• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    馬鈴薯StNiR基因的克隆及其在低氮肥脅迫下的表達(dá)分析

    2024-08-23 00:00:00牛蘇燕張珍華蔣素華梁芳袁秀云張燕趙慧園崔波
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2024年14期

    摘要:為了研究馬鈴薯亞硝酸還原酶基因StNiR(nitrite reductase,NiR)在低氮肥脅迫中的作用,以馬鈴薯Russet Burbank品種為材料,采用反轉(zhuǎn)錄PCR法克隆獲得馬鈴薯亞硝酸還原酶基因StNiR。結(jié)果表明,該基因的開放閱讀框序列全長(zhǎng)為1 755 bp,共編碼584個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)由36.82% α螺旋、5.31% β轉(zhuǎn)角、16.78% 延伸鏈和41.10% 無(wú)規(guī)則卷曲組成,蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)與煙草NiR蛋白的一致性為86.60%。氨基酸序列與潘那利番茄(Solanum pennellii)、番茄(S. lycopericum)、曼陀羅(Datura stramonium)、風(fēng)鈴辣椒(Capsicum bacctum)、辣椒(C. annuum)、煙草(Nicotiana tabacum)的一致性均>93%。微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明,低氮肥脅迫下StNiR基因在根和葉片中均被抑制表達(dá),且在根中比在葉片中更敏感。本研究為后期如何從分子角度提高馬鈴薯的氮素利用率和培育氮高效馬鈴薯新品種奠定了基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:亞硝酸還原酶;基因克??;生物信息分析;微滴式數(shù)字PCR;馬鈴薯;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

    中圖分類號(hào):S532.01" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號(hào):1002-1302(2024)14-0040-06

    收稿日期:2023-09-07

    基金項(xiàng)目:河南省科技攻關(guān)計(jì)劃(編號(hào):202102110167);河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(編號(hào):24A210027);鄭州師范學(xué)院高層次人才科研啟動(dòng)專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(編號(hào):2018)。

    作者簡(jiǎn)介:牛蘇燕(1986—),女,河南安陽(yáng)人,博士,講師,從事薯類作物育種及功能基因組學(xué)等研究。E-mail:niusuyan1234@163.com。

    通信作者:崔 波,博士,教授,從事植物分子育種等研究。E-mail:laocuibo@163.com。

    馬鈴薯(Solabum tuberosum)為茄科茄屬一年生草本植物,是一種重要的糧蔬兼用作物。在其生育周期內(nèi),氮素是一個(gè)重要的限制因子。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上為了獲得目標(biāo)產(chǎn)量總是依賴于過(guò)度施用氮肥,然而馬鈴薯對(duì)氮肥的利用率較低,農(nóng)田中氮肥施入量的增加不僅會(huì)造成環(huán)境污染,同時(shí)還會(huì)造成生產(chǎn)成本增加和資源浪費(fèi)等問(wèn)題,更為嚴(yán)重的是氮肥的過(guò)量施用還容易導(dǎo)致馬鈴薯塊莖中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量升高,而亞硝酸鹽中毒則容易導(dǎo)致人類高鐵血紅蛋白癥、腎上腺腎小球肥大等癥狀,甚至還會(huì)致癌[1-4]。

    在植物體內(nèi),硝酸還原酶(nitrate reductase,NR)和亞硝酸還原酶(nitrite reductase,NiR)對(duì)初級(jí)氮的同化起著非常重要的作用,NR調(diào)控硝酸鹽降解為亞硝酸鹽,NiR再進(jìn)一步將亞硝酸鹽降解為銨,最終銨參與蛋白質(zhì)的合成[4-7]。研究表明,亞硝酸還原酶是植物體內(nèi)的NO合成酶,NO在一定程度上可提高植物的抗逆能力,緩解逆境脅迫,從分子角度對(duì)氮素?cái)z入、利用、儲(chǔ)存等代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究,對(duì)于提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。近年來(lái),相關(guān)學(xué)者通過(guò)對(duì)小麥亞硝酸還原酶基因的克隆與表達(dá)分析,驗(yàn)證了亞硝酸還原酶基因這一硝態(tài)氮同化過(guò)程的關(guān)鍵酶基因在進(jìn)化上具有高度的保守性[5-7]。此外,有研究將擬南芥NiR基因轉(zhuǎn)入煙草,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系的NiR活性比野生型高5倍,且有些轉(zhuǎn)基因株系的亞硝酸鹽含量降低[8],同時(shí)還發(fā)現(xiàn)植物下部葉片硝酸鹽含量高于上部葉片,轉(zhuǎn)基因株系的天冬氨酸和天冬酰胺的含量高于野生型。因此,本研究克隆出馬鈴薯NiR基因,以期為培育出低硝酸鹽含量的馬鈴薯品種奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    以生長(zhǎng)于鄭州師范學(xué)院學(xué)院生物工程研究中心的馬鈴薯品種Russet Burbank(簡(jiǎn)稱RB)為材料,取頂部展開葉1~2張。

