應(yīng)用高分辨質(zhì)譜實時分析方法研究口呼氣和鼻呼氣有機組分的存在特征

關(guān)鍵詞二次電噴霧電離；揮發(fā)性有機物；口呼氣；鼻呼氣

人體呼氣中含有大量揮發(fā)性有機物（Volatileorganiccompounds，VOCs），其中包括通過血氣交換經(jīng)肺部釋放的機體組織細(xì)胞新陳代謝產(chǎn)物[1]，或來自人體暴露的環(huán)境空氣。因此，呼氣可反映人體系統(tǒng)代謝過程的信息[2]或環(huán)境暴露信息[3]，對呼吸成分的分析在臨床診斷和環(huán)境暴露等生命健康領(lǐng)域具有重要意義。人體呼氣樣本的類型可分為口呼氣或鼻呼氣，由于口呼采樣更易實現(xiàn)[4]，因此相關(guān)研究更為廣泛。但是，在采集口呼氣和鼻呼氣樣品過程中，口腔和鼻腔內(nèi)的物質(zhì)顯然會影響呼出氣組分，因此深入研究口呼和鼻呼得到的呼氣樣品的成分組成，對不同研究選擇合適的采樣方式具有重要的實用意義。近年來，也有學(xué)者對口呼氣與鼻呼氣的組分差異進行了靶標(biāo)分析。Wang等[5]采用選擇離子流動管質(zhì)譜（Selectedionflowtubemassspectrometry，SIFT-MS）對3名健康受試者的呼氣組分進行了靶標(biāo)分析，發(fā)現(xiàn)異戊二烯、丙酮和甲醇的含量在人體口呼氣和鼻呼氣中基本相當(dāng)，而氨、乙醇和氰化氫在鼻呼氣中的含量遠(yuǎn)低于口呼氣。Slingers等[4]采用SIFT-MS對人體口呼氣與鼻呼氣中的9種VOCs進行靶標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)，口呼氣中乙醛、丙醇、2，3-丁二酮、異戊二烯和戊烷的濃度與鼻呼氣存在顯著差異；進一步通過線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，這9種VOCs在口呼氣和鼻呼氣內(nèi)的含量存在顯著相關(guān)性，表明這些VOCs在鼻呼氣和口呼氣中的存在特征相似。然而，目前人體呼氣中被檢出的VOCs有上千種[6]，但基于呼氣代謝組非靶標(biāo)分析探究口呼氣和鼻呼氣有機組分的差異性的研究未見報道。

相較于傳統(tǒng)的氣相色譜-質(zhì)譜（Gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）離線分析技術(shù)，實時在線質(zhì)譜分析技術(shù)可有效降低呼氣樣品采集、儲存和預(yù)處理過程中導(dǎo)致的變質(zhì)概率，避免呼氣組分損耗[7]。在人體呼出氣研究領(lǐng)域，質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜（Protontransferreactionmassspectrometry，PTR-MS）和SIFT-MS是較早也較為常用的呼氣分析直接質(zhì)譜技術(shù)，而二次電噴霧電離質(zhì)譜（Secondaryelectrosprayionization-massspectrometry，SESI-MS）是相對較新的直接質(zhì)譜技術(shù)[8]，可在常溫常壓環(huán)境下實時在線電離氣態(tài)化合物，其離子化過程可簡述為溶劑通過電噴霧離子化（Electrosprayionization，ESI）產(chǎn)生電噴霧云，電噴霧云與氣態(tài)樣品混合，使分析物形成分子離子進入到質(zhì)譜儀內(nèi)檢測。相較于SIFT和PTR，SESI離子源與高分辨質(zhì)譜（Highresolutionmassspectrometry，HRMS）耦合使用的方法具有更高的質(zhì)量分辨率和更低的檢出限（Limitofdetection，LOD），特別適合檢測呼氣中復(fù)雜的痕量有機組分[8-10]。

本研究以人體呼氣中9種典型VOCs為檢測對象，采用SESI-HRMS建立9種VOCs的定量分析方法（見圖1）。以實際復(fù)雜呼氣樣品為檢測對象，分別采用靶標(biāo)與非靶標(biāo)分析策略，探究了口呼氣組分與鼻呼氣組分之間的差異，以期為不同應(yīng)用場景選擇適宜的呼氣采樣方式提供依據(jù)。

1實驗部分

1.1儀器、試劑與材料

QExactiveTM四極桿組合靜電場軌道阱傅里葉變換超高分辨質(zhì)譜儀（美國賽默飛公司）；Luna-3000SESI離子源（廣東智普生命科技有限公司）；Model2010氣體稀釋校準(zhǔn)儀（美國Sabio公司）；D07-19質(zhì)量流量控制器（Massflowcontroller（MFC）量程5L/min，北京七星華創(chuàng)流量計有限公司）；GilianGilibrator2皂泡流量計（美國Sensidyne公司）。

