immunity,DTI)[43。PTI和DTI共同構(gòu)成植物抵抗病原菌侵染的第一道防線。DAMPs的產(chǎn)生依賴細胞壁的降解和修飾。研究人員通過蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)植物外泌體中含有大量的與細胞壁降解及修飾相關(guān)的酶[8-9,說明外泌體可能參與DAMPs的產(chǎn)生。此外,外泌體中還含有WAK1(Cell wall-associated kinase 1)、WAK2、THE1(Theseus 1)、MIK2(Mdis1-interacting receptor like kinase 2)以及PEPR1(Proline-rich extensin-like receptor kinase 1)等多種DAMPs受體蛋白[8-9,14,22(圖2),說明外泌體可能介導(dǎo)DTI的信號傳導(dǎo)。寡聚半乳糖醛酸(Oligogalacturonides,OGs)是病原菌侵染過程中細胞壁果膠解聚產(chǎn)生的DAMPs,在誘導(dǎo)植物防衛(wèi)響應(yīng)及調(diào)控植物發(fā)育方面具有重要功能[44-45。THE1和MIK2在介導(dǎo)未知細胞壁來源DAMPs的信號傳導(dǎo)方面具有重要功能[43,46-47。此外,在與病原菌互作過程中植物會產(chǎn)生一類由23~29個氨基酸組成的肽段類DAMPs (Pep),Pep能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生與PTI類似的抗性反應(yīng)。研究顯示,PEPR1是Pep的受體,在介導(dǎo)Pep誘導(dǎo)的抗性信號傳導(dǎo)過程中具有重要作用。

    3.4 植物外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)與ETI

    為克服PTI和DTI,病原菌向宿主細胞分泌多種效應(yīng)蛋白(effectors),這些效應(yīng)蛋白能抑制PTI系統(tǒng)關(guān)鍵信號蛋白的活性,進而抑制植物的PTI[48。而位于植物細胞內(nèi)部的NLRs能識別或感知效應(yīng)蛋白的活性,進而激發(fā)植物更加強烈的免疫反應(yīng),這一過程被稱為效應(yīng)因子激發(fā)的免疫(effector-triggered immunity,ETI)[49-50。Rutter等[9通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析在擬南芥外泌體中鑒定到598個蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示有11%的蛋白質(zhì)與植物脅迫響應(yīng)相關(guān)。其中包括RIN4(RPM1-interaction protein4)及其互作蛋白Atpases、Early-responsive to dehydration4、Remorin和Delta(24)-sterol reductase(圖2)。RIN4能夠被AvrB、AvrRpm1、和AvrRpt2等多種病原菌的效應(yīng)蛋白降解,其狀態(tài)的變化被宿主細胞內(nèi)的受體激酶RPS2感知后進一步激活鈣離子依賴的蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase,CDPKs),進而通過連續(xù)的蛋白磷酸化向細胞核傳遞ETI信號[36,51。而CDPK3和CDPK6同樣位于外泌體[9,14,22,說明植物外泌體可能介導(dǎo)植物ETI信號的傳導(dǎo)。

    3.5 植物外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)與SAR

    病原菌的侵染能激發(fā)植物的PTI、DTI和ETI。此外,在侵染位點能夠合成多種信號分子,這些信號分子能經(jīng)植物的韌皮部轉(zhuǎn)運至植物未被病原菌侵染的部位,并誘導(dǎo)這些部位產(chǎn)生對細菌、真菌及病毒的廣譜抗性,這一過程被稱為系統(tǒng)獲得抗性(systemic acquired resistance,SAR)[52。在哺乳動物系統(tǒng),外泌體可以進入體液系統(tǒng)進行長距離轉(zhuǎn)運,從而調(diào)控遠端靶細胞的功能。與此類似,研究者通過蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn),擬南芥外泌體中含有多種SAR相關(guān)的蛋白質(zhì),說明外泌體可能參與植物SAR長距離信號的轉(zhuǎn)運或SAR信號的擴增[1,9。盡管目前已發(fā)現(xiàn)的SAR長距離信號多為小分子代謝物,但有研究報道顯示部分蛋白質(zhì)能夠從病原菌侵染位點經(jīng)韌皮部進行長距離轉(zhuǎn)運,進而介導(dǎo)SAR長距離信號的傳導(dǎo)[53-55。Chanda等[56發(fā)現(xiàn),擬南芥脂轉(zhuǎn)運蛋白DIR1能經(jīng)植物的韌皮部進行長距離轉(zhuǎn)運,并且外源DIR1能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生SAR,說明DIR1介導(dǎo)SAR長距離信號的轉(zhuǎn)運。Carella等[57通過韌皮部蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定到多個與擬南芥SAR長距離信號傳導(dǎo)相關(guān)的移動蛋白,其中,CML27、MLP43、TRXh3等16個蛋白質(zhì)同樣存在于擬南芥外泌體蛋白質(zhì)組中[1,9,說明植物外泌體能夠經(jīng)植物的韌皮部長距離移動,進而介導(dǎo)蛋白類SAR長距離信號向系統(tǒng)性部位的轉(zhuǎn)運。