    1.2 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

    利用植物多糖多酚RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司],按照其說(shuō)明書進(jìn)行RNA的提取。之后,用2%凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性,并用微量分光光度計(jì)測(cè)得D260 nm/D280 nm的值在1.8~2.1之間,證明RNA的純度符合要求。利用反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV 將馬鈴薯總RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 第1條鏈,作為馬鈴薯StNiR基因克隆的模板。

    1.3 引物的設(shè)計(jì)及基因的克隆

    根據(jù)馬鈴薯轉(zhuǎn)錄組獲得的NiR基因序列,利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物:上游引物為5′-T T G T T C T T G T T A A T T T G T C G-3′,下游引物為5′-A T A T G A T T C T G A A G A T T T T A G A T-3′,用于擴(kuò)增目的基因。以逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板,利用上游和下游引物PCR擴(kuò)增馬鈴薯的StNiR基因保守片段。反應(yīng)體系為:10×PCR Buffer 2 μL,dNTP Mixture 2 μL,10 μmol/L 上下游引物各1 μL,5 U/μL rTaq DNA聚合酶 0.2 μL,模板cDNA 1 μL,定量補(bǔ)足ddH2O至20 μL。PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 1 min;94 ℃變性30 s,47 ℃退火30 s,72 ℃延伸 1 min 50 s,共30個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),待檢測(cè)之后,將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行T-A連接(載體PMD19-T Vector),轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a菌株進(jìn)行測(cè)序分析。

    1.4 StNiR基因的生物信息學(xué)分析

    利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST對(duì)馬鈴薯NiR蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析;利用NCBI網(wǎng)站上的CD-search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和InterProScan(http://www.Ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search) 進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè);利用PROSITE軟件 (http://prosite.expasy.org/) 找尋酶活性位點(diǎn);" 利用ExPasy網(wǎng)站的PrptParam軟件對(duì)馬鈴薯NiR蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析;采用在線軟件ExPasy網(wǎng)站上的SOPMA對(duì)馬鈴薯NiR蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),利用SWISS-MODEL進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);利用Wolf-PSORT (https://www.genscript.com/tools/wolf-psort) 在線工具對(duì)NiR蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位;采用MEGA 7.0.14構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

    1.5 StNiR基因的表達(dá)分析

    為了檢測(cè)馬鈴薯StNiR基因在低氮肥脅迫中的表達(dá)情況,將種植于氮肥供應(yīng)充足7.5 mmol/L(對(duì)照)和供應(yīng)不足0.05 mmol/L(低氮肥脅迫)的水培系統(tǒng)中幼苗(4個(gè)生物學(xué)重復(fù))[9-10]培養(yǎng)10 d 后,分別對(duì)葉片和根進(jìn)行取樣提取RNA進(jìn)行基因表達(dá)分析。根據(jù)克隆獲得的StNiR基因序列設(shè)計(jì)出特異性引物:上游引物為5′-T G T C C C A A T A T G T C A C C G C C A A-3′;下游引物5′-T G A A G A A T C C A C C C A C A A G C A G G-3′。馬鈴薯EF1a基因作為內(nèi)參基因,上游引物為5′-C T G T T A A G G A T C T G A A G C G T G G T-3′;下游引物5′- A A T G T G G G A A G T G T G G C A G T C G-3′。微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)在QX200微滴數(shù)字PCR系統(tǒng)(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)上進(jìn)行,程序設(shè)置如下:95 ℃運(yùn)行5 min;然后95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,4 ℃ 5 min,共40個(gè)循環(huán);最后10 ℃保存PCR產(chǎn)物。ddPCR反應(yīng)液的準(zhǔn)備和基因表達(dá)量的計(jì)算參考Niu等的方法[11-12]。此外,將ddPCR的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 馬鈴薯StNiR基因的克隆

    以馬鈴薯Russet Burbank葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示1條大小約為1 800 bp的特異性條帶(圖1),與預(yù)測(cè)的片段大小一致。由測(cè)序結(jié)果可知,StNiR基因的cDNA全長(zhǎng)是1 799 bp。利用NCBI的ORF Finder對(duì)克隆到的馬鈴薯StNiR序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)1個(gè)長(zhǎng)度為1 755 bp的開放閱讀框,共編碼584個(gè)氨基酸(圖2)。