混合標(biāo)準(zhǔn)氣體（組分及濃度詳見電子版文后支持信息表S1，純度≥98%，大連大特氣體有限公司）；N2標(biāo)準(zhǔn)氣體（純度≥99.999%，廣州廣氣氣體有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)校正液（美國賽默飛公司）；0.1%甲酸溶液（液相色譜級，德國默克公司）。石英毛細(xì)管噴針（內(nèi)徑20μm和50μm，西班牙Fossiliontech公司）；口、鼻呼氣采樣接頭（廣東智普生命科技有限公司）；KQB2T08-00金屬T型快插接頭（日本SMC公司）；不銹鋼二通球閥（內(nèi)徑6mm，北京熊川閥門制造有限公司）；特氟龍管（內(nèi)徑6mm，泰州純仕新材料有限公司）；特氟龍?zhí)祭w維加熱帶（70℃，230W，淄博星恒電器科技有限公司）。

1.2實驗方法

1.2.1定量分析方法的建立

本研究選擇9種VOCs建立定量分析方法，主要基于其具有的應(yīng)用價值。其中，2-丁酮和2-戊酮被認(rèn)為是肺癌的潛在生物標(biāo)志物[11-12]，乙酸乙酯是硅肺的潛在生物標(biāo)志物[13]，異戊二烯和檸檬烯可分別反映急性組織損傷狀態(tài)[14]和人體肝臟代謝情況[15]，甲基丙烯酸甲酯以及3種苯系物被認(rèn)為是反映環(huán)境暴露情況的重要依據(jù)和指標(biāo)[16-18]。參考人體呼氣中9種典型呼氣VOCs的濃度范圍[16，19-20]，共設(shè)置14個標(biāo)準(zhǔn)氣體濃度梯度（見電子版文后支持信息表S2）。由于受到氣體稀釋校準(zhǔn)儀稀釋倍數(shù)的限制，依次選用低、高濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)氣體，通過高純N2配制目標(biāo)濃度的標(biāo)準(zhǔn)氣體。利用特氟龍管將氣體稀釋校準(zhǔn)儀分別與高純度N2鋼瓶（稀釋氣體）和混合標(biāo)準(zhǔn)氣體鋼瓶連接，氣體稀釋校準(zhǔn)儀出氣流速設(shè)置為1.9L/min，實驗時按照濃度由低到高的順序依次改變配氣程序。14個梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)氣體樣品先經(jīng)過呼氣采樣裝置（管路加熱至70℃），再經(jīng)SESI源電離后，連續(xù)進入質(zhì)譜進行分析。每個梯度濃度進樣時間持續(xù)3～5min，實驗裝置如圖2所示。此外，為提高電離效率，降低環(huán)境空氣對VOCs檢測的影響，采用N2作為源內(nèi)氛圍氣[21]。采用特氟龍管與廢氣管道連接，防止多余標(biāo)準(zhǔn)氣體泄露到實驗室環(huán)境中。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果，選擇適宜濃度，考察9種VOCs日內(nèi)（n=6）和日間（n=18）相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），評估方法的穩(wěn)定性。

1.2.2呼氣樣品采集

選擇9名（5名男性，4名女性，年齡23～28歲）無吸煙史的健康受試者提供呼氣樣本。有研究表明，受試者體位的改變將引起人體血流動力學(xué)和肺部通氣與血流灌注比值發(fā)生變化，進而導(dǎo)致呼氣VOCs濃度發(fā)生變化[22]，因此，本研究要求所有受試者均采用靜坐的方式采集呼氣樣品。為減少呼氣吹嘴材質(zhì)對呼氣組分的影響，采用同種材料制成的鼻呼氣和口呼氣采樣吹嘴，接于MFC-1前端的特氟龍管上，以便采集受試者的鼻呼氣和口呼氣樣本。對進樣管路加熱至70℃，以防止呼氣內(nèi)的水蒸汽冷凝在管壁上。

為保證呼氣數(shù)據(jù)的有效性，受試者按照以下標(biāo)準(zhǔn)程序提供呼出氣樣品：（1）在呼出氣測試前1h內(nèi)，不進行高強度體育運動，不進食，不喝飲料（水除外），不刷牙，不嚼口香糖，不涂唇膏或口紅，不噴香水等[7]；（2）在開始采樣前采用純凈水漱口3次，再提供呼出氣樣品；（3）對每位受試者重復(fù)采集呼氣6次，每次呼氣間隔約15s。本研究已得到暨南大學(xué)附屬醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

1.3SESI-HRMS分析方法

SESI源：在密封溶液瓶施加0.146MPa壓力，并對ESI溶液加高壓電，0.1%甲酸溶液通過內(nèi)徑為50μm的石英毛細(xì)管并轉(zhuǎn)接至內(nèi)徑為20μm的石英毛細(xì)管噴針穩(wěn)定釋放。