    3.6 植物外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)與ROS

    研究表明,活性氧(reactive oxygen species,ROS)在植物PTI、DTI、ETI以及SAR信號傳導(dǎo)過程中具有重要功能[43,52,58。一方面,活性氧介導(dǎo)PTI、DTI和ETI信號的傳導(dǎo);另一方面,活性氧參與SAR信號的擴增。近期,研究人員通過蛋白質(zhì)組學(xué)在植物外泌體中鑒定到多種與ROS信號的產(chǎn)生及傳導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì),包括Phospholipase Da、Annexin1、Ascorbate peroxidase 1、Glutathione S-transferase PHI2以及Respiratory burst oxidase homologue D(RBOHD)等[9。其中,NADPH氧化酶RBOHD在ROS的產(chǎn)生過程中具有至關(guān)重要的作用[59。RBOHD位于細胞膜,主要參與超氧負離子的形成。而超氧負離子能夠在超氧化物歧化酶的作用下進一步被催化為過氧化氫[60。因此,植物外泌體可能參與ROS的產(chǎn)生及其信號傳導(dǎo)過程。

    4 真菌外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)與真菌毒力

    在侵染過程中,真菌向宿主細胞分泌細胞壁水解酶和效應(yīng)蛋白以穿透植物細胞壁并抑制植物的免疫系統(tǒng)。大多數(shù)蛋白質(zhì)通過傳統(tǒng)的分泌途徑被釋放,即含有N端信號肽的蛋白質(zhì)經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、分泌囊泡、細胞膜途徑被分泌至細胞外。然而,研究人員對真菌外泌體進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),真菌外泌體中包含多種細胞壁水解酶和效應(yīng)蛋白[23-25,說明真菌外泌體與真菌的毒力相關(guān)。Silva等[23首次分離了植物源真菌鏈格孢菌的外泌體并鑒定了其蛋白組分,結(jié)果顯示,鏈格孢菌的外泌體中包含多種與宿主細胞黏附、細胞壁降解相關(guān)的蛋白質(zhì)。與此類似,小麥葉枯病菌及棉花枯萎病菌的外泌體同樣包含細胞壁水解酶、蛋白酶等毒力蛋白24-25。為探究真菌外泌體是否介導(dǎo)效應(yīng)蛋白的分泌,研究者通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析了鐮刀菌外泌體的蛋白成分,鑒定出NIS1-like、SnodProt1-like、LysM domain containing protein等多個效應(yīng)蛋白[26。進一步研究發(fā)現(xiàn),真菌外泌體能夠通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被植物細胞攝取27,說明外泌體介導(dǎo)毒力蛋白由真菌向宿主細胞的跨界傳遞,從而協(xié)助真菌侵染植物。為闡明外泌體毒力蛋白在真菌侵染植物過程中的功能,He等[11構(gòu)建了灰霉菌外泌體標志蛋白PLS1的突變體,通過分子生物學(xué)及生理學(xué)試驗發(fā)現(xiàn),pls1突變體對擬南芥的毒力降低;pls1突變體外泌體的釋放量降低;野生型灰霉菌的外泌體能夠恢復(fù)pls1突變體對擬南芥的毒力,說明真菌外泌體介導(dǎo)毒力蛋白質(zhì)的跨界傳遞,在真菌侵染植物過程中具有重要作用。

    5 細菌外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)與植物免疫

    與植物和真菌外泌體的分泌途徑不同,革蘭氏陰性菌具有外膜,能通過出芽的形式直接向外界環(huán)境分泌囊泡,因此也被稱為外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)[61。近年來,對丁香假單胞桿菌、黃龍病菌等細菌OMVs的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示,細菌OMVs中包含多種效應(yīng)蛋白、Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ型分泌系統(tǒng)組成蛋白、蛋白類PAMPs等[10,12,30,62-63,說明OMVs可能激發(fā)植物的PTI和ETI。研究人員通過分子生物學(xué)試驗證實黃單胞菌和丁香假單胞桿菌的OMVs能激發(fā)植物多種PTI和ETI相關(guān)基因的表達,增強植物對細菌和卵菌的抗性[5,64-66。然而,目前的研究主要集中在外源OMVs誘導(dǎo)植物抗病的機制,尚不清楚OMVs在植物與細菌互作過程中的功能。而蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示OMVs同樣包含脂酶、黏附素、蛋白酶及細胞壁裂解酶等多種決定細菌毒力的蛋白質(zhì)[10,說明在植物與細菌互作過程中OMVs可能與細菌的毒力相關(guān)。

