外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)在植物與微生物互作中的研究進展

摘要 外泌體內(nèi)含蛋白質(zhì)、核酸、脂類以及小分子化合物等多種生物信息分子，在植物與微生物互作過程中具有重要功能，是當(dāng)前植物與微生物互作研究的前沿?zé)狳c。作為多種生物信息分子的載體，外泌體的組成成分決定其功能。因此，通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析外泌體的蛋白組成有助于深入解析其在植物與微生物互作過程中的功能。系統(tǒng)總結(jié)了外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)在植物與真菌、細菌互作過程中的研究進展，重點闡述外泌體蛋白組成與植物抗病信號傳導(dǎo)及病原菌毒力的相關(guān)性，并在此基礎(chǔ)上提出外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展方向，為深入解析植物與微生物的互作機制提供借鑒。

關(guān)鍵詞 外泌體；細胞外囊泡；植物免疫；蛋白質(zhì)組學(xué)；病原菌

中圖分類號 S 432.2⁺3 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）16-0013-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.16.003

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Research Progress of Exosomal Proteomics in Plant-microbe Interactions

PAN Li-ying，BAI Lin-lin，ZHOU Qing-feng et al

（College of Biology and Food，Shangqiu Normal University/Henan Provincial Key University Laboratory of Plant-Microbe Interactions，Shangqiu，Henan 476000）

Abstract Exosomes，a cutting-edge focal point in current research on plant-microbe interactions，are vesicles that encompass diverse biomolecular information including proteins，nucleic acids，lipids，and small molecules.They assume significant roles in the progression of plant-microbe interactions.The composition of exosomes plays a crucial role in determining their function as carriers of various biological information molecules.Therefore，the functional roles of exosomes in the interactions between plants and microorganisms can be revealed by analyzing their protein composition using proteomic techniques.This paper provides a comprehensive overview of the current research advancements in exosome proteomics within the context of plant-fungi and plant-bacteria interactions.The primary focus is on analCc76ydv4XxNdplO5GQbi9Xgb0A0tTfmFtVtM1MxP7+c=yzing the protein composition of exosome and exploring their significance in plant disease resistance signaling and pathogen virulence.Additionally，this article suggests potential future directions for the development of exosomal proteomics，with the aim of shedding light on the underlying mechanisms involved in plant-microorganism interactions.

Key words Exosome;Extracellular vesicle;Plant immunity;Proteomics;Pathogen

基金項目 河南省高等學(xué)校重點科研項目（23B210004）。

作者簡介 潘麗英（1987—），女，河南商丘人，助理實驗師，碩士，從事植物與微生物互作機理研究。*通信作者，講師，博士，碩士生導(dǎo)師，從事植物與微生物互作機理研究。

收稿日期 2023-12-27

細胞外囊泡（extracellular vesicles）是細胞向外部環(huán)境分泌的脂雙層膜泡，在調(diào)控生長發(fā)育、免疫反應(yīng)、癌癥的發(fā)生發(fā)展以及病毒的轉(zhuǎn)移等過程中具有重要作用^［1］。細胞分泌3種不同類型的膜泡，包括凋亡小體、細胞微泡和外泌體（exosome）。外泌體是直徑30～150 nm的脂雙層膜泡，其內(nèi)含核酸、蛋白質(zhì)、脂類及小分子化合物等多種生物信息分子，在細胞間通信過程中具有重要功能^［2-3］。動物細胞分泌的外泌體能夠經(jīng)體液系統(tǒng)被臨近或遠端靶細胞攝取，向靶細胞傳遞生物信息分子，進而調(diào)控靶細胞的功能^［4］。最新的研究顯示，植物及植物源微生物也能夠分泌外泌體，這些外泌體介導(dǎo)生物信息分子在植物與微生物間的跨界傳遞，從而參與植物與微生物的互作過程^［5-9］。微生物分泌的外泌體中包含多種microRNA、毒力蛋白和病原菌相關(guān)的分子基序（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），從而抑制或誘導(dǎo)植物的抗性^{［5，10-12］}。而植物分泌的外泌體能夠向微生物中轉(zhuǎn)運抗病蛋白及靶標微生物毒力基因的microRNA，進而抑制微生物的生長^{［6，8-9］}。蛋白質(zhì)是細胞功能的直接執(zhí)行者，在細胞生命活動過程中具有至關(guān)重要的作用。因此，通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析外泌體的蛋白組成有助于深入解析植物與微生物互作的分子機理。該研究系統(tǒng)總結(jié)了外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)在植物與真菌、細菌互作過程中的研究進展，包括植物外泌體的抗菌機制及介導(dǎo)抗病信號的傳導(dǎo)機制、真菌外泌體在真菌侵染植物過程中的功能，以及細菌外泌體激發(fā)植物先天性免疫機制等，以期為深入揭示外泌體在植物與微生物互作過程中的功能提供參考。

