海水中降解幾丁質(zhì)細菌的篩選鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化

摘要 ［目的］從海水中獲得高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株并優(yōu)化培養(yǎng)條件。［方法］采集湛江市金沙灣海水作為樣品，以膠體幾丁質(zhì)為唯一碳源篩選分離產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株，DNS法測定酶活力并進行分子鑒定；單因素試驗和正交優(yōu)化其產(chǎn)酶最佳條件。［結(jié)果］初篩得到6株能降解幾丁質(zhì)的細菌，其中編號為Z-4的菌株幾丁質(zhì)酶活力最強，形態(tài)鑒別及16S rDNA序列分析鑒定為嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）。菌株Z-4優(yōu)化后的最佳產(chǎn)酶條件為可溶性淀粉添加量1.5%、蛋白胨添加量2.5%、KHPO添加量0.04%，在30 ℃、pH 7.0、接種量2%、160 r/min、培養(yǎng)72 h，酶活力達到0.452 U/mL，相比優(yōu)化前提高了5倍。［結(jié)論］研究結(jié)果為海洋副產(chǎn)物有效利用幾丁質(zhì)改善環(huán)境提供重要參考。

關(guān)鍵詞 海水；細菌；幾丁質(zhì)酶；培養(yǎng)條件優(yōu)化；篩選鑒定

中圖分類號 S 917.1 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）16-0001-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.16.001

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Screening and Identification of Chitin Degrading Bacteria in Seawater and Optimizing Culture Conditions

QI Hong-bing，ZHANG Min-yi

（School of Life Science and Technology，Lingnan Normal University，Zhanjiang，Guangdong 524048）

Abstract ［Objective］ To obtain high-yield chitinase strains from seawater and optimize culture conditions.［Method］The seawater from Jinsha Bay of Zhanjiang City was collected as samples，chitinase producing strains were isolated using colloidal chitin as the only carbon source，the enzyme activity was measured by DNS method and molecular identification;single factor experiment and orthogonal optimization were used to optimize the optimal conditions for enzyme production.［Result］Six strains of chitinase-degrading bacteria were screened.The strain with the strongest chitinase activity was Z-4.The strain was identified as Stenotrophomonas maltophilia by morphological observation and 16S rDNA sequence analysis.The optimum conditions for producing enzyme of strain Z-4 were obtained as follows：soluble starch addition of 1.5%，peptone addition of 2.5%，KHPO addition of 0.04%;at 30 ℃，pH 7.0，inoculation amount of 2%，160 r/min and 72 hours of cultivation，the enzyme activity reached 0.452 U/mL，which was 5 times higher than before optimization.［Conclusion］The research results provide an important reference for the effective use of chitin in the ocean to improve the environment.

Key words Seawater;Bacteria;Chitinase;Optimization of culture conditions;Screening and identification

基金項目

湛江市非資助科技攻關(guān)計劃項目（2023B01023）；嶺南師范學(xué)院校級教育教學(xué)改革項目 （嶺師教務(wù)〔2022〕154號）。

作者簡介 祁紅兵（1971— ），男，河南信陽人，副教授，博士，從事微生物生理研究。

收稿日期 2023-09-13

幾丁質(zhì)是世界上含量巨大的生物多聚體之一，其廣泛存在許多物種的體內(nèi)和外殼中，如線蟲的表皮、真菌的細胞壁、節(jié)肢動物的外骨架以及許多昆蟲的腸道^［1］。幾丁質(zhì)是一種多糖，在生物體內(nèi)并不是以游離的狀態(tài)存在的，而是與其他物質(zhì)結(jié)合在一起，因此幾丁質(zhì)的開發(fā)利用需要對含幾丁質(zhì)的原料進行處理，分離出幾丁質(zhì)^［1］。目前主要通過化學(xué)法對幾丁質(zhì)原料進行降解，從而產(chǎn)生殼聚糖、幾丁質(zhì)寡糖及其衍生物，但這種方法容易造成環(huán)境污染，與國家倡導(dǎo)的綠色發(fā)展理念相悖^［2-3］。幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)血糖、抗腫瘤、降血脂、抗菌等作用，目前已被應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、食品、環(huán)保等領(lǐng)域^［4］。幾丁質(zhì)酶是指能夠催化水解幾丁質(zhì)的酶類總稱，在自然界幾乎所有生物類群中都能發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶的存在^［5］。微生物幾丁質(zhì)酶在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好前景^［6］。

地球表面積的3/4約為海洋，由于海洋生物資源數(shù)不勝數(shù)，各海洋大國紛紛把目光投向了海洋生物資源的研究開發(fā)上，其中海洋生物酶的研究便是各國的重點研究對象之一^［7-9］。但自然界中產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的微生物普遍存在產(chǎn)酶量低、生產(chǎn)成本過高、酶活力低等問題，使得在實際中的應(yīng)用并不多。因此，加大對海洋生物資源的研究，從海洋微生物中分離高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株具有重大的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株。