    6 展望

    外泌體是近年來植物與微生物互作領(lǐng)域關(guān)注的焦點。盡管蛋白質(zhì)組學(xué)分析已為解析外泌體的蛋白組成及其在植物與微生物互作過程中的功能做出了巨大貢獻,但仍有諸多問題亟待解決。①目前檢測植物及植物病原菌外泌體蛋白成分的方法均是基于DDA模式的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),隨著質(zhì)譜精度和掃描速度的提升,使在DIA模式下分析外泌體的蛋白質(zhì)組成成為現(xiàn)實。與DDA檢測模式相比,基于DIA模式的檢測方法能夠極大提升外泌體中低豐度蛋白的檢出率。②在哺乳動物系統(tǒng),不同來源細胞或同一細胞在不同環(huán)境下所分泌外泌體的蛋白成分及功能不同。采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析不同狀態(tài)下細胞分泌外泌體的蛋白成分的差異有助于明確外泌體的生物學(xué)功能。然而目前有關(guān)植物及植物病原菌外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)均是定性分析,尚未見在互作狀態(tài)下檢測植物或植物病原菌分泌外泌體蛋白含量變化的報道。因此,使用定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析植物與病原菌互作狀態(tài)下外泌體蛋白成分的變化將有助于闡明植物與微生物的互作機制。③蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示植物外泌體中包含多種介導(dǎo)PTI、DTI和ETI信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵激酶,這些激酶的激活或者抑制受磷酸化、乙?;确g后修飾的調(diào)控。因此,通過修飾組學(xué)分析病原菌侵染前后植物外泌體蛋白質(zhì)翻譯后修飾的變化將有助于深入解析外泌體在植物免疫信號傳導(dǎo)過程中的功能。

    參考文獻

    [1] ZHOU Q,MA K,HU H,et al.Extracellular vesicles:Their functions in plant-pathogen interactions[J].Mol Plant Pathol,2022,23(6):760-771.

    [2] AKERS J C,GONDA D,KIM R,et al.Biogenesis of extracellular vesicles (EV):Exosomes,microvesicles,retrovirus-like vesicles,and apoptotic bodies[J].J Neuro Oncol,2013,113(1):1-11.

    [3] COLOMBO M,RAPOSO G,THéRY C.Biogenesis,secretion,and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles[J].Annu Rev Cell Dev Biol,2014,30:255-289.

    [4] RIDDER K,KELLER S,DAMS M,et al.Extracellular vesicle-mediated transfer of genetic information between the hematopoietic system and the brain in response to inflammation[J].PLoS Biol,2014,12(6):1-15.

    [5] BAHAR O,MORDUKHOVICH G,LUU D D,et al.Bacterial outer membrane vesicles induce plant immune responses[J].Mol Plant Microbe Interact,2016,29(5):374-384.

    [6] CAI Q,QIAO L,WANG M,et al.Plants send small RNAs in extracellular vesicles to fungal pathogen to silence virulence genes[J].Science,2018,360(6393):1126-1129.

    [7] REGENTE M,CORTI-MONZóN G,MALDONADO A M,et al.Vesicular fractions of sunflower apoplastic fluids are associated with potential exosome marker proteins[J].FEBS Lett,2009,583(20):3363-3366.

    [8] REGENTE M,PINEDO M,SAN C H,et al.Plant extracellular vesicles are incorporated by a fungal pathogen and inhibit its growth[J].J Exp Bot,2017,68(20):5485-5495.

    [9] RUTTER B D,INNES R W.Extracellular vesicles isolated from the leaf apoplast carry stress-response proteins[J].Plant Physiol,2017,173(1):728-741.

    [10] FEITOSA-JUNIOR O R,STEFANELLO E,ZAINI P A,et al.Proteomic and metabolomic analyses of Xylella fastidiosa OMV-enriched fractions reveal association with virulence factors and signaling molecules of the DSF family[J].Phytopathology,2019,109(8):1344-1353.

    [11] HE B Y,WANG H,LIU G S,et al.Fungal small RNAs ride in extracellular vesicles to enter plant cells through clathrin-mediated endocytosis[J].Nat Commun,2023,14(1):1-15.

    [12] HUANG Y X,ZHU F C,KOH J,et al.Proteomic and bioinformatic analyses of proteins in the outer membrane and extracellular compartments and outer membrane vesicles of Candidatus Liberibacter species[J].Front Microbiol,2022,13:1-15.

    [13] HUANG Y,WANG S,CAI Q,et al.Effective methods for isolation and purification of extracellular vesicles from plants[J].J Integr Plant Biol,2021,63(12):2020-2030.

    [14] HE B Y,CAI Q,QIAO L L,et al.RNA-binding proteins contribute to small RNA loading in plant extracellular vesicles[J].Nat Plants,2021,7(3):342-352.

    [15] KONOSHENKO M Y,LEKCHNOV E A,VLASSOV A V,et al.Isolation of extracellular vesicles:General methodologies and latest trends[J].Biomed Res Int,2018,2018:1-27.

    [16] GARCIA-CERON D,TRUONG T T,RATCLIFFE J,et al.Metabolomic analysis of extracellular vesicles from the cereal fungal pathogen Fusarium graminearum[J].J Fungi (Basel),2023,9(5):1-15.

    [17] RUTTER B D,CHU T T,DALLERY J F,et al.The development of extracellular vesicle markers for the fungal phytopathogen Colletotrichum higginsianum[J].J Extracell Vesicles,2022,11(5):1-23.

    [18] BJARNADóTTIR S G,HOLLUNG K,H?Y M,et al.Changes in protein abundance between tender and tough meat from bovine longissimus thoracis muscle assessed by isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation (iTRAQ) and 2-dimensional gel electrophoresis analysis[J].J Anim Sci,2012,90(6):2035-2043.