1 外泌體分離技術(shù)

1.1 植物外泌體的分離方法

目前，提取植物外泌體使用最多的方法是超速離心法，其首要步驟是獲得高質(zhì)量的植物質(zhì)外體液^{［6-9，13］}。具體分離方法為：①將植物葉片浸入至滲透液中，抽真空至葉片呈浸潤狀，700 g離心分離植物質(zhì)外體液；②0.45 μm濾膜過濾去除細胞雜質(zhì)和大囊泡；③5 000、10 000 g差速離心進一步去除細胞碎片和雜質(zhì)；④100 000 g超速離心沉淀外泌體（圖1）。所獲得的外泌體經(jīng)重懸后可進一步使用密度梯度離心純化。此外，He等^［14］使用免疫親和捕獲的方法純化出擬南芥富含四跨膜蛋白TET8的外泌體。此方法能夠獲得具有特定特征的外泌體亞類。在動物系統(tǒng)，提取外泌體方法還有微流體分離、體積排阻色譜等^［15］。但目前尚未見使用此類方法分離植物外泌體的相關(guān)報道。

1.2 微生物外泌體的分離方法

與植物類似，超速離心法是分離細菌及真菌外泌體最常用的方法（圖1）。其具體分離方法為：①獲得細菌、真菌的培養(yǎng)液；②差速離心去除培養(yǎng)液中的雜質(zhì)及細胞碎片；③0.45 μm濾膜過濾進一步去除雜質(zhì)及大的胞外囊泡；④100 000～150 000 g超速離心沉淀外泌體。目前已使用超速離心法成功從多種細菌、真菌及卵菌中成功分離出外泌體（圖1）。此外，研究人員使用體積排阻色譜法從鐮刀菌培養(yǎng)液中提取出外泌體^［16］。而Rutter等^［17］通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)炭疽病菌分泌的外泌體被限制在細胞壁與細胞膜之間，僅能從炭疽病菌原生質(zhì)體的培養(yǎng)上清中分離到外泌體，說明少數(shù)真菌的細胞壁會阻礙外泌體的分泌。