    2.2 馬鈴薯NiR蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

    馬鈴薯NiR蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示, 該

    蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為65 616.26 u,理論等電點(diǎn)為6.67,酸性氨基酸殘基(Asp+Glu)數(shù)為79,堿性氨基酸殘基(Arg+Lys)數(shù)為77,不穩(wěn)定系數(shù)為36.12。利用Expasy ProtScale在線軟件分析顯示,StNiR蛋白質(zhì)序列具有較高的親水性,其中第565位氨基酸的疏水性最強(qiáng)(纈氨酸,2.678),第371位氨基酸的親水性最強(qiáng)(谷氨酸,-3.233),總親水性平均系數(shù)為-0.397。由圖3可知,親水性氨基酸均勻分布在整個(gè)肽鏈中,且多于疏水性氨基酸,因此整個(gè)多肽鏈表現(xiàn)為親水性,由此可見StNiR屬于穩(wěn)定的親水性蛋白。

    2.3 馬鈴薯NiR蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

    使用ExPASy網(wǎng)站上的SOPMA軟件對(duì)馬鈴薯NiR蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果表明,此蛋白

    的主要構(gòu)型為無(wú)規(guī)則卷曲(random coil) 和α螺旋。其中,無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最高,包含有240個(gè)氨基酸,占總氨基酸數(shù)的41.10%;α-螺旋包含有215個(gè)氨基酸,占總氨基酸數(shù)的36.82%。其余為5.31% 的β轉(zhuǎn)角和16.78% 的延伸鏈(圖4)。利用SWISS-MODEL軟件分析得到馬鈴薯NiR氨基酸三級(jí)結(jié)構(gòu),以3b0g.1.A為模板進(jìn)行建模,該模板以X-ray 1.25方法產(chǎn)生,結(jié)果顯示,馬鈴薯NiR與煙草NiR蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)一致性為86.60%(圖5)。從圖5中可以看出該蛋白質(zhì)大部分由α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成,與其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相吻合。

    2.4 馬鈴薯NiR蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析和亞細(xì)胞定位

    結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示,馬鈴薯NiR蛋白序列包含有PLN02431(1~578 aa區(qū)域)即鐵氧還原蛋白亞硝酸還原酶(ferredoxin nitrite reductase) 的保守結(jié)構(gòu)域;NIR_SIR(197~351 aa和457~564 aa區(qū)域)即亞硝酸和亞硫酸鹽還原酶4Fe-4S結(jié)構(gòu)域(Nitrite and sulphite reductase 4Fe-4S domain);CysⅠ(86~580 aa區(qū)域)即血紅素蛋白β亞基結(jié)構(gòu)域[sulfite reductase,beta subunit (hemoprotein) ](圖6)。利用InterProScan和PROSITE 軟件對(duì)馬鈴薯亞硝酸還原酶活性位點(diǎn)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在氨基酸序列區(qū)域502~518 aa的TGCPNTCGQVQVADIGF為StNiR蛋白的主要活性位點(diǎn)(PS00365);還含有2個(gè)西羅血紅素結(jié)合位點(diǎn)(PR00397)分別在458~476 aa和502~520 aa區(qū)域。此外,利用 Wolf-PSORT在線工具對(duì)該蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,StNiR定位于葉綠體的可能性最大。

    2.5 馬鈴薯NiR氨基酸序列同源分析

    利用BlastP對(duì)NiR蛋白進(jìn)行序列同源性比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)馬鈴薯RB品種的NiR在氨基酸水平上與茄科植物的NiR蛋白具有高度相似性(圖7),與潘那利番茄(Solanum pennellii,XP_015089758.1)的一致性為97.77%,與番茄(S. lycopericum,XP_004248736.1)的一致性為97.09%,與曼陀羅(Datura stramonium,MCD9640990.1)一致性為94.86%,與風(fēng)鈴辣椒(Capsicum bacctum,PHT36138.1)的一致性為94.02%,與辣椒(C. annuum,KAF3617369.1)的一致性為93.85%,與煙草(Nicotiana tabacum,NP_001311864.1;XP_016441428.1)的一致性為 93.53%。進(jìn)一步利用 MEGA 7.0.14軟件,采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果顯示,馬鈴薯NiR與茄科植物番茄和潘那利番茄處于同一個(gè)分支上,親緣關(guān)系也較近(圖8)。