    [19] BASSAL M,ABUKHALAF M,MAJOVSKY P,et al.Reshaping of the Arabidopsis thaliana proteome landscape and co-regulation of proteins in development and immunity[J].Mol Plant,2020,13(12):1709-1732.

    [20] CHEN Y,WANG Y,YANG J,et al.Exploring the diversity of plant proteome[J].J Integr Plant Biol,2021,63(7):1197-1210.

    [21] MATROS A,KASPAR S,WITZEL K,et al.Recent progress in liquid chromatography-based separation and label-free quantitative plant proteomics[J].Phytochemistry,2011,72(10):963-974.

    [22] MOVAHED N,CABANILLAS D G,WAN J,et al.Turnip mosaic virus components are released into the extracellular spa0yF31hClvvRU+VliLUZPSdjf9xv2lacr1nMBzcca8nI=ce by vesicles in infected leaves[J].Plant Physiol,2019,180(3):1375-1388.

    [23] SILVA B M,PRADOS-ROSALES R,ESPADAS-MORENO J,et al.Characterization of Alternaria infectoria extracellular vesicles[J].Med Mycol,2014,52(2):202-210.

    [24] BLEACKLEY M R,SAMUEL M,GARCIA-CERON D,et al.Extracellular vesicles from the cotton pathogen Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum inducStWy7fxSsH76NgzCJmKuH3tM8Q7W7uOUVhGzS1GgMX0=e a phytotoxic response in plants[J].Front Plant Sci,2019,10:1-11.

    [25] HILL E H,SOLOMON P S.Extracellular vesicles from the apoplastic fungal wheat pathogen Zymoseptoria tritici[J].Fungal Biol Biotechnol,2020,7:1-14.

    [26] GARCIA-CERON D,LOWE R G T,MCKENNA J A,et al.Extracellular vesicles from Fusarium graminearum contain protein effectors expressed during infection of corn[J].J Fungi (Basel),2021,7(11):1-18.

    [27] DE VALLéE A,DUPUY J W,MORISCOT C,et al.Extracellular vesicles of the plant pathogen Botrytis cinerea[J].J Fungi (Basel),2023,9(4):1-23.

    [28] ZHU J Y,QIAO Q,SUN Y J,et al.Divergent sequences of tetraspanins enable plants to specifically recognize microbe-derived extracellular vesicles[J].Nat Commun,2023,14:1-14.

    [29] LI D Z,LI Z Q,WU J,et al.Analysis of outer membrane vesicles indicates that glycerophospholipid metabolism contributes to early symbiosis between sinorhizobium fredii HH103 and soybean[J].Mol Plant Microbe Interact,2022,35(4):311-322.

    [30] JANDA M,RYBAK K,KRASSINI L,et al.Biophysical and proteomic analyses of Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000 extracellular vesicles suggest adaptive functions during plant infection[J].mBio,2023,14(4):1-26.

    [31] HU A,NOBLE W S,WOLF-YADLIN A.Technical advances in proteomics:New developments in data-independent acquisition[J].F1000Res,2016,5:1-12.

    [32] DARVILLE L N,SOKOLOWSKI B H.Protein quantitation of the developing cochlea using mass spectrometry[J].Methods Mol Biol,2016,1427:135-148.

    [33] JAIN A,SINGH H B,DAS S.Deciphering plant-microbe crosstalk through proteomics studies[J].Microbiol Res,2021,242:1-11.

    [34] CAI Q,HE B,JIN H.A safe ride in extracellular vesicles-small RNA trafficking between plant hosts and pathogens[J].Curr Opin Plant Biol,2019,52:140-148.

    [35] YU X,F(xiàn)ENG B,HE P,et al.From chaos to harmony:Responses and signaling upon microbial pattern recognition[J].Annu Rev Phytopathol,2017,55:109-137.

    [36] YUAN M,NGOU B P M,DING P,et al.PTI-ETI crosstalk:An integrative view of plant immunity[J].Curr Opin Plant Biol,2021,62:1-11.

    [37] YUAN M H,JIANG Z Y,BI G Z,et al.Pattern-recognition receptors are required for NLR-mediated plant immunity[J].Nature,2021,592(7852):105-109.

    [38] BOUTROT F,ZIPFEL C.Function,discovery,and exploitation of plant pattern recognition receptors for broad-spectrum disease resistance[J].Annu Rev Phytopathol,2017,55:257-286.

    [39] ALBERT I,B?HM H,ALBERT M,et al.An RLP23-SOBIR1-BAK1 complex mediates NLP-triggered immunity[J].Nat Plants,2015,1:1-

    30.

    [40] LIEBRAND T W,VAN DEN BERG G C,ZHANG Z,et al.Receptor-like kinase SOBIR1/EVR interacts with receptor-like proteins in plant immunity against fungal infection[J].Proc Natl Acad Sci USA,2013,110(24):10010-10015.

    [41] HALTER T,IMKAMPE J,MAZZOTTA S,et al.The leucine-rich repeat receptor kinase BIR2 is a negative regulator of BAK1 in plant immunity[J].Curr Biol,2014,24(2):134-143.

    [42] SAIJO Y,LOO E P,YASUDA S.Pattern recognition receptors and signaling in plant-microbe interactions[J].Plant J,2018,93(4):592-613.