2 基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法

傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究是采用雙向電泳根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點和分子量分離蛋白質(zhì)，經(jīng)過圖像對比分析后采用質(zhì)譜鑒定差異點中的蛋白。由于雙向電泳技術(shù)具有通量低、分辨率低、重復(fù)性差等缺點^［18］，目前已逐漸被基于高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)所替代。隨著質(zhì)譜精度和掃描速度的提升，可對樣本中上萬個蛋白質(zhì)進行定性和定量分析^［19］。基于LC-MS/MS蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的核心流程為：①抽提樣本蛋白質(zhì)；②采用蛋白酶將蛋白質(zhì)酶解為肽段；③使用高效液相色譜分離肽段，肽段經(jīng)離子化后進入質(zhì)譜；④通過一級和二級質(zhì)譜對肽段進行定性和定量；⑤檢索數(shù)據(jù)庫并進行生物信息學(xué)分析。根據(jù)檢測目的不同，蛋白質(zhì)組學(xué)可分為定性蛋白質(zhì)組學(xué)和相對定量蛋白質(zhì)組學(xué)。定性蛋白質(zhì)組學(xué)主要用于檢測樣品中的蛋白成分或含有某種翻譯后修飾蛋白質(zhì)的種類，而定量蛋白質(zhì)組學(xué)主要用于檢測蛋白質(zhì)含量或修飾蛋白質(zhì)的含量在不同樣本中的變化。與常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)不同，由于在總蛋白中含有某一特定修飾的蛋白質(zhì)所占比例較低，因此修飾蛋白質(zhì)組學(xué)需要從總肽段中富集目標修飾肽段。其基本原理為使用能夠特異吸附修飾肽段的材料富集修飾肽段。如采用含有陽離子親和吸附磷酸基團的 IMAC（Fe³⁺）技術(shù)富集磷酸化肽段，采用特異性抗體富集泛素化肽段、乙?；亩?、甲基化肽段，采用凝集素富集糖基化肽段等^［20］。目前，常用的基于LC-MS/MS的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法有非標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)和標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)。

非標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)是指每個樣品的肽段單獨上機，經(jīng)高效液相色譜分離、離子化后進入質(zhì)譜，通過肽段一級質(zhì)譜（MS1）的峰面積定量肽段，通過肽段的二級碎裂（MS2）模式定性肽段。通常采用數(shù)據(jù)依賴模式（DDA）采集肽段的MS2信息。在DDA模式下，質(zhì)譜僅能采集豐度較高肽段的MS2信息，而漏掉大量低豐度肽段的MS2信息。因此，基于DDA模式的非標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)穩(wěn)定性較差，數(shù)據(jù)量較小^［21］。目前幾乎所有的植物及植物源病原菌外泌體蛋白成分的鑒定均采用此方法（表1）。近年來隨著質(zhì)譜性能的提升，在數(shù)據(jù)非依賴模式（DIA）下采集肽段的MS2信息成為現(xiàn)實。在DIA模式下，質(zhì)譜能采集所有的MS2信息，極大提升了數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性及數(shù)據(jù)量^［31］。

標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)是指采用含有不同報告基團的同位素標記不同樣品的肽段，通過質(zhì)譜對樣品中的肽段進行定性和定量分析。常用的商業(yè)化同位素標記試劑有ITRAQ、TMT和SILAC^［32］。其中ITRAQ和TMT試劑用于體外標記，即直接標記酶解后的肽段。而SILAC試劑主要用于體內(nèi)標記，即在細胞培養(yǎng)過程中將含有同位素標記的氨基酸加入培養(yǎng)基，通過細胞代謝將同位素標記的氨基酸引入新合成的蛋白質(zhì)中。ITRAQ和TMT試劑最多可同時標記8和16個樣品，而SILAC試劑最多可同時標記3個樣品。與非標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)相比，同位素標記蛋白質(zhì)組學(xué)有如下優(yōu)勢：①重現(xiàn)性好。不同樣品肽段被同位素標記后，質(zhì)譜可根據(jù)同位素的不同區(qū)分相同肽段屬于哪組樣品，因此可將同位素標記的不同樣本的肽段混合后通過一次上機試驗對所有樣本中的肽段進行定性和定量分析，避免由于質(zhì)譜的穩(wěn)定性所引入的誤差；②數(shù)據(jù)量大。將同位素標記的不同樣本肽段混合后可進行二維高效液相色譜分離，即首先根據(jù)肽段特性（如離子特性、pH等）將肽段分為不同組分，然后將不同組分分別進行LC-MS/MS分析。此方法能有效降低高豐度肽段對低豐度肽段檢測的干擾^［33］。然而，由于同位素標記技術(shù)需要較大的樣本量，目前尚未見采用此方法對植物及植物源病原菌外泌體進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析的相關(guān)報道。