    2.6 馬鈴薯NiR基因在低氮肥脅迫和不同組織中的表達(dá)分析

    為了分析馬鈴薯StNiR基因在低氮肥脅迫下和不同組織中的表達(dá)情況,使用微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)對(duì)氮肥供應(yīng)充足和不足條件下的葉片和根的StNiR基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,StNiR基因在根和葉片中均有表達(dá),但是表達(dá)水平不同(圖9)。在氮肥脅迫下根比葉片敏感,該基因的表達(dá)量在根中下調(diào)了1.24倍,在葉片中的表達(dá)量下調(diào)了0.85倍,這可能是由于組織特異性的原因。此外,用ddPCR的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNASeq)結(jié)果進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)ddPCR的表達(dá)量趨勢(shì)與RNA-Seq的結(jié)果一致。

    3 結(jié)論與討論

    本研究從馬鈴薯Russet Burbank中克隆到獲得StNiR基因,開放閱讀框長(zhǎng)度為1 755 bp,共編碼584個(gè)氨基酸。蛋白的相對(duì)分子量為 65 616.26 u,理論等電點(diǎn)為6.67,不穩(wěn)定系數(shù)為36.12,為穩(wěn)定性蛋白,總親水性平均系數(shù)-0.397,預(yù)測(cè)其為親水性蛋白。馬鈴薯StNiR蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含有α螺旋36.82%、β折疊5.31%、延伸16.78%和無(wú)規(guī)則卷曲41.10%。有研究表明,NiR具有亞硝酸還原酶4Fe-4S區(qū)域[7,13],在對(duì)馬鈴薯Russet Burbank的NiR蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)第197~351位和第457~564位氨基酸區(qū)域?qū)儆趤喯跛猁}和亞硫酸鹽還原酶4Fe-4S結(jié)構(gòu)域,第86~580位氨基酸為血紅素蛋白β亞基結(jié)構(gòu)域。此外,活性位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)該馬鈴薯NiR蛋白也包含有2個(gè)西羅血紅素結(jié)合位點(diǎn),說(shuō)明該結(jié)果與前人研究結(jié)果相符。

    系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),馬鈴薯NiR蛋白與潘那利番茄和番茄的相似性均大于97%,與曼陀羅和風(fēng)鈴辣椒的相似性高于94%,與辣椒和煙草的相似性大于93%,說(shuō)明NiR蛋白在茄科植物中高度保守。Mitra等研究發(fā)現(xiàn),NiR蛋白定位在葉片的葉綠體、非綠色組織的質(zhì)體及細(xì)胞膜中[14],本試驗(yàn)利用Wolf-PSORT在線工具對(duì)馬鈴薯NiR蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)該基因存在于葉綠體的可能性最大。此外,本研究數(shù)字微滴式PCR結(jié)果顯示StNiR在葉片和根中都有表達(dá),不管是在正常氮肥供應(yīng)量和低氮肥脅迫下的葉片和根組織中都可以檢測(cè)到其表達(dá)量,這間接說(shuō)明馬鈴薯亞硝酸鹽代謝的場(chǎng)所不僅分布于葉片中,同時(shí)也存在于非綠色組織的質(zhì)體中。研究發(fā)現(xiàn),紅麻HcNiR基因在葉中表達(dá)量明顯高于其在根中的表達(dá)量[15];茶樹亞硝酸還原酶基因CsNiR在成熟葉片、芽、二葉和根中都有表達(dá)[16];白菜亞硝酸還原酶基因葉片中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于根表達(dá)量[17];在橡樹的葉片、根和花等組織中都有檢測(cè)到亞硝酸還原酶基因的表達(dá)[18],這些研究證明了葉和根中確實(shí)都存在亞硝酸還原酶基因的表達(dá)。此外,本研究通過(guò)對(duì)不同氮素(NO-3)量的脅迫條件下馬鈴薯葉片和根進(jìn)行表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)低氮肥脅迫處理后的樣品中亞硝酸還原酶基因的表達(dá)量明顯降低,且數(shù)字微滴式PCR的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。本研究結(jié)果有助于深入研究StNiR基因在馬鈴薯硝態(tài)氮同化過(guò)程中的關(guān)鍵作用,為種質(zhì)資源鑒定和培育氮高效馬鈴薯品種提供理論依據(jù)。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Prasad R,Hochmuth G J. Environmental nitrogen losses from commercial crop production systems in the suwannee river basin of Florida[J]. PLoS One,2016,11(12):e0167558.

    [2]Elrys A S,Abdo A I E,Desoky E S M. Potato tubers contamination with nitrate under the influence of nitrogen fertilizers and spray with molybdenum and salicylic acid[J]. Environmental Science and Pollution Research,2018,25(7):7076-7089.

