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    高效解磷菌RL-7的鑒定、解磷能力及促生效應(yīng)

    2024-08-23 00:00:00馬連杰張慧尹學(xué)偉盧文才胡留杰廖敦秀
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2024年14期
    關(guān)鍵詞:鑒定根際乙酸

    摘要:解磷菌能夠提高土壤中有效磷供給,減少磷肥施用量,促進(jìn)植物生長。本研究以筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期分離的高解磷菌RL-7為研究對象,利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定菌株種屬,采用正交試驗(yàn)法明確菌株在不同初始pH值、培養(yǎng)溫度和接種量等培養(yǎng)條件下的解磷特性,通過高效液相色譜法檢測菌株發(fā)酵液中乙酸產(chǎn)生量,測定菌株產(chǎn)IAA能力和對番茄苗的促生效果。結(jié)果顯示,高解磷菌株RL-7為克雷伯氏菌(Klebsiella sp.),該菌株在溫度35 ℃、初始接種量3%、pH值7.0的條件下,溶磷量最高,達(dá)537.34 mg/L。不同的培養(yǎng)條件下,發(fā)酵液pH值均在4.23~4.67之間。菌株具有產(chǎn)乙酸能力,發(fā)酵液中乙酸含量達(dá)1.14 g/L。在不添加色氨酸和添加色氨酸LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),IAA濃度分別為24.13 μg/mL和110.90 μg/mL。在番茄苗促生試驗(yàn)中,株高、莖粗、地上部鮮重和地下部鮮重與對照差異顯著,且番茄苗中全磷含量明顯高于對照。說明高解磷菌RL-7具有較高的解磷能力,同時(shí)具備產(chǎn)IAA能力,能夠很好地促進(jìn)番茄苗期生長。

    關(guān)鍵詞:根際;解磷菌;鑒定;條件優(yōu)化;乙酸;促生

    中圖分類號(hào):S182 "文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號(hào):1002-1302(2024)14-0280-05

    收稿日期:2023-08-15

    基金項(xiàng)目:重慶市農(nóng)業(yè)發(fā)展資金項(xiàng)目(編號(hào):cqaas2023sjczqn029、cqaas2023sjczhx004);重慶市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào):CSTB2022NSCQ-MSX0508)。

    作者簡介:馬連杰(1982—),女,河北易縣人,碩士,助理研究員,主要從事肥效微生物和生防微生物開發(fā)利用研究。E-mail:malianjie_0816@163.com。

    通信作者:廖敦秀,研究員,主要從事植物保護(hù)和農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用研究。E-mail:664852751@qq.com。

    磷是植物生長必需的三大元素之一,在光合碳循環(huán)、信號(hào)傳導(dǎo)等過程中起關(guān)鍵作用[1]。我國74%以上的耕地土壤缺磷,僅有0.1%的有效磷可供植物吸收利用[2]。為避免磷素缺乏對糧食增產(chǎn)的制約,每年對耕地施用大量磷肥;但大部分磷進(jìn)入土壤后,易與Fe3+、Al3+等金屬離子結(jié)合為難溶性磷酸鹽形態(tài)[3],導(dǎo)致磷素利用率較低,造成了大量的浪費(fèi)。

    解磷菌(phosphate solubilizing microorganism,PSM)是一類具有解磷效果的微生物,能夠?qū)㈦y溶性磷轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的有效磷,對土壤中磷素形態(tài)具有重要的影響[4-6]。目前報(bào)道的解磷菌包含細(xì)菌、真菌和放線菌,共20多個(gè)屬。其中種類和數(shù)量最多的為細(xì)菌,如芽孢桿菌屬、歐文氏菌屬、假單胞菌屬、伯克氏菌屬、腸細(xì)菌屬、微球菌屬、根瘤菌屬、土壤桿菌屬、色桿菌屬、黃桿菌屬等[7]。解磷菌主要通過分泌葡萄糖酸、乙酸、草酸及檸檬酸等有機(jī)酸溶解無機(jī)磷,通過分泌堿性和酸性磷酸酶分解有機(jī)磷[8-9]。目前,一些解磷菌已經(jīng)制成生物肥料應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,能夠顯著促進(jìn)植物生長,提高產(chǎn)量的同時(shí)降低了化學(xué)磷肥的投入[10-13]。本研究對前期從玉米根際土壤中分離篩選得到的1株高效解磷克雷伯氏菌RL-7,進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,并對其解磷條件進(jìn)行優(yōu)化,并通過番茄苗促生試驗(yàn)驗(yàn)證該菌株的促生效果,以期為其在生物肥料的研發(fā)提供微生物資源和理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    1.1.1 供試菌株