3 植物EVs蛋白質(zhì)組學(xué)與植物免疫

3.1 植物外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)與植物抗病成分的跨界傳遞

在植物與微生物互作過程中，核酸和蛋白質(zhì)等生物信息分子的跨界傳遞對于微生物的侵染及植物免疫至關(guān)重要。如病原菌向宿主細胞分泌效應(yīng)蛋白及毒力因子促進侵染，而植物細胞向病原菌分泌核酸、抗菌肽和抗病蛋白等抑制病原菌的生長。然而，這些生物信息分子通過植物或微生物細胞膜屏障的機制仍舊未知^［34］。最新的研究結(jié)果顯示，外泌體在介導(dǎo)生物信息分子跨界傳遞的過程中具有重要作用^{［6，11］}。Regente等^［8］通過蛋白質(zhì)組學(xué)在向日葵外泌體中鑒定到237個蛋白質(zhì)。除與糖酵解/三羧酸循環(huán)、囊泡運輸?shù)壬飳W(xué)過程相關(guān)的蛋白質(zhì)外，向日葵外泌體中還包含病程相關(guān)蛋白PR4（pathogenisis-related protein 4）、PR5、PR6、PR9、PR14等多種抗病相關(guān)的蛋白質(zhì)（圖2）。進一步將向日葵外泌體與核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）孢子孵育發(fā)現(xiàn)向日葵外泌體能被核盤菌孢子攝取，并抑制核盤菌孢子的生長，說明植物外泌體介導(dǎo)抗病蛋白質(zhì)由植物向真菌細胞的跨界傳遞。與蛋白質(zhì)的傳遞過程類似，研究人員發(fā)現(xiàn)擬南芥外泌體能將靶標真菌毒力基因的microRNA轉(zhuǎn)運至灰霉菌（Botrytis cinerea），從而抑制灰霉菌毒力基因的表達^［6］。為探索外泌體裝載microRNA的機制，He等^［14］通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析了擬南芥外泌體的蛋白質(zhì)組成，挖掘出 Argonautes（AGOs）、RNA helicases（RHs）以及Annexins（ANNs）等多種RNA結(jié)合蛋白。進一步結(jié)合反向遺傳學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)AGO1、RH11和RH37向外泌體中裝載microRNA，說明外泌體蛋白質(zhì)同樣介導(dǎo)microRNA的跨界傳遞。

此外，研究人員對外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示外泌體可能與植物的化學(xué)防衛(wèi)相關(guān)^［9］。芥子油苷是十字花科植物特有的次生代謝產(chǎn)物，其水解產(chǎn)物是多種細菌和真菌的天然毒素。早期的研究結(jié)果顯示，芥子油苷和其水解酶分別儲存在液泡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小體（ER body），病原菌的侵染導(dǎo)致芥子油苷和水解酶被釋放，進而發(fā)生反應(yīng)抑制病原菌的侵染。研究人員通過對擬南芥外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)擬南芥外泌體中包含芥子油苷水解酶Epithiospecific modifier 1、Myrosinase 1、Myrosinase 2以及芥子油苷轉(zhuǎn)運蛋白Pentacyclic triterpene synthase 3、PTR Family 2.10^{［9，22］}（圖2），說明植物外泌體可能參與芥子油苷的代謝及轉(zhuǎn)運，當(dāng)病原菌侵染植物后，芥子油苷被轉(zhuǎn)運至外泌體并被水解為毒素，進而經(jīng)外泌體被轉(zhuǎn)運至病原菌行使抑菌功能。