    [43] BACETE L,MéLIDA H,MIEDES E,et al.Plant cell wall-mediated immunity:Cell wall changes trigger disease resistance responses[J].Plant J,2018,93(4):614-636.

    [44] CASASOLI M,F(xiàn)EDERICI L,SPINELLI F,et al.Integration of evolutionary and desolvation energy analysis identifies functional sites in a plant immunity protein[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(18):7666-7671.

    [45] RIDLEY B L,O'NEILL M A,MOHNEN D.Pectins:Structure,biosynthesis,and oligogalacturonide-related signaling[J].Phytochemistry,2001,57(6):929-967.

    [46] HéMATY K,SADO P E,VAN TUINEN A,et al.A receptor-like kinase mediates the response of Arabidopsis cells to the inhibition of cellulose synthesis[J].Curr Biol,2007,17(11):922-931.

    [47] VAN DER DOES D,BOUTROT F,ENGELSDORF T,et al.The Arabidopsis leucine-rich repeat receptor kinase MIK2/LRR-KISS connects cell wall integrity sensing,root growth and response to abiotic and biotic stresses[J].PLoS Genet,2017,13(6):1-27.

    [48] YOON M,MIDDLEDITCH M J,RIKKERINK E H A.A conserved glutamate residue in RPM1-INTERACTING PROTEIN4 is ADP-ribosylated by the Pseudomonas effector AvrRpm2 to activate RPM1-mediated plant resistance[J].Plant Cell,2022,34(12):4950-4972.

    [49] LINDEBERG M,CUNNAC S,COLLMER A.Pseudomonas syringae type III effector repertoires:Last words in endless arguments[J].Trends Microbiol,2012,20(4):199-208.

    [50] VAN DER HOORN R A L,KAMOUN S.From Guard to Decoy:A new model for perception of plant pathogen effectors[J].Plant Cell,2008,20(8):2009-2017.

    [51] MACKEY D,HOLT B F III,WIIG A,et al.RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis[J].Cell,2002,108(6):743-754.

    [52] GAO H,GUO M J,SONG J B,et al.Signals in systemic acquired resistance of plants against microbial pathogens[J].Mol Biol Rep,2021,48(4):3747-3759.

    [53] CHAMPIGNY M J,ISAACS M,CARELLA P,et al.Long distance movement of DIR1 and investigation of the role of DIR1-like during systemic acquired resistance in Arabidopsis[J].Front Plant Sci,2013,4:1-20.

    [54] MALDONADO A M,DOERNER P,DIXON R A,et al.A putative lipid transfer protein involved in systemic resistance signalling in Arabidopsis[J].Nature,2002,419(6905):399-403.

    [55] YU K,SOARES J M,MANDAL M K,et al.A feedback regulatory loop between G3P and lipid transfer proteins DIR1 and AZI1 mediates azelaic-acid-induced systemic immunity[J].Cell Rep,2013,3(4):1266-1278.

    [56] CHANDA B,XIA Y,MANDAL M K,et al.Glycerol-3-phosphate is a critical mobile inducer of systemic immunity in plants[J].Nat Genet,2011,43(5):421-427.

    [57] CARELLA P,MERL-PHAM J,WILSON D C,et al.Comparative proteomics analysis of phloem exudates collected during the induction of systemic acquired resistance[J].Plant Physiol,2016,171(2):1495-1510.

    [58] WU B,QI F,LIANG Y.Fuels for ROS signaling in plant immunity[J].Trends Plant Sci,2023,28(10):1124-1131.

    [59] PETUTSCHNIG E,ANDERS J,STOLZE M,et al.EXTRA LARGE G-PROTEIN2 mediates cell death and hyperimmunity in the chitin elicitor receptor kinase 1-4 mutant[J].Plant Physiol,2022,189(4):2413-2431.

    [60] CHOUDHURY F K,RIVERO R M,BLUMWALD E,et al.Reactive oxygen species,abiotic stress and stress combination[J].Plant J,2017,90(5):856-867.

    [61] KULP A,KUEHN M J.Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles[J].Annu Rev Microbiol,2010,64:163-184.

    [62] CHOWDHURY C,JAGANNADHAM M V.Virulence factors are released in association with outer membrane vesicles of Pseudomonas syringae pv.tomato T1 during normal growth[J].Biochim Biophys Acta,2013,1834(1):231-239.

    [63] SIDHU V K,VORH?LTER F J,NIEHAUS K,et al.Analysis of outer membrane vesicle associated proteins isolated from the plant pathogenic bacterium Xanthomonas campestris pv.campestris[J].BMC Microbiol,2008,8:1-16.

    [64] CHALUPOWICZ L,MORDUKHOVICH G,ASSOLINE N,et al.Bacterial outer membrane vesicles induce a transcriptional shift in Arabidopsis towards immune system activation leading to suppression of pathogen growth in planta[J].J Extracell Vesicles,2023,12(1):1-17.

    [65] MCMILLAN H M,ZEBELL S G,RISTAINO J B,et al.Protective plant immune responses are elicited by bacterial outer membrane vesicles[J].Cell Rep,2021,34(3):1-21.