    菌株RL-7為前期通過透明圈篩選法,從玉米根際土中獲得。試驗(yàn)于2020—2022年在重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院開展。

    1.1.2 供試培養(yǎng)基

    LB液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨 10 g,酵母浸粉5 g,NaCl 10 g,蒸餾水定容至1 000 mL。LB固體培養(yǎng)基在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉 15~20 g,121 ℃滅菌20 min備用。

    NBRIP液體培養(yǎng)基:葡萄糖10 g,Ca3(PO4)2 5 g,MgCl2·6H2O 5 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.25 g,KCl 0.2 g,(NH4)2SO4 0.1 g,蒸餾水定容至1 000 mL,121 ℃滅菌20 min備用。

    PKO固體培養(yǎng)基:葡萄糖10 g,Ca3(PO4)2 5 g,(NH4)2SO4 0.5 g,NaCl 0.2 g,KCl 0.2 g,MgSO4·7H2O 0.3 g,MnSO4 0.03 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g,酵母膏0.5 g,瓊脂15~20 g,蒸餾水1 000 mL,pH值6.8~7.0。121 ℃滅菌20 min備用。

    1.1.3 供試試劑與設(shè)備

    PCR 擴(kuò)增用試劑購自寶生物工程(大連)有限公司,DNA 細(xì)菌提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司,PCR儀購自 BIO-RAD 公司。

    1.1.4 供試種子

    番茄種子:渝粉8號(hào),重慶科光種苗有限公司生產(chǎn)。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 菌株的鑒定

    在LB固體平板上進(jìn)行菌株純化,在PKO固體培養(yǎng)基上觀測RL-7菌株產(chǎn)生的透明圈及單菌落形態(tài)特征,同時(shí)利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行初步鑒定。采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA,采用16S rDNA基因通用引物27F/1492R進(jìn)行目的片段擴(kuò)增,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送至重慶崇浩生物技術(shù)有限公司進(jìn)行基因測序。測序片段結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對分析,同時(shí)利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.2.2 解磷條件優(yōu)化

    采用正交試驗(yàn)方法,設(shè)置接種量、起始pH值和培養(yǎng)溫度3個(gè)因素,每個(gè)因素設(shè)置4個(gè)水平,詳見表1。接種量梯度設(shè)置為2%、3%、4%和5%,培養(yǎng)溫度梯度設(shè)置為25、30、35、40 ℃,起始pH值梯度設(shè)置為5、6、7和8,每個(gè)處理3次重復(fù)。采用NBRIP培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株,培養(yǎng)基滅菌冷卻后在超凈臺(tái)內(nèi)調(diào)節(jié)起始pH值。原始菌株在LB液體培養(yǎng)中培養(yǎng)36 h后利用紫外分光光度計(jì)測定菌液濃度,調(diào)節(jié)菌液濃度至D600 nm=1.0。按照設(shè)計(jì)的接種量轉(zhuǎn)接原始菌液至NBRIP培養(yǎng)基中,在轉(zhuǎn)速為160 r/min的搖床中培養(yǎng)7 d后,菌液在4 ℃、8 000 r/min 離心 10 min,棄沉淀,收集上清液,利用鉬銻抗比色法測定可溶性磷含量,同時(shí)測定上清液的pH值。

    1.2.3 菌株產(chǎn)酸特性

    將菌株接種至在NBRIP液體培養(yǎng)基中,在30 ℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)48 h后,10 000 r/min離心15 min后收集上清液,用 0.22 μm 水系膜過濾,收集過濾后的上清液,參照高威等的方法[14],利用液相色譜測定培養(yǎng)液中乙酸含量。

    1.2.4 菌株產(chǎn)IAA能力

    共設(shè)置3個(gè)處理,對照、RL-7(N)、RL-7(Y)。對照為不加菌不加色氨酸處理,RL-7(N)為加菌不加色氨酸處理,RL-7(Y)為加菌加色氨酸處理。每個(gè)處理3次重復(fù)。取0.3 mL菌原液加入裝有30 mL不同處理培養(yǎng)基的三角瓶中。30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后離心,每瓶取1 mL上清液轉(zhuǎn)移至2 mL EP管中備用。然后在每管中加入等量S2比色液,室溫黑暗靜置 30 min 后用紫外分光光度計(jì)在530 nm處測定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各菌株的IAA分泌量。