HRMS：將質(zhì)譜端控制的鞘氣設(shè)置為50，提供ESI溶液瓶內(nèi)的高壓；離子傳輸管溫度設(shè)置為275℃；噴霧電壓設(shè)置為+3.5kV（正離子模式）/–3.5kV（負(fù)離子模式）；掃描方式為全掃描，質(zhì)量范圍為m/z60～500；分辨率（R）為140000。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用Igor6.3.7.2軟件計算9種VOCs被質(zhì)譜檢測的平均響應(yīng)強度及標(biāo)準(zhǔn)偏差，Origin2017軟件用于繪制圖形以及計算靈敏度（Sensitivity，S）和相關(guān)系數(shù)（R2）。LOD和定量限（Limitofquantitation，LOQ）分別按照3×σ/S和10×σ/S原則進行計算，其中，σ代表空白樣本中各VOCs分子離子信號峰處的儀器背景噪音的標(biāo)準(zhǔn)偏差[23]。

利用軟件MSConvert[24]將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)文件格式“.Raw”轉(zhuǎn)換為“.MZxml”，再采用Python程序BreathFinder（https：//github.com/WanyangSun/BreathFinder）提取質(zhì)譜數(shù)據(jù)，將響應(yīng)強度≥1×105a.u.的離子對應(yīng)的m/z、掃描時間點及該時間點的響應(yīng)強度三類數(shù)據(jù)形成數(shù)據(jù)矩陣，再將其導(dǎo)入Matlab（R2020a），采用Clustergram算法[25]進行層次聚類分析，生成熱圖，找出離子響應(yīng)信號強度隨呼氣進樣時間上升的成分。本研究采用誤差校正工具NEAPOLIS（http：//bioinformatica.isa.cnr.it/NEAPOLIS/），設(shè)置出現(xiàn)頻數(shù)≥4的成分才能被提取，并將質(zhì)量偏差在2ppm（10–6）以內(nèi)的呼氣成分認(rèn)定為同一成分。利用Evenn網(wǎng)上在線繪制Venn圖[26]，并采用MetaboAnalyst5.0[27]對口呼氣與鼻呼氣組分進行火山分析，以差異倍數(shù)（Foldchange，F(xiàn)C）gt;1.5、plt;0.05作為統(tǒng)計分析參數(shù)，篩選口呼氣與鼻呼氣中存在顯著性差異的成分，采用人類代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫[28]（Humanmetabolomedatabase，HMDB）進行初步定性分析，并采用自編Matlab算法以質(zhì)量偏差最小為規(guī)則確定該成分對應(yīng)的化合物分子式及其離子加合方式。

2結(jié)果與討論

2.1混合標(biāo)準(zhǔn)氣體定量分析方法

9種VOCs的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、LOD和LOQ如表1所示。9種VOCs信號強度和濃度的線性回歸方程的R2為0.990～1.000，LOD在2.3ng/m3（2-戊酮）～240.8ng/m3（甲苯）之間。與常見的呼氣直接質(zhì)譜技術(shù)PTR-MS和SIFT-MS相比[29-30]（電子版文后支持信息表S3），SESI-HRMS的LOD均低于兩者，其中，對于2-丁酮，SESI-HRMS的LOD均低于PTR-MS和SIFT-MS2個數(shù)量級；對于乙酸乙酯，SESI-HRMS分別低于兩者2個和3個數(shù)量級。從檢測范圍來看，SESI-HRMS對9種VOCs的LOD均低于人體呼氣濃度下限（見電子版文后支持信息表S2），對2-丁酮、2-戊酮、乙酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和均三甲苯的線性范圍上限均高于人體呼氣濃度上限報道值，表明利用此裝置和方法定量分析呼氣中9種VOCs具有可行性。

一天內(nèi)在同一體積濃度下通過6次重復(fù)檢測評估日內(nèi)變化。9種VOCs的日內(nèi)RSD在0.6%（檸檬烯）～4.6%（甲苯）之間，低于5%。此外，通過連續(xù)3d的重復(fù)檢測，對日間變化情況進行評估，日間RSD在4.3%（異戊二烯）～12.2%（檸檬烯）之間，低于15%。以上結(jié)果與文獻[10]的結(jié)果相當(dāng)（電子版文后支持信息表S4），表明本方法具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