    [66] TRAN T M,CHNG C P,PU X M,et al.Potentiation of plant defense by bacterial outer membrane vesicles is mediated by membrane nanodomains[J].Plant Cell,2022,34(1):395-417.

    国产精品一区二区免费欧美| 成在线人永久免费视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 午夜免费鲁丝| 麻豆久久精品国产亚洲av| 在线永久观看黄色视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 在线av久久热| 女性被躁到高潮视频| 最好的美女福利视频网| 性色av乱码一区二区三区2| 免费在线观看成人毛片| 人人妻人人看人人澡| 国产高清视频在线播放一区| 成人亚洲精品一区在线观看| 在线看三级毛片| 精品高清国产在线一区| 老汉色∧v一级毛片| 精品乱码久久久久久99久播| 欧美色视频一区免费| 亚洲色图av天堂| 搡老岳熟女国产| 精品国产乱码久久久久久男人| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 亚洲全国av大片| 长腿黑丝高跟| 香蕉国产在线看| 观看免费一级毛片| 在线观看www视频免费| 久久天堂一区二区三区四区| 免费看十八禁软件| svipshipincom国产片| 成年版毛片免费区| 免费av毛片视频| 中亚洲国语对白在线视频| 国产日本99.免费观看| 热re99久久国产66热| 亚洲成人久久性| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 国产精品影院久久| 精品免费久久久久久久清纯| 狂野欧美激情性xxxx| 国产亚洲精品一区二区www| 99国产极品粉嫩在线观看| 视频区欧美日本亚洲| 久99久视频精品免费| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲真实伦在线观看| 嫩草影院精品99| 国产成人av教育| 热re99久久国产66热| 97碰自拍视频| 51午夜福利影视在线观看| 国内精品久久久久久久电影| 国产精品乱码一区二三区的特点| avwww免费| 夜夜爽天天搞| 国产av一区在线观看免费| 久热爱精品视频在线9| 少妇被粗大的猛进出69影院| 久久久久国内视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲精品国产区一区二| 在线天堂中文资源库| 真人一进一出gif抽搐免费| 两个人看的免费小视频| 不卡一级毛片| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 日韩精品中文字幕看吧| 欧美黑人精品巨大| 午夜福利在线观看吧| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产精品免费视频内射| 88av欧美| 久久这里只有精品19| 真人做人爱边吃奶动态| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 欧美乱码精品一区二区三区| 日本成人三级电影网站| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产单亲对白刺激| 国产亚洲av高清不卡| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 麻豆国产av国片精品| 可以在线观看毛片的网站| 欧美一区二区精品小视频在线| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 欧美中文日本在线观看视频| 欧美日韩精品网址| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 久9热在线精品视频| 国产1区2区3区精品| 男人舔女人的私密视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 免费在线观看亚洲国产| 国产激情偷乱视频一区二区| 不卡一级毛片| xxxwww97欧美| 久久久国产成人免费| 级片在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 级片在线观看| 久久青草综合色| 少妇 在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲av成人av| 国产精品久久视频播放| 91麻豆av在线| 人人妻人人看人人澡| 免费在线观看影片大全网站| 日韩欧美一区视频在线观看| 午夜a级毛片| av在线天堂中文字幕| 最近在线观看免费完整版| √禁漫天堂资源中文www| 国产亚洲精品一区二区www| 999久久久国产精品视频| 亚洲久久久国产精品| 日韩欧美免费精品| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 麻豆久久精品国产亚洲av| 久久国产乱子伦精品免费另类| 深夜精品福利| 亚洲一码二码三码区别大吗| 在线看三级毛片| 脱女人内裤的视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产av在哪里看| 99精品欧美一区二区三区四区| 日本a在线网址| 精品无人区乱码1区二区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 一二三四在线观看免费中文在| 午夜福利欧美成人| 亚洲av第一区精品v没综合| 成年免费大片在线观看| 午夜免费鲁丝| 手机成人av网站| 欧美激情 高清一区二区三区| 男人操女人黄网站| 岛国在线观看网站| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 亚洲成人国产一区在线观看| 日本一区二区免费在线视频| 婷婷精品国产亚洲av| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 桃色一区二区三区在线观看| 一级黄色大片毛片| 国产精品二区激情视频| www国产在线视频色| 麻豆成人av在线观看| 啦啦啦 在线观看视频| 最新在线观看一区二区三区| 精品不卡国产一区二区三区| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 久久午夜综合久久蜜桃| 美女大奶头视频| 久久久久九九精品影院| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久99热这里只有精品18| 久久精品成人免费网站| 啦啦啦韩国在线观看视频| 精品久久久久久,| 在线观看午夜福利视频| 成人永久免费在线观看视频| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲国产精品久久男人天堂| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产成人精品无人区| 淫妇啪啪啪对白视频| 午夜福利在线在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 精品国产国语对白av| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 欧美成狂野欧美在线观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产免费av片在线观看野外av| 免费在线观看黄色视频的| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 制服人妻中文乱码| 欧美在线黄色| 午夜免费激情av| 国产亚洲精品av在线| 国产精品久久久人人做人人爽| 日本一区二区免费在线视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品日韩av在线免费观看| 久久草成人影院| 国产99白浆流出| 国产亚洲精品久久久久5区| 91大片在线观看| www.