湛江金沙灣有不少貝類、蝦、蟹等，每年都會產(chǎn)生較多的殼類廢棄物，為幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌提供了適宜的生長和繁殖條件，因此以湛江金沙灣采集的海水作為樣品，從中分離篩選能產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的細菌。

1.1.2 培養(yǎng)基。

平板分離培養(yǎng)基：蛋白胨0.500%，七水硫酸鎂0.001%，七水硫酸鋅0.001%，膠體幾丁質(zhì)0.500%，磷酸二氫鉀0.005%，瓊脂2.000%，pH 7.0。種子培養(yǎng)基：蛋白胨0.500%，七水硫酸鎂0.001%，七水硫酸鋅0.001%，膠體幾丁質(zhì)0.500%，磷酸二氫鉀0.005%，pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨0.500%，七水硫酸鎂0.001%，七水硫酸鋅0.001%，膠體幾丁質(zhì)0.500%，磷酸二氫鉀0.005%，pH 7.0。

1.1.3 主要試劑。

N-乙酰-D-氨基葡萄糖（NAG），分析純，潤友化學(xué)（深圳）有限公司；甲殼素，分析純，上海麥克林生化f6c4da06c6ff31cecc610fb609e2a03c科技有限公司；3，5-二硝基水楊酸（DNS），武漢卡諾斯科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；PCR引物，英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司。

1.1.4 主要儀器。

生化培養(yǎng)箱（SPL-150，廣州瑞彬科技有限公司） ；紫外可見分光光度計（752N，上海儀電分析儀器有限公司）；凝膠成像儀（ChampChemi Professional，北京三江銳志科技有限公司）；電泳儀（DYY-6C，成都一科儀器設(shè)備有限公司）；紫外投射反射儀（WFH-201B，上海精科實業(yè)有限公司）；基因擴增儀器（A300，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 膠體幾丁質(zhì)的制備。

精確稱量細粉幾丁質(zhì)5 g，加入100 mL濃鹽酸混勻，放置24 h，邊攪拌邊過濾到500 mL的蒸餾水中，靜置至沉淀析出，離心后收集膠體幾丁質(zhì)，蒸餾水沖洗至中性，用0.2 mmol/L磷酸緩沖液定容，使膠體幾丁質(zhì)溶液的最終濃度為1%^［10-11］。

1.2.2 DNS溶液的制備。

參照付星等^［12］的方法，稱取3，5-二硝基水楊酸6.3 g，加入500 mL蒸餾水，攪拌并加熱使其溶解，逐步加入300 mL 10% NaOH溶液，同時不斷攪拌，按順序依次加入182 g酒石酸鉀鈉、5 g結(jié)晶酚和5 g NaSO，攪拌并加熱使其溶解（溫度不宜超過50 ℃），待溶液冷卻至室溫后，定容至1 L，棕色瓶中儲存?zhèn)溆茫覝叵路胖? d后使用。

1.2.3 N-乙酰-D-氨基葡萄糖（NAG）標準曲線的繪制。

1.2.3.1 NAG標準溶液的配制。用適量蒸餾水將100 mg的NAG溶解，定容至100 mL，配制成濃度為0.1%的NAG標準溶液，并置于4 ℃冰箱保存。

1.2.3.2 標準曲線的繪制。依次將NAG標準溶液、蒸餾水和DNS溶液加入試管中，混勻后，煮沸5 min。迅速冷卻后，定容至25 mL，以不加NAG標準液的0號管為對照調(diào)零，用紫外可見分光光度計在540 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標、NAG含量為橫坐標繪制標準曲線（圖1），得出線性回歸方程y=0.328 8x-0.009 1（R²=0.993 4）。

1.2.4 幾丁質(zhì)酶活力的測定。將發(fā)酵液在6 000 r/min離心15 min，取上清液0.5 mL加入1 mL的1%膠體幾丁質(zhì)，于40 ℃中反應(yīng)30 min，以滅活的上清液作為對照，加入1.5 mL蒸餾水和1.5 mL DNS，充分混勻，在沸水浴中加熱5 min，迅速用流水冷卻至室溫，定容至25 mL，在540 nm測吸光度^［13-14］，并根據(jù)NAG標準曲線線性回歸方程計算出NAG含量。酶活力計算公式如下：