3.2 植物外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)與PTI

盡管目前對外泌體在植物與微生物互作過程中的功能研究已取得一定進展，但尚未見有關(guān)外泌體是否參與植物抗病信號傳導(dǎo)過程的相關(guān)報道。而對擬南芥、向日葵及煙草外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示，植物外泌體中裝載多種與先天性免疫信號傳導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)，說明植物外泌體極有可能介導(dǎo)抗病信號的傳導(dǎo)^{［8-9，14，22］}。當(dāng)病原菌侵染植物后，位于細胞膜上的模式識別受體（pattern-recognition receptors，PRRs）識別病原菌的PAMPs（pathogen-associated molecular patterns），進而激發(fā)植物的PTI（PAMP-triggered immunity）^［35］。PRRs主要包括類受體蛋白激酶（receptor-like kinases，RLKs）和類受體蛋白（receptor-like protein，RLPs）。其中RLKs包含胞外的一段能夠結(jié)合PAMPs的配體識別結(jié)構(gòu)域及胞內(nèi)的激酶結(jié)構(gòu)域，而RLPs僅含有胞外的配體識別結(jié)構(gòu)域^［36-37］。蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，植物外泌體中含有多種類型的PTI信號傳導(dǎo)相關(guān)蛋白^{［8-9，14，22］}（圖2）：①類受體蛋白激酶（receptor-like kinases，RLKs），包括FLS2（flagellin-sensitive 2）、EFR（CEwulElQbu3wJFW/2kHkLw==EF-Tu receptor）、CERK1（chitin elicitor receptor kinase 1）、LYK4（LysM-containing receptor-like kinase 4）、LYK5、KIN7（kinase 7）、NILR2（nematode-induced LRR-RLK 2）等。RLKs主要介導(dǎo)PAMPs的識別，通過磷酸化向細胞內(nèi)部傳遞PTI信號。其中，F(xiàn)LS2、ERF、KIN7/NILR分別識別細菌的鞭毛蛋白、延伸因子EF-Tu以及脂多糖，LYK4/5和CERK1主要識別真菌的幾丁質(zhì)^{［36，38］}。②類受體蛋白（receptor-like protein，RLPs）RLP23 和RLP54。與RLKs類似，RLPs通過其胞外配體識別結(jié)構(gòu)域識別病原菌的PAMPs，介導(dǎo)PTI信號的傳導(dǎo)。③PTI共受體 BAK1（BRI-associated receptor kinase）、BKK1和適配蛋白SOBIR1（Suppressor of BIR1 1）。RLKs胞外配體識別結(jié)構(gòu)域識別PAMPs后會與BAK1和BKK1形成復(fù)合體，進而通過磷酸化級聯(lián)向細胞核傳遞PTI信號。而RLPs沒有胞內(nèi)的激酶結(jié)構(gòu)域，因此要先與適配蛋白SOBIR1結(jié)合后再與BAK1和BKK1形成復(fù)合體，進而傳遞PTI信號^{［36，39-40］}。④假激酶BRI1（Brassinosteroid insensitive 1）、BRI2和BRI3。在正常狀態(tài)下，BRI蛋白與BAK1互作，從而阻礙RLKs與BAK1形成復(fù)合體激活PTI。而RLKs/RLPs與PAMPs的識別會誘導(dǎo)BAK1從BIR-BAK1復(fù)合體中解聚，從而與RLKs/RLPs形成復(fù)合體進而激活PTI^［41-42］。以上蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果說明外泌體可能介導(dǎo)植物PTI信號的傳導(dǎo)，即外泌體中的PTI相關(guān)激酶復(fù)合體識別病原菌的PAMPs后被激活，隨后外泌體被植物細胞攝取，向細胞核傳遞PTI信號。在哺乳動物系統(tǒng)，細胞分泌的外泌體能夠經(jīng)體液系統(tǒng)長距離轉(zhuǎn)運，從而被遠端的靶細胞攝取，調(diào)控遠端靶細胞的功能^［4］。因此，植物外泌體可能作為PTI信號復(fù)合體的載體，介導(dǎo)PTI信號由病原菌侵染位點向臨近或遠端未被病原菌侵染細胞的傳導(dǎo)。