自偷自拍.com| 欧美乱妇无乱码| 无限看片的www在线观看| 黄片小视频在线播放| 精品无人区乱码1区二区| 国产精品免费视频内射| 一夜夜www| 国内精品久久久久精免费| 亚洲第一av免费看| 国产麻豆成人av免费视频| 国产乱人伦免费视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久久国产成人精品二区| 在线观看www视频免费| 免费观看人在逋| 久久热在线av| 婷婷六月久久综合丁香| 少妇的丰满在线观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 精品免费久久久久久久清纯| 人人妻人人看人人澡| 一进一出好大好爽视频| 成人三级做爰电影| 神马国产精品三级电影在线观看 | 九色国产91popny在线| 久久人人精品亚洲av| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲一区中文字幕在线| 久久中文字幕一级| 啦啦啦韩国在线观看视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲一区高清亚洲精品| 韩国精品一区二区三区| 麻豆国产av国片精品| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| av有码第一页| 国内精品久久久久精免费| 国产一区在线观看成人免费| 午夜精品久久久久久毛片777| 白带黄色成豆腐渣| 丝袜美腿诱惑在线| 成人精品一区二区免费| 一二三四社区在线视频社区8| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产成人欧美| 亚洲黑人精品在线| 亚洲专区字幕在线| 露出奶头的视频| 亚洲第一电影网av| av在线播放免费不卡| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 免费搜索国产男女视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 老司机福利观看| 此物有八面人人有两片| 在线观看免费午夜福利视频| 999久久久精品免费观看国产| 成人午夜高清在线视频 | 国产精品久久久久久人妻精品电影| 午夜日韩欧美国产| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲美女黄片视频| bbb黄色大片| 日韩中文字幕欧美一区二区| 色精品久久人妻99蜜桃| 99国产精品一区二区三区| 久久精品影院6| 在线播放国产精品三级| 日本 av在线| 美女 人体艺术 gogo| 日本黄色视频三级网站网址| 这个男人来自地球电影免费观看| 757午夜福利合集在线观看| a级毛片a级免费在线| 人人澡人人妻人| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 极品教师在线免费播放| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 精品电影一区二区在线| 日韩欧美一区视频在线观看| 俺也久久电影网| www.熟女人妻精品国产| 国产精品一区二区精品视频观看| 欧美午夜高清在线| av超薄肉色丝袜交足视频| 日本一本二区三区精品| 不卡一级毛片| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 久久精品国产清高在天天线| 午夜福利在线观看吧| 国内精品久久久久精免费| 91字幕亚洲| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 我的亚洲天堂| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久香蕉精品热| 国产精品免费一区二区三区在线| 人人妻人人澡人人看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| cao死你这个sao货| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 听说在线观看完整版免费高清| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美午夜高清在线| 午夜久久久久精精品| 欧美黑人精品巨大| 日本三级黄在线观看| 欧美在线黄色| 色av中文字幕| 男女下面进入的视频免费午夜 | 日韩欧美国产一区二区入口| 久99久视频精品免费| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久精品成人免费网站| 国产亚洲av高清不卡| av超薄肉色丝袜交足视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久久精品欧美日韩精品| 精品久久久久久成人av| 亚洲电影在线观看av| 这个男人来自地球电影免费观看| 成人国产综合亚洲| 啪啪无遮挡十八禁网站| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人| www日本在线高清视频| 日韩欧美免费精品| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 叶爱在线成人免费视频播放| 看黄色毛片网站| 国产精品九九99| 看免费av毛片| 久久香蕉国产精品| 一级毛片高清免费大全| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲精品粉嫩美女一区| 真人做人爱边吃奶动态| 91成年电影在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 90打野战视频偷拍视频| 中文资源天堂在线| 日本免费a在线| 香蕉久久夜色| 亚洲av第一区精品v没综合| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 亚洲久久久国产精品| 最新美女视频免费是黄的| 久久亚洲精品不卡| 黄色丝袜av网址大全| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲国产精品久久男人天堂| 香蕉av资源在线| 正在播放国产对白刺激| 免费在线观看完整版高清| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 久久亚洲精品不卡| 日本在线视频免费播放| 国产精品,欧美在线| 日本在线视频免费播放| 免费电影在线观看免费观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产精品久久久av美女十八| 麻豆国产av国片精品| 久热爱精品视频在线9| 人成视频在线观看免费观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| cao死你这个sao货| 天天一区二区日本电影三级| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产av一区在线观看免费| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 欧美日韩一级在线毛片| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产成人影院久久av| 亚洲熟女毛片儿| 久久亚洲真实| 亚洲三区欧美一区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲精品国产区一区二| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产精品电影一区二区三区| 露出奶头的视频| 黑人操中国人逼视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 成人国产综合亚洲| 在线观看午夜福利视频| 亚洲精品国产区一区二| 国产国语露脸激情在线看| www.