酶活力（U/mL）=m×n×1 000/（M×T×V）

式中：m為NAG含量；n為稀釋倍數(shù)；M為NAG相對分子量（221.21）；T為反應(yīng)時間；V為酶液體積。

1.2.5 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的分離純化。

1.2.5.1 初篩。

取1 mL樣品加入裝有9 mL無菌海水的試管中，混勻，分別稀釋制成不同倍數(shù)的稀釋液。從10^-4～10^-7 的4管海水稀釋液中各吸取0.1 mL，均勻地涂布在平板分離培養(yǎng)基上，在30 ℃條件下培養(yǎng)96 h^［15］。

1.2.5.2 復(fù)篩。

從初篩平板中挑取能夠產(chǎn)生透明圈的菌株，進行劃線分離純化。取劃線后長出的單菌落接入到種子培養(yǎng)基中，30 ℃、搖床160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，取種子液0.6 mL 接入30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，同樣條件下振蕩培養(yǎng)5 d，取發(fā)酵液在6 000 r/min的條件下離心15 min，收集上清粗酶液，測定酶活力，斜面培養(yǎng)基中保存酶活力較高的菌株。

1.2.6 菌株的形態(tài)觀察。

將菌株劃線于2216E瓊脂平板，30 ℃培養(yǎng)72 h，期間觀察菌落形態(tài)及革蘭氏染色情況。

1.2.7 菌株的分子鑒定。

1.2.7.1 基因組DNA的提取。按細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取總DNA后，用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.2.7.2 16S rDNA基因擴增與測序。

用于PCR擴增的引物為27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACCTTGTTACGACTT-3′），由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為30 μL。PCR擴增條件：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；68 ℃充分延伸10 min。

PCR擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，并將擴增產(chǎn)物送往上海立菲生物技術(shù)有限公司進行測序。將所測得的16S rDNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行BLAST比對分析，采用鄰接法（Neighbor-joining）在MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.8 菌株生長曲線的繪制。

種子培養(yǎng)基中接種菌株，30 ℃、搖床160 r/min培養(yǎng)，定時取樣，測定波長為600 nm時菌液的OD值，并繪制生長曲線，確定種子液的培養(yǎng)時間。

1.2.9 菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶條件的單因素試驗。

在發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別考察碳源（細粉幾丁質(zhì)、膠體幾丁質(zhì)、葡萄糖、可溶性淀粉）、

碳源濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、氮源（蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硫酸銨）、氮源濃度（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、KHPO濃度（0、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）、發(fā)酵時間（1、2、3、4、5、6 d）、培養(yǎng)基初始pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）對菌株產(chǎn)酶的影響^［16］。

1.2.10 正交試驗。

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以可溶性淀粉添加量、蛋白胨添加量、KHPO添加量為考察因素，進行L（3³）正交試驗，因素和水平的選擇如表1所示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過SPSS、Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計并作圖，運用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的分離純化

2.1.1 初篩。

培養(yǎng)1 d后平板長出少許菌落，2 d后菌落數(shù)明顯增多，開始出現(xiàn)透明圈，3 d后透明圈越來越明顯，挑取能產(chǎn)生透明圈的菌株，進行平板劃線。經(jīng)初篩得到6株能降解幾丁質(zhì)的菌株（Z-1、Z-2、Z-3、Z-4、Z-5、Z-6），部分菌株的生長狀況見圖2。

2.1.2 復(fù)篩。

為了更精確地判斷菌株的產(chǎn)酶能力，需要對這6株菌株進行復(fù)篩，培養(yǎng)5 d后分別測定酶活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Z-1、Z-2、Z-3、Z-4、Z-5、Z-6菌株的酶活力分別為0.017、0.053、0.032、0.075、0.038、0.024 U/mL，可見，這6株細菌都具有產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的能力，但酶活力有差異，其中編號為Z-4的菌株酶活力最高，所以選定菌株Z-4作為試驗菌株。

2.2 菌株的形態(tài)特征

菌株Z-4在2216E瓊脂平板培養(yǎng)后，其形態(tài)特征為圓形隆起，呈淡黃色，表面光滑，不透明，邊緣平整（圖3 A）；革蘭氏染色陰性，多數(shù)呈桿狀（圖3 B）。

2.3 菌株的分子鑒定

2.3.1 16S rDNA的PCR擴增。

從圖4可以看出，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測菌株Z-4的PCR擴增產(chǎn)物，有一條大約為1 400 bp 的條帶出現(xiàn)，條帶清晰且明亮。

2.3.2 16S rDNA序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析。

菌株Z-4的16S rDNA序列長度為1 426 bp，在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中進行序列比對，發(fā)現(xiàn)該菌株與Stenotrophomonas maltophilia（登錄號MH396764.1）有較高相似性。用MEGA 7.0軟件按Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖5所示，菌株Z-4與Stenotrophomonas maltophilia WWi55不能分開。根據(jù)菌株Z-4的形態(tài)鑒定和16S rDNA序列分析，將菌株Z-4初步鑒定為嗜麥芽窄食單胞菌。