    [3]石 巖. 食品中亞硝酸鹽過(guò)量的危害與防治[J]. 食品與健康,2006(2):39.

    [4]王子云,詹秀環(huán),郭曉云.不同處理方式對(duì)幾種根莖類蔬菜亞硝酸鹽含量的影響[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,52(21):5268-5271.

    [5]張 雯,何緒生,耿增超,等. 新型生物炭基氮肥對(duì)土壤-冬小麥系統(tǒng)氮素累積及相關(guān)生物活性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2014,33(7):1394-1401.

    [6]王玉琴. 內(nèi)外生理?xiàng)l件對(duì)小麥黃化幼苗葉片亞硝酸還原酶活力的影響[J]. 植物生理學(xué)通訊,1988,24(4):18-20.

    [7]佘茂云,陳朵朵,馮 晨,等. 小麥亞硝酸還原酶基因及調(diào)控序列克隆、定位和表達(dá)分析[J]. 作物學(xué)報(bào),2011,37(1):28-39.

    [8]Davenport S,Maunders M. Production of plants with decreased nitrite content:US20150203858[P]. 2015-07-23.

    [9]Li X Q,Sveshnikov D,Zebarth B J,et al. Detection of nitrogen sufficiency in potato plants using gene expression markers[J]. American Journal of Potato Research,2010,87(1):50-59.

    [10]Sharifi M,Zebarth B J,Coleman W. Screening for nitrogen-use efficiency in potato with a recirculating hydroponic system[J]. Communications in Soil Science and Plant Analysis,2007,38(3/4):359-370.

    [11]Niu S Y,Zhang G D,Li X B,et al. Organelle DNA contents and starch accumulation in potato tubers[J]. Theoretical and Applied Genetics,2019,132(1):205-216.

    [12]唐銳敏. 馬鈴薯熱脅迫響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄組分析及熱激轉(zhuǎn)錄因子

    家族成員的鑒定與功能研究[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2018.

    [13]Swamy U,Wang M T,Tripathy J N,et al. Structure of spinach nitrite reductase:implications for multi-electron reactions by the Iron-Sulfur:siroheme cofactor[J]. Biochemistry,2005,44(49):16054-16063.

    [14]Mitra S K,Gantt J A,Ruby J F,et al. Membrane proteomic analysis of Arabidopsis thaliana using alternative solubilization techniques[J]. Journal of Proteome Research,2007,6(5):1933-1950.

    [15]張 超,鄧 勇,黃思齊,等. 紅麻亞硝酸還原酶基因HcNiR的克隆與表達(dá)分析[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2022,37(5):600-608.

    [16]張 芬,王麗鴛,成 浩,等. 茶樹亞硝酸還原酶基因CsNiR的克隆及表達(dá)分析[J]. 園藝學(xué)報(bào),2016,43(7):1348-1356.

    [17]孫菲菲,蔣芳玲,侯喜林,等. 白菜亞硝酸還原酶基因BcNiR的克隆及表達(dá)分析[J]. 園藝學(xué)報(bào),2009,36(10):1511-1518.

    [18]董軍美. 橡膠樹亞硝酸還原酶基因的克隆及其功能初步鑒定[D]. 海口:海南大學(xué),2011.