    標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:配制濃度為0、3、6、9、12、15 μg/mL 的生長素標(biāo)準(zhǔn)溶液,各取1 mL加入等量的S2比色液,于黑暗中靜置反應(yīng)30 min后用紫外分光光度計(jì)在530 nm處測定吸光度。利用測定數(shù)據(jù)在Excel軟件中制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.2.5 番茄苗期促生效果

    將培養(yǎng)好的RL-7菌液在4 ℃、6 000 r/min離心10 min后,倒掉上清,用滅菌水清洗菌體2次,最后用無菌水稀釋獲得 107 CFU/mL 的菌液。購買商用育苗基質(zhì),育苗前 1 d 按5%比例將菌液加至基質(zhì)中拌勻,整個(gè)育苗過程不再添加菌液,不施用其他肥料。設(shè)計(jì)空白對照,以無菌水代替菌液。育苗結(jié)束后隨機(jī)選取對照和添加菌液處理各10株,對番茄株高、莖粗、地上(下)部鮮重和葉綠素含量(SPAD值)等生長指標(biāo),水分、全氮、全磷和全鉀含量等養(yǎng)分指標(biāo)進(jìn)行測定。

    1.3 數(shù)據(jù)測定與分析處理

    所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel、MEGA和SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 RL-7菌株平板解磷效果

    RL-7菌株純化后,在PKO無機(jī)磷平板上培養(yǎng)2 d后,有明顯透明圈出現(xiàn),單菌落呈圓形,米黃色、表面光滑、邊緣整齊、中間凸起,挑起有粘連、略透明(圖1)。

    2.2 RL-7菌株分子生物學(xué)鑒定

    利用通用引物27F和1492R對解磷菌株RL-7

    基因組進(jìn)行16S序列擴(kuò)增,獲得1 410 bp長度序列。通過NCBI數(shù)據(jù)庫中序列比對,結(jié)果顯示,RL-7菌株與Klebsiella sp.同源性達(dá)99%。同時(shí)利用MEGA 7.0軟件根據(jù)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2),結(jié)合平板形態(tài),將RL-7菌株初步鑒定為克雷伯氏菌。

    2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

    最適發(fā)酵條件結(jié)果見表2,可以看出,最優(yōu)條件下RL-7菌株最大溶磷量達(dá)537.34 mg/L,對應(yīng)發(fā)酵條件為溫度35 ℃,接種量3%,初始pH值7。從極差(R)來看,對發(fā)酵結(jié)果影響最大的因素為溫度,

    R為97.80;其次為接種量,R為78.92;最后為初始pH值,R為31.45。故最適發(fā)酵溫度為35 ℃左右。同時(shí)對發(fā)酵后上清液的pH值進(jìn)行了測定,可以看到pH值范圍在4.23~4.67之間,初步判定發(fā)酵液pH值與初始pH值關(guān)聯(lián)不大,同時(shí)相應(yīng)

    條件下對照pH值在6.71~7.45之間。發(fā)酵液呈明顯酸性,推測溶磷作用可能與產(chǎn)生有機(jī)酸有關(guān)。

    2.4 產(chǎn)乙酸能力

    通過高效液相色譜手段檢測RL-7菌株發(fā)酵上清液中乙酸含量,結(jié)果如圖3所示,在5.0 min處出現(xiàn)最高峰,此峰為乙酸的出峰位點(diǎn)。根據(jù)出峰面積計(jì)算,發(fā)酵液中乙酸含量為1.14 g/L,說明RL-7菌株能夠分泌較高含量的乙酸。初步推斷分泌有機(jī)酸為RL-7解磷菌的主要解磷方式。

    2.5 產(chǎn)IAA能力

    RL-7菌株在不添加色氨酸和添加色氨酸LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)均具有產(chǎn)IAA能力,產(chǎn)IAA濃度分別為24.13、 110.90 μg/mL(表3)。 添加色氨酸后大大提升了產(chǎn)IAA能力,具有潛在促生能力。