2.4 菌株生長曲線的繪制

該試驗以所測的OD值為縱坐標、培養(yǎng)時間為橫坐標繪制菌株生長曲線，如圖6所示。菌株剛開始生長較緩慢，約有6 h的延遲期；6 h后，菌株生長快速，培養(yǎng)液的OD值呈對數(shù)上升，菌體處于對數(shù)生長期；到24 h 左右，培養(yǎng)液的OD值變化不大，菌株進入穩(wěn)定生長的階段；在60 h以后，培養(yǎng)液中菌體的死亡量大于生長量，菌體生長處于衰亡期。由于在對數(shù)生長期的菌株生長活力大，生理和生化特征穩(wěn)定，適應(yīng)新環(huán)境的能力較強，進而提高了菌株的遺傳穩(wěn)定性。所以，選取10 h為種子液的培養(yǎng)時間。

2.5 菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶條件的單因素試驗

2.5.1 碳源對產(chǎn)酶的影響。

由圖7可知，菌株Z-4經(jīng)膠體幾丁質(zhì)誘導(dǎo)后，接種于不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，所產(chǎn)酶量并不相同。其中，以可溶性淀粉作為碳源時，相對酶活力最高；以細粉幾丁質(zhì)作為碳源時，相對酶活力最低。因此，選擇可溶性淀粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

2.5.2 碳源濃度對產(chǎn)酶的影響。

由圖8可知，當(dāng)可溶性淀粉濃度過高或過低時，均不利于菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶；可溶性淀粉濃度為1.5%時，相對酶活力最高。

2.5.3 氮源對產(chǎn)酶的影響。

由圖9可知，采用不同氮源時，菌株Z-4的產(chǎn)酶能力各不相同。蛋白胨作為氮源時相對酶活力最高；而酵母膏作為氮源時相對酶活力最低。所以，選擇蛋白胨作為最佳氮源。

2.5.4 氮源濃度對產(chǎn)酶的影響。

由圖10可知，當(dāng)?shù)鞍纂藵舛冗^高或過低時，均不利于菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶；蛋白胨濃度為2.5%時，相對酶活力最高。

2.5.5 KHPO濃度對產(chǎn)酶的影響。

由圖11可知，KHPO對菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶起到促進作用，當(dāng)KHPO濃度為0.03%時，相對酶活力最高，但當(dāng)濃度達到0.05%時又起到抑制作用。

2.5.6 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響。由圖12可知，菌株Z-4剛開始培養(yǎng)時，相對酶活力增長緩慢；2 d后，相對酶活力增長迅速，到3 d時，達到最高值，之后隨著培養(yǎng)時間的延長，相對酶活力又緩慢下降。

2.5.7 培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響。由圖13可知，該菌株在中性或偏酸性條件下產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的能力比較強。當(dāng)pH為7.0時，菌株的相對酶活力最高，當(dāng)pH為8.5時，菌株的相對酶活力最低，幾丁質(zhì)相對酶活力受培養(yǎng)基初始pH影響較大。

2.6 正交試驗

通過極差（R）分析（表2）可知，各因素對菌株Z-4產(chǎn)幾丁質(zhì)酶影響的重要程度依次為A（可溶性淀粉添加量）>B（蛋白胨添加量）>C（ KHPO添加量），即可溶性淀粉添加量對菌株產(chǎn)酶影響最大，蛋白胨添加量對其影響次之，影響最小的因素是KHPO添加量。

由正交試驗的結(jié)果還可以看出，細菌Z-4最適的產(chǎn)酶組合為ABC，即可溶性淀粉添加量1.5%、蛋白胨添加量2.5%、KHPO添加量0.04%，此時酶活力達到0.452 U/mL，比菌株Z-4 優(yōu)化前的產(chǎn)酶活力（0.075 U/mL）提高了約5倍。

3 結(jié)論

從廣東湛江金沙灣的海水中篩選出6株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株，通過DNS法分別測定這6株菌的幾丁質(zhì)酶活力，選取酶活力最高的菌株Z-4作為試驗菌株，經(jīng)形態(tài)特征觀察及16S rDNA序列分析，初步確定該菌株為嗜麥芽窄食單胞菌。產(chǎn)酶條件優(yōu)化結(jié)果顯示：蛋白胨添加量為2.5%，可溶性淀粉添加量為1.5%，KHPO添加量為0.04%，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為7.0，2%接種量，在30 ℃、160 r/min、培養(yǎng)72 h，菌株Z-4所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力最高，為0.452 U/mL，相比優(yōu)化前提高了5倍。

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