自偷自拍.com| 在线av久久热| 亚洲片人在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| АⅤ资源中文在线天堂| 午夜日韩欧美国产| 一夜夜www| 婷婷亚洲欧美| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲成人久久性| 女警被强在线播放| 色在线成人网| 午夜久久久在线观看| 久久狼人影院| 最新美女视频免费是黄的| 欧美黑人欧美精品刺激| 一级毛片高清免费大全| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 可以在线观看毛片的网站| 亚洲自拍偷在线| 最好的美女福利视频网| av有码第一页| 黄片播放在线免费| 久久狼人影院| 在线观看午夜福利视频| 757午夜福利合集在线观看| 久久久国产精品麻豆| 国产激情欧美一区二区| 欧美黑人精品巨大| 午夜福利在线观看吧| 99国产精品一区二区三区| 女性生殖器流出的白浆| 国产激情久久老熟女| ponron亚洲| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 国产片内射在线| 免费看a级黄色片| 日本一区二区免费在线视频| 一区二区三区激情视频| 国产高清有码在线观看视频 | 国产片内射在线| 精品国产一区二区三区四区第35| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产精品 国内视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 露出奶头的视频| 免费在线观看日本一区| 国产精品,欧美在线| 国产成人啪精品午夜网站| 日韩成人在线观看一区二区三区| 免费在线观看成人毛片| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲五月色婷婷综合| 日韩av在线大香蕉| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 精品国产乱码久久久久久男人| 一本综合久久免费| 99re在线观看精品视频| av片东京热男人的天堂| 大型黄色视频在线免费观看| 精品欧美国产一区二区三| 麻豆成人av在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 韩国av一区二区三区四区| 女性生殖器流出的白浆| 99精品在免费线老司机午夜| 日韩欧美三级三区| 色尼玛亚洲综合影院| 一a级毛片在线观看| 中出人妻视频一区二区| 国产野战对白在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 午夜福利高清视频| 一级作爱视频免费观看| 国产一区二区三区视频了| 一本久久中文字幕| 亚洲三区欧美一区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 身体一侧抽搐| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产爱豆传媒在线观看 | 757午夜福利合集在线观看| 99riav亚洲国产免费| 亚洲专区中文字幕在线| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲av美国av| 色综合婷婷激情| 欧美在线一区亚洲| 免费在线观看影片大全网站| www国产在线视频色| 1024香蕉在线观看| 午夜日韩欧美国产| 最近最新免费中文字幕在线| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| www.999成人在线观看| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 超碰成人久久| 成人手机av| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 正在播放国产对白刺激| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 欧美成人午夜精品| 国产国语露脸激情在线看| 精品国产一区二区三区四区第35| 精品国产乱子伦一区二区三区| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 中文亚洲av片在线观看爽| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产av一区二区精品久久| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 亚洲av日韩精品久久久久久密| 日韩精品中文字幕看吧| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 在线视频色国产色| 中文在线观看免费www的网站 | 亚洲免费av在线视频| 一进一出好大好爽视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 免费人成视频x8x8入口观看| 不卡一级毛片| 首页视频小说图片口味搜索| 黄片小视频在线播放| 香蕉久久夜色| 在线观看午夜福利视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 1024手机看黄色片| 亚洲自拍偷在线| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 久久久水蜜桃国产精品网| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 美女国产高潮福利片在线看| 99在线视频只有这里精品首页| 国产又爽黄色视频| 看免费av毛片| 人成视频在线观看免费观看| 91字幕亚洲| 日本在线视频免费播放| 一个人免费在线观看的高清视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 无人区码免费观看不卡| 丰满的人妻完整版| 中文资源天堂在线| 久久性视频一级片| 成人三级黄色视频| 国产99久久九九免费精品| 性色av乱码一区二区三区2| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲久久久国产精品| www日本在线高清视频| 一级作爱视频免费观看| 亚洲片人在线观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 又大又爽又粗| 久久国产乱子伦精品免费另类| 黄色a级毛片大全视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 999精品在线视频| 色av中文字幕| videosex国产| 国产视频一区二区在线看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 天堂动漫精品| 激情在线观看视频在线高清| 三级毛片av免费| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲成国产人片在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 激情在线观看视频在线高清| 午夜老司机福利片| 免费电影在线观看免费观看| 搞女人的毛片| 精品熟女少妇八av免费久了| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲一区二区三区不卡视频| 欧美色视频一区免费| 一区福利在线观看| 亚洲午夜理论影院| 国产亚洲av嫩草精品影院| 啦啦啦免费观看视频1| 久久 成人 亚洲| 久久久久国内视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 我的亚洲天堂| 日日干狠狠操夜夜爽| 在线观看www视频免费| 精品日产1卡2卡| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲色图av天堂| av片东京热男人的天堂| 十八禁网站免费在线| 国语自产精品视频在线第100页| 三级毛片av免费| 在线免费观看的www视频| www日本在线高清视频| 热99re8久久精品国产| 日韩欧美三级三区| 757午夜福利合集在线观看| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲男人天堂网一区| 欧美不卡视频在线免费观看 | 亚洲一区二区三区不卡视频| 久9热在线精品视频| 国产免费av片在线观看野外av| 成人永久免费在线观看视频| 在线观看日韩欧美| 午夜免费观看网址| 少妇熟女aⅴ在线视频| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲久久久国产精品| 黄色成人免费大全| av片东京热男人的天堂|