    2.6 苗期促生效果

    在番茄育苗試驗(yàn)中,添加RL-7菌株的基質(zhì)表現(xiàn)出明顯的促生效果(圖4)。由表4可知,相較于

    對照,菌液處理的番茄苗株高、莖粗、地上部鮮重和地下部鮮重差異顯著,分別比對照增加8.77%、20.44%、73.42%和50.00%。葉綠素含量在兩者之間沒有明顯差異,僅比對照增加0.16%。

    2.7 菌株RL-7對番茄植株養(yǎng)分含量的影響

    對番茄苗地上部分樣品水分、全氮、全磷和全鉀指標(biāo)測定結(jié)果見表5, 菌液處理番茄苗全磷含量達(dá)6.26 g/kg,為對照的1.20倍,其他指標(biāo)變化不明顯。說明解磷菌RL-7的施用能夠提升植株中全磷的含量。

    3 討論

    解磷微生物種類繁多,目前發(fā)現(xiàn)的主要有芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬、沙雷氏菌屬等[15],但具有高效解磷效果的菌種資源仍非常有限。本研究篩選獲得的RL-7菌株為克雷伯氏菌,最優(yōu)條件下解磷量為537.34 mg/L,相較于先前報(bào)道的解磷菌解磷能力處于較高水平。萬水霞等分離得到的2株優(yōu)良PGPR菌株CH07和FD11,其溶磷量分別為368.5 mg/L和321.5 mg/L[16]。于淼對解磷菌623-3培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)在最優(yōu)條件下,其解磷量為420.953 mg/L[17]。唐岷宸等發(fā)現(xiàn)1株高效解磷菌貝萊斯芽孢桿菌,其溶磷量達(dá)495.4 mg/L[14]。陳容彬等獲得的伯克霍爾德菌PB在優(yōu)化培養(yǎng)條件后,溶磷量為569.33 mg/L[18]。選用3因素4水平正交試驗(yàn)分析pH值、溫度和接菌量對 RL-7 菌株溶磷能力的影響,明確了3個(gè)因素的影響程度和水平,對后期菌株的應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。

    解磷菌次生代謝產(chǎn)物中是否含有IAA在研究中也備受關(guān)注。IAA具有能夠直接促進(jìn)植物生長的作用,解磷菌RL-7 具有產(chǎn)IAA能力,分泌量為24.13 μg/mL,大部分解磷細(xì)菌的解磷作用與其代謝產(chǎn)物中的低分子有機(jī)酸密切相關(guān)。這些有機(jī)酸能夠與Ca+、Mg+、Fe+等陽離子結(jié)合釋放出磷酸根離子,同時(shí)能夠降低環(huán)境pH值,促進(jìn)難溶性磷酸鹽的溶解[19]。RL-7菌株代謝產(chǎn)物中乙酸含量達(dá)1.14 g/L,與其他文獻(xiàn)中的解磷菌株[20-21]相比,分泌量較高。但乙酸是否為該菌株解磷的主要有機(jī)酸,還有哪些種類的有機(jī)酸參與,有待進(jìn)一步研究。另外菌株發(fā)酵后pH值下降明顯,且與初始培養(yǎng)基pH值無關(guān)聯(lián)性。當(dāng)初始pH值分別為5、6、7、8時(shí),發(fā)酵后pH值均在4.23~4.67之間。pH值的大幅降低推測分泌有機(jī)酸是該菌株解磷的主要途徑,但仍需下一步研究驗(yàn)證。

    為驗(yàn)證RL-7菌株的實(shí)際應(yīng)用效果,選擇育苗基質(zhì)中按5%的比例添加菌株的方法,測定該菌株對番茄苗期株高、莖粗、地上部鮮重和地下部鮮重均有明顯促進(jìn)作用。另外,番茄地上部植株內(nèi)全磷含量相比于對照有明顯增加,但本研究未對基質(zhì)有效磷的含量以及磷的具體去向進(jìn)行分析,可在后續(xù)研究中開展。

    4 結(jié)論

    本研究篩選得到1株具有高效解磷能力的細(xì)菌菌株RL-7,經(jīng)鑒定為克雷伯氏菌。該菌株在溫度35 ℃、初始接菌量3%、pH值7.0的最適條件下,溶磷量為537.34 mg/L。該菌具有產(chǎn)大量乙酸的能力,分泌有機(jī)酸可能是其主要解磷途徑。添加該菌的育苗基質(zhì)能夠促進(jìn)番茄苗的生長和番茄植株內(nèi)磷素的積累。

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