    老女人水多毛片| 午夜免费观看性视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 日本三级黄在线观看| 国产在线一区二区三区精| 精品久久久久久久久久久久久| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 高清午夜精品一区二区三区| 亚洲国产av新网站| 一区二区三区四区激情视频| 男人狂女人下面高潮的视频| 搞女人的毛片| 26uuu在线亚洲综合色| 一个人免费在线观看电影| 亚洲精品第二区| 精品一区二区三卡| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 亚洲精品成人久久久久久| 搡老乐熟女国产| 能在线免费观看的黄片| 成人一区二区视频在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 精品午夜福利在线看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 熟妇人妻不卡中文字幕| 久久鲁丝午夜福利片| av网站免费在线观看视频 | 亚洲人成网站在线播| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产有黄有色有爽视频| 超碰97精品在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产精品久久视频播放| 搡老妇女老女人老熟妇| 搡老乐熟女国产| 一级毛片我不卡| 熟女人妻精品中文字幕| 国产精品伦人一区二区| 国产大屁股一区二区在线视频| 久久这里有精品视频免费| 亚洲在久久综合| .国产精品久久| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲av国产av综合av卡| 日本色播在线视频| 最近最新中文字幕免费大全7| 一级a做视频免费观看| 精品久久久久久久久av| 听说在线观看完整版免费高清| 91久久精品国产一区二区成人| 高清欧美精品videossex| 午夜激情欧美在线| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产成人a区在线观看| 欧美日本视频| 国产黄片美女视频| 国产爱豆传媒在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲av福利一区| 一个人免费在线观看电影| 美女cb高潮喷水在线观看| 午夜爱爱视频在线播放| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲三级黄色毛片| 国产成人freesex在线| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美日韩在线观看h| 丰满人妻一区二区三区视频av| 九色成人免费人妻av| 一夜夜www| 欧美+日韩+精品| 久久久欧美国产精品| 欧美最新免费一区二区三区| 欧美精品一区二区大全| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 午夜精品在线福利| 18禁动态无遮挡网站| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 日韩国内少妇激情av| 成年女人看的毛片在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 日韩伦理黄色片| 国产精品三级大全| av卡一久久| 最近的中文字幕免费完整| 内地一区二区视频在线| 中文字幕av在线有码专区| .国产精品久久| av播播在线观看一区| av免费在线看不卡| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲av免费高清在线观看| 99热全是精品| 中文在线观看免费www的网站| 国产欧美日韩精品一区二区| 精品酒店卫生间| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲精品乱久久久久久| 日本免费a在线| 精品欧美国产一区二区三| 国产精品蜜桃在线观看| 免费观看精品视频网站| 国内精品一区二区在线观看| 91久久精品电影网| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲内射少妇av| videossex国产| 色视频www国产| 亚洲在线观看片| 女人久久www免费人成看片| 国产乱人视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 久久午夜福利片| 成人鲁丝片一二三区免费| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲最大成人中文| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲美女视频黄频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 最近手机中文字幕大全| 男人狂女人下面高潮的视频| 午夜免费观看性视频| 99视频精品全部免费 在线| 精品人妻视频免费看| 一级片'在线观看视频| 丝袜美腿在线中文| 韩国av在线不卡| 亚洲在线自拍视频| 国产成人精品福利久久| 久久热精品热| 国产精品久久久久久精品电影| 成人漫画全彩无遮挡| 成年人午夜在线观看视频 | 18+在线观看网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 草草在线视频免费看| 舔av片在线| 亚洲精品日本国产第一区| 中文字幕亚洲精品专区| 成人美女网站在线观看视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久久午夜欧美精品| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 久久精品久久精品一区二区三区| 精品人妻熟女av久视频| 丝袜喷水一区| 成年版毛片免费区| 只有这里有精品99| 国产精品一区二区三区四区久久| 久久韩国三级中文字幕| 久久99热6这里只有精品| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 久久精品人妻少妇| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 干丝袜人妻中文字幕| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲精品456在线播放app| 18+在线观看网站| 国产永久视频网站| 亚洲av免费在线观看| 精品久久久久久久末码| 久久久久久久大尺度免费视频| 免费看不卡的av| 日韩欧美 国产精品| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 精品久久久久久久末码| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 少妇高潮的动态图| eeuss影院久久| 国产精品女同一区二区软件| 国产成人aa在线观看| videos熟女内射| 嘟嘟电影网在线观看| 成年av动漫网址| 91精品一卡2卡3卡4卡| 精品国产露脸久久av麻豆 | 性插视频无遮挡在线免费观看| 干丝袜人妻中文字幕| 中文资源天堂在线| freevideosex欧美| 国产精品三级大全| 国产老妇伦熟女老妇高清| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲经典国产精华液单| 最新中文字幕久久久久| 日韩av在线大香蕉| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产乱人偷精品视频| 国产毛片a区久久久久| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚州av有码| 亚洲高清免费不卡视频| 中文字幕亚洲精品专区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 日本色播在线视频| 亚洲av一区综合| 麻豆乱淫一区二区| 