3.3 植物外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)與DTI

除PAMPs外，病原菌的侵染會導(dǎo)致植物細胞降解進而產(chǎn)生損傷相關(guān)的分子（damage-associated molecular patterns，DAMPs）。DAMPs能夠被位于細胞膜上的受體識別，激發(fā)植物的DTI（DAMP-triggered immunity，DTI）^［43］。PTI和DTI共同構(gòu)成植物抵抗病原菌侵染的第一道防線。DAMPs的產(chǎn)生依賴細胞壁的降解和修飾。研究人員通過蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)植物外泌體中含有大量的與細胞壁降解及修飾相關(guān)的酶^［8-9］，說明外泌體可能參與DAMPs的產(chǎn)生。此外，外泌體中還含有WAK1（Cell wall-associated kinase 1）、WAK2、THE1（Theseus 1）、MIK2（Mdis1-interacting receptor like kinase 2）以及PEPR1（Proline-rich extensin-like receptor kinase 1）等多種DAMPs受體蛋白^{［8-9，14，22］}（圖2），說明外泌體可能介導(dǎo)DTI的信號傳導(dǎo)。寡聚半乳糖醛酸（Oligogalacturonides，OGs）是病原菌侵染過程中細胞壁果膠解聚產(chǎn)生的DAMPs，在誘導(dǎo)植物防衛(wèi)響應(yīng)及調(diào)控植物發(fā)育方面具有重要功能^［44-45］。THE1和MIK2在介導(dǎo)未知細胞壁來源DAMPs的信號傳導(dǎo)方面具有重要功能^{［43，46-47］}。此外，在與病原菌互作過程中植物會產(chǎn)生一類由23～29個氨基酸組成的肽段類DAMPs （Pep），Pep能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生與PTI類似的抗性反應(yīng)。研究顯示，PEPR1是Pep的受體，在介導(dǎo)Pep誘導(dǎo)的抗性信號傳導(dǎo)過程中具有重要作用。

3.4 植物外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)與ETI

為克服PTI和DTI，病原菌向宿主細胞分泌多種效應(yīng)蛋白（effectors），這些效應(yīng)蛋白能抑制PTI系統(tǒng)關(guān)鍵信號蛋白的活性，進而抑制植物的PTI^［48］。而位于植物細胞內(nèi)部的NLRs能識別或感知效應(yīng)蛋白的活性，進而激發(fā)植物更加強烈的免疫反應(yīng)，這一過程被稱為效應(yīng)因子激發(fā)的免疫（effector-triggered immunity，ETI）^［49-50］。Rutter等^［9］通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析在擬南芥外泌體中鑒定到598個蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示有11%的蛋白質(zhì)與植物脅迫響應(yīng)相關(guān)。其中包括RIN4（RPM1-interaction protein4）及其互作蛋白Atpases、Early-responsive to dehydration4、Remorin和Delta（24）-sterol reductase（圖2）。RIN4能夠被AvrB、AvrRpm1、和AvrRpt2等多種病原菌的效應(yīng)蛋白降解，其狀態(tài)的變化被宿主細胞內(nèi)的受體激酶RPS2感知后進一步激活鈣離子依賴的蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase，CDPKs），進而通過連續(xù)的蛋白磷酸化向細胞核傳遞ETI信號^{［36，51］}。而CDPK3和CDPK6同樣位于外泌體^{［9，14，22］}，說明植物外泌體可能介導(dǎo)植物ETI信號的傳導(dǎo)。

3.5 植物外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)與SAR

病原菌的侵染能激發(fā)植物的PTI、DTI和ETI。此外，在侵染位點能夠合成多種信號分子，這些信號分子能經(jīng)植物的韌皮部轉(zhuǎn)運至植物未被病原菌侵染的部位，并誘導(dǎo)這些部位產(chǎn)生對細菌、真菌及病毒的廣譜抗性，這一過程被稱為系統(tǒng)獲得抗性（systemic acquired resistance，SAR）^［52］。在哺乳動物系統(tǒng)，外泌體可以進入體液系統(tǒng)進行長距離轉(zhuǎn)運，從而調(diào)控遠端靶細胞的功能。與此類似，研究者通過蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)，擬南芥外泌體中含有多種SAR相關(guān)的蛋白質(zhì)，說明外泌體可能參與植物SAR長距離信號的轉(zhuǎn)運或SAR信號的擴增^［1，9］。盡管目前已發(fā)現(xiàn)的SAR長距離信號多為小分子代謝物，但有研究報道顯示部分蛋白質(zhì)能夠從病原菌侵染位點經(jīng)韌皮部進行長距離轉(zhuǎn)運，進而介導(dǎo)SAR長距離信號的傳導(dǎo)^［53-55］。Chanda等^［56］發(fā)現(xiàn)，擬南芥脂轉(zhuǎn)運蛋白DIR1能經(jīng)植物的韌皮部進行長距離轉(zhuǎn)運，并且外源DIR1能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生SAR，說明DIR1介導(dǎo)SAR長距離信號的轉(zhuǎn)運。Carella等^［57］通過韌皮部蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定到多個與擬南芥SAR長距離信號傳導(dǎo)相關(guān)的移動蛋白，其中，CML27、MLP43、TRXh3等16個蛋白質(zhì)同樣存在于擬南芥外泌體蛋白質(zhì)組中^［1，9］，說明植物外泌體能夠經(jīng)植物的韌皮部長距離移動，進而介導(dǎo)蛋白類SAR長距離信號向系統(tǒng)性部位的轉(zhuǎn)運。

3.6 植物外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)與ROS

研究表明，活性氧（reactive oxygen species，ROS）在植物PTI、DTI、ETI以及SAR信號傳導(dǎo)過程中具有重要功能^{［43，52，58］}。一方面，活性氧介導(dǎo)PTI、DTI和ETI信號的傳導(dǎo)；另一方面，活性氧參與SAR信號的擴增。近期，研究人員通過蛋白質(zhì)組學(xué)在植物外泌體中鑒定到多種與ROS信號的產(chǎn)生及傳導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)，包括Phospholipase Da、Annexin1、Ascorbate peroxidase 1、Glutathione S-transferase PHI2以及Respiratory burst oxidase homologue D（RBOHD）等^［9］。其中，NADPH氧化酶RBOHD在ROS的產(chǎn)生過程中具有至關(guān)重要的作用^［59］。RBOHD位于細胞膜，主要參與超氧負離子的形成。而超氧負離子能夠在超氧化物歧化酶的作用下進一步被催化為過氧化氫^［60］。因此，植物外泌體可能參與ROS的產(chǎn)生及其信號傳導(dǎo)過程。

4 真菌外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)與真菌毒力

在侵染過程中，真菌向宿主細胞分泌細胞壁水解酶和效應(yīng)蛋白以穿透植物細胞壁并抑制植物的免疫系統(tǒng)。大多數(shù)蛋白質(zhì)通過傳統(tǒng)的分泌途徑被釋放，即含有N端信號肽的蛋白質(zhì)經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、分泌囊泡、細胞膜途徑被分泌至細胞外。然而，研究人員對真菌外泌體進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，真菌外泌體中包含多種細胞壁水解酶和效應(yīng)蛋白^［23-25］，說明真菌外泌體與真菌的毒力相關(guān)。Silva等^［23］首次分離了植物源真菌鏈格孢菌的外泌體并鑒定了其蛋白組分，結(jié)果顯示，鏈格孢菌的外泌體中包含多種與宿主細胞黏附、細胞壁降解相關(guān)的蛋白質(zhì)。與此類似，小麥葉枯病菌及棉花枯萎病菌的外泌體同樣包含細胞壁水解酶、蛋白酶等毒力蛋白^［24-25］。為探究真菌外泌體是否介導(dǎo)效應(yīng)蛋白的分泌，研究者通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析了鐮刀菌外泌體的蛋白成分，鑒定出NIS1-like、SnodProt1-like、LysM domain containing protein等多個效應(yīng)蛋白^［26］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，真菌外泌體能夠通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被植物細胞攝取^［27］，說明外泌體介導(dǎo)毒力蛋白由真菌向宿主細胞的跨界傳遞，從而協(xié)助真菌侵染植物。為闡明外泌體毒力蛋白在真菌侵染植物過程中的功能，He等^［11］構(gòu)建了灰霉菌外泌體標志蛋白PLS1的突變體，通過分子生物學(xué)及生理學(xué)試驗發(fā)現(xiàn)，pls1突變體對擬南芥的毒力降低；pls1突變體外泌體的釋放量降低；野生型灰霉菌的外泌體能夠恢復(fù)pls1突變體對擬南芥的毒力，說明真菌外泌體介導(dǎo)毒力蛋白質(zhì)的跨界傳遞，在真菌侵染植物過程中具有重要作用。