日韩在线高清观看一区二区三区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 男女边吃奶边做爰视频| 能在线免费观看的黄片| 国产欧美日韩精品一区二区| 日韩欧美 国产精品| 亚洲内射少妇av| 久久久久精品性色| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 欧美日韩国产mv在线观看视频 | av在线天堂中文字幕| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产亚洲精品av在线| 亚洲av国产av综合av卡| 综合色av麻豆| 秋霞在线观看毛片| 在线播放无遮挡| 免费高清在线观看视频在线观看| or卡值多少钱| 亚洲精品成人av观看孕妇| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲av一区综合| 超碰97精品在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看 | 麻豆av噜噜一区二区三区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 免费观看a级毛片全部| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲美女搞黄在线观看| 九草在线视频观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 欧美成人a在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| 久久久久久久久久人人人人人人| 婷婷六月久久综合丁香| 能在线免费看毛片的网站| 老女人水多毛片| 三级国产精品欧美在线观看| 一级a做视频免费观看| 午夜激情福利司机影院| 97超碰精品成人国产| 只有这里有精品99| 国产黄片视频在线免费观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 最近中文字幕2019免费版| 黑人高潮一二区| 成人av在线播放网站| 18+在线观看网站| 亚洲自拍偷在线| 91在线精品国自产拍蜜月| 欧美3d第一页| 国内精品一区二区在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 一区二区三区乱码不卡18| 国产成人精品一,二区| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲精品国产成人久久av| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产精品国产三级国产专区5o| 十八禁网站网址无遮挡 | 观看美女的网站| 亚洲国产色片| 亚洲在线自拍视频| 1000部很黄的大片| or卡值多少钱| 极品教师在线视频| 国产熟女欧美一区二区| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲成人久久爱视频| 国产伦理片在线播放av一区| 五月伊人婷婷丁香| 能在线免费看毛片的网站| 欧美一级a爱片免费观看看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 18禁在线播放成人免费| 欧美高清性xxxxhd video| 欧美三级亚洲精品| 欧美另类一区| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产黄片美女视频| 五月玫瑰六月丁香| 超碰97精品在线观看| av福利片在线观看| av免费观看日本| 男插女下体视频免费在线播放| 一级爰片在线观看| 午夜福利高清视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 国产成人免费观看mmmm| 亚洲精品日本国产第一区| 日韩在线高清观看一区二区三区| 日韩中字成人| 高清毛片免费看| 免费观看av网站的网址| 97在线视频观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 一本色道久久久久久精品综合| a 毛片基地| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 多毛熟女@视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲成色77777| 国产男女内射视频| 日韩一区二区三区影片| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 日韩精品有码人妻一区| 丰满少妇做爰视频| 欧美97在线视频| 国产精品成人在线| 久久精品国产综合久久久| 男人添女人高潮全过程视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 99国产精品免费福利视频| 在线观看国产h片| 久久婷婷青草| 男女高潮啪啪啪动态图| 热99久久久久精品小说推荐| 国产精品一区二区在线不卡| 考比视频在线观看| 精品一区在线观看国产| a级片在线免费高清观看视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 2018国产大陆天天弄谢| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 一个人免费看片子| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 99久久人妻综合| 久久久久精品久久久久真实原创| 久久久久久人妻| 最黄视频免费看| 晚上一个人看的免费电影| 国产精品无大码| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产黄色免费在线视频| 久久久精品区二区三区| 免费观看a级毛片全部| 亚洲成人一二三区av| 国产黄频视频在线观看| 久热久热在线精品观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 老熟女久久久| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 男女午夜视频在线观看| 各种免费的搞黄视频| 老女人水多毛片| 最近最新中文字幕免费大全7| 男女午夜视频在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲中文av在线| 精品久久蜜臀av无| 亚洲成人一二三区av| 成人手机av| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 三级国产精品片| av在线观看视频网站免费| 少妇熟女欧美另类| 日本av免费视频播放| 亚洲精品中文字幕在线视频| 最黄视频免费看| 18禁观看日本| 极品人妻少妇av视频| 亚洲图色成人| 中文字幕色久视频| 人妻 亚洲 视频| 97在线视频观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 黑人猛操日本美女一级片| 人妻 亚洲 视频| 多毛熟女@视频| 国产不卡av网站在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产毛片在线视频| 久久97久久精品| 五月开心婷婷网| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲欧美一区二区三区久久| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 婷婷成人精品国产| 国产一区二区在线观看av| 老熟女久久久| av片东京热男人的天堂| 久久狼人影院| 中国国产av一级| 午夜福利,免费看| 91在线精品国自产拍蜜月| 美女高潮到喷水免费观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 一区福利在线观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 高清不卡的av网站| 一区福利在线观看| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 欧美精品一区二区大全| 高清不卡的av网站| 1024香蕉在线观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产一级毛片在线| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲国产最新在线播放| 久久av网站| 色哟哟·www| 老女人水多毛片| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 少妇人妻精品综合一区二区| 天堂中文最新版在线下载| 国产精品女同一区二区软件| 一个人免费看片子| 欧美日韩一级在线毛片| 黄色视频在线播放观看不卡| 欧美最新免费一区二区三区| 日本av手机在线免费观看| 亚洲人成网站在线观看播放| av片东京热男人的天堂| 久久精品夜色国产| 国产成人精品在线电影| 欧美精品av麻豆av| 国产一区有黄有色的免费视频| 制服诱惑二区| 国产黄色视频一区二区在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 看免费av毛片| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产精品免费大片| 久久久久久久亚洲中文字幕| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 亚洲人成77777在线视频| xxxhd国产人妻xxx| 日韩在线高清观看一区二区三区| 午夜激情久久久久久久| 精品亚洲成国产av| 亚洲国产av新网站| 18禁观看日本| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 国产精品国产三级国产专区5o| 欧美精品一区二区大全| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产男女超爽视频在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 另类亚洲欧美激情| 一级片'在线观看视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 少妇人妻 视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 超色免费av| 在线免费观看不下载黄p国产| 成年美女黄网站色视频大全免费| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 女性生殖器流出的白浆| 日本av手机在线免费观看| 黄片小视频在线播放| 男女国产视频网站| 成年女人在线观看亚洲视频| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲少妇的诱惑av| 日本wwww免费看| 成年av动漫网址| 欧美日韩精品成人综合77777| 青春草国产在线视频| 日韩人妻精品一区2区三区| www日本在线高清视频| 人体艺术视频欧美日本| 色播在线永久视频| 久久久国产精品麻豆| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 国产熟女欧美一区二区| 午夜日韩欧美国产| 90打野战视频偷拍视频| 国产1区2区3区精品| 精品酒店卫生间| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲精品美女久久av网站| 黑人欧美特级aaaaaa片| 尾随美女入室| 久久综合国产亚洲精品| 久久av网站| 国产一区二区 视频在线| 宅男免费午夜| 在线观看国产h片| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产不卡av网站在线观看| 国产视频首页在线观看| 成年动漫av网址| 日韩av免费高清视频| 男女无遮挡免费网站观看| 久久久国产一区二区| 亚洲国产看品久久| 亚洲精品国产一区二区精华液| 久久狼人影院| www.精华液| 一区二区日韩欧美中文字幕| 欧美国产精品一级二级三级| 国产又色又爽无遮挡免| www.熟女人妻精品国产| 国产又色又爽无遮挡免| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲,欧美精品.| 久久久久久久久免费视频了| 国产探花极品一区二区| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产欧美亚洲国产| 一区二区三区四区激情视频| 黄色一级大片看看| 国产成人免费无遮挡视频| 国产成人精品在线电影| 亚洲欧美一区二区三区久久| 欧美激情高清一区二区三区 | 少妇 在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产乱来视频区| 中文欧美无线码| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 一区在线观看完整版| 久热久热在线精品观看| 99热国产这里只有精品6| 久久久久久人妻| 日本vs欧美在线观看视频| 丁香六月天网| 国产男人的电影天堂91| 在线观看免费视频网站a站| 男女国产视频网站| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 亚洲精品成人av观看孕妇| av在线观看视频网站免费| 国产精品久久久久久精品古装| 哪个播放器可以免费观看大片| 中文字幕亚洲精品专区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 91成人精品电影| 啦啦啦在线观看免费高清www| 午夜免费观看性视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产精品二区激情视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 夫妻性生交免费视频一级片| av电影中文网址| 国产成人精品无人区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 欧美精品一区二区免费开放| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 中国三级夫妇交换| 久久婷婷青草| 两个人看的免费小视频| 不卡视频在线观看欧美| 99久久综合免费| 午夜福利在线观看免费完整高清在| av女优亚洲男人天堂| av在线观看视频网站免费| 999久久久国产精品视频| 桃花免费在线播放| 美女中出高潮动态图| 成人影院久久| 精品少妇黑人巨大在线播放| 美女福利国产在线| 熟女电影av网| 欧美日韩精品网址| 在线观看免费日韩欧美大片| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久这里只有精品19| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲欧洲日产国产| 国产成人一区二区在线| 毛片一级片免费看久久久久| 久久久久久久久久人人人人人人| 在现免费观看毛片| 欧美日韩成人在线一区二区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 精品午夜福利在线看| 亚洲视频免费观看视频| 一区二区三区四区激情视频| 国产av精品麻豆| 下体分泌物呈黄色| 亚洲美女黄色视频免费看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 日韩三级伦理在线观看| 久久这里有精品视频免费| 黄片播放在线免费| 波野结衣二区三区在线| 男人爽女人下面视频在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 午夜精品国产一区二区电影| 一级毛片 在线播放| 赤兔流量卡办理| 国产成人免费无遮挡视频| 免费观看在线日韩| 少妇熟女欧美另类| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 两个人免费观看高清视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲成色77777|