5 細菌外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)與植物免疫

與植物和真菌外泌體的分泌途徑不同，革蘭氏陰性菌具有外膜，能通過出芽的形式直接向外界環(huán)境分泌囊泡，因此也被稱為外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）^［61］。近年來，對丁香假單胞桿菌、黃龍病菌等細菌OMVs的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示，細菌OMVs中包含多種效應(yīng)蛋白、Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ型分泌系統(tǒng)組成蛋白、蛋白類PAMPs等^{［10，12，30，62-63］}，說明OMVs可能激發(fā)植物的PTI和ETI。研究人員通過分子生物學(xué)試驗證實黃單胞菌和丁香假單胞桿菌的OMVs能激發(fā)植物多種PTI和ETI相關(guān)基因的表達，增強植物對細菌和卵菌的抗性^{［5，64-66］}。然而，目前的研究主要集中在外源OMVs誘導(dǎo)植物抗病的機制，尚不清楚OMVs在植物與細菌互作過程中的功能。而蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示OMVs同樣包含脂酶、黏附素、蛋白酶及細胞壁裂解酶等多種決定細菌毒力的蛋白質(zhì)^［10］，說明在植物與細菌互作過程中OMVs可能與細菌的毒力相關(guān)。

6 展望

外泌體是近年來植物與微生物互作領(lǐng)域關(guān)注的焦點。盡管蛋白質(zhì)組學(xué)分析已為解析外泌體的蛋白組成及其在植物與微生物互作過程中的功能做出了巨大貢獻，但仍有諸多問題亟待解決。①目前檢測植物及植物病原菌外泌體蛋白成分的方法均是基于DDA模式的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，隨著質(zhì)譜精度和掃描速度的提升，使在DIA模式下分析外泌體的蛋白質(zhì)組成成為現(xiàn)實。與DDA檢測模式相比，基于DIA模式的檢測方法能夠極大提升外泌體中低豐度蛋白的檢出率。②在哺乳動物系統(tǒng)，不同來源細胞或同一細胞在不同環(huán)境下所分泌外泌體的蛋白成分及功能不同。采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析不同狀態(tài)下細胞分泌外泌體的蛋白成分的差異有助于明確外泌體的生物學(xué)功能。然而目前有關(guān)植物及植物病原菌外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)均是定性分析，尚未見在互作狀態(tài)下檢測植物或植物病原菌分泌外泌體蛋白含量變化的報道。因此，使用定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析植物與病原菌互作狀態(tài)下外泌體蛋白成分的變化將有助于闡明植物與微生物的互作機制。③蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示植物外泌體中包含多種介導(dǎo)PTI、DTI和ETI信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵激酶，這些激酶的激活或者抑制受磷酸化、乙?；确g后修飾的調(diào)控。因此，通過修飾組學(xué)分析病原菌侵染前后植物外泌體蛋白質(zhì)翻譯后修飾的變化將有助于深入解析外泌體在植物免疫信號傳導(dǎo)過程中的功能。

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