研究了SESI-HRMS檢測酮類、烯烴類、芳香烴類和酯類VOCs的普適性規(guī)律，由于SESI的電離過程主要受配體切換反應(yīng)控制[31]，該反應(yīng)可能與物質(zhì)的偶極矩（Dipolemoment，DM）和質(zhì)子親和力（Protonaffinity，PA）相關(guān)。對9種VOCs的檢測靈敏度與DM和PA的相關(guān)性進行分析，結(jié)果見電子版文后支持信息圖S1，靈敏度與DM和PA均呈正相關(guān)（R2分別為0.878和0.015），并且與DM的相關(guān)性遠(yuǎn)高于PA。靈敏度與DM的相關(guān)性分析結(jié)果表明，隨著化合物極性上升，SESI-HRMS的檢測靈敏度也隨之上升，可能是因為VOCs與電噴霧云內(nèi)的帶電微液滴發(fā)生相互作用的過程與物質(zhì)的DM有關(guān)[31]。例如，DM越高代表物質(zhì)極性越強，其水溶解度也越高，因此極性更強的VOCs更容易溶解于帶電微液滴內(nèi)，進而發(fā)生電離。質(zhì)子親和力與靈敏度的相關(guān)性分析結(jié)果表明，這4類VOCs在被SESI源電離的過程中可能包含質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，VOCs的PA越高，越容易從帶電微液滴獲得質(zhì)子。但是，此規(guī)律還需要更多標(biāo)準(zhǔn)品實驗予以證明。

2.2口呼氣與鼻呼氣組分分析

口呼氣與鼻呼氣中9種VOCs的定量分析結(jié)果表明，僅在一位受試者的口呼氣和鼻呼氣中檢測出檸檬烯，濃度分別為0.8和0.2μg/m3，其余受試者口呼氣或鼻呼氣中9種VOCs的濃度均未達(dá)到LOQ。

利用Venn圖初步分析口呼氣和鼻呼氣組分的差異，結(jié)果如圖3所示。人體口呼氣與鼻呼氣組分被檢測到的共同存在成分?jǐn)?shù)量為565個（正離子模式395個（圖3A），負(fù)離子模式170個（圖3B））?？诤魵馓赜谐煞?jǐn)?shù)量167個（正離子模式112個（圖3A），負(fù)離子模式55個（圖3B）），鼻呼氣特有成分?jǐn)?shù)量76個（正離子模式34個（圖3A），負(fù)離子模式42個（圖3B）），前者是后者的2.2倍。無論在正離子還是負(fù)離子電離模式下，口呼氣內(nèi)特有成分?jǐn)?shù)量均高于鼻呼氣，推測是口腔環(huán)境中的細(xì)菌或食物殘渣、唾液也會釋放VOCs[32-33]，導(dǎo)致口呼氣中VOCs組成更復(fù)雜。

2.3口呼氣與鼻呼氣差異組分分析

為進一步探究人體口呼氣與鼻呼氣組分的差異，將上述口呼氣與鼻呼氣共同檢測到的565個成分對應(yīng)的信號強度進行火山分析（圖4A）發(fā)現(xiàn)，163個成分的強度存在顯著差異，其中以口呼氣相對鼻呼氣信號強度顯著上升的成分為上調(diào)成分（85個），反之則為下調(diào)成分（78個）（電子版文后支持信息表S5）。

將口呼氣和鼻呼氣中特有的成分以及口呼氣和鼻呼氣中具有強度差異性的成分均導(dǎo)入HMDB，再將其精確質(zhì)量與原始數(shù)據(jù)比較，確定相應(yīng)成分對應(yīng)的化學(xué)式及其離子加合方式（電子版文后支持信息表S6和S7）。從上述成分對應(yīng)的離子形式來看，口呼氣中被SESI源電離形成氨加合分子離子[M+NH4]+占所有離子形式的比例為53.5%，而鼻呼氣內(nèi)[M+NH4]+的占比為25.0%。由于人體呼氣中含有的氨主要由口腔釋放，其含量高于鼻呼氣[34]，這可能是因為口呼氣組分內(nèi)氨加合分子離子占比更高的原因。口呼氣中高濃度的氨氣會導(dǎo)致呼氣組分經(jīng)口腔呼入離子源后更易形成氨加合態(tài)分子離子，增加了后續(xù)定性分析的難度。進一步，以各化學(xué)式H原子數(shù)與C原子數(shù)的比例（H/C）為橫坐標(biāo)，以O(shè)原子數(shù)與C原子數(shù)的比例（O/C）為縱坐標(biāo)，對鼻呼氣與口呼氣的組分進行元素組成分析，發(fā)現(xiàn)口呼氣組分既含有與鼻呼氣組分種類相似的一系列化合物，也包括有別于鼻呼氣組分的一類化合物（圖4B）。O/C能反映化合物的極性，O/C越高，極性越強[35]。將O/Cgt;0.4的化合物個數(shù)進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)鼻呼氣組分中O/Cgt;0.4的化合物所占比例為41.9%，口呼氣中該比例為10.5%?；衔锏臉O性越強，其在水中的溶解度也會隨之上升。有研究表明，鼻呼氣的濕度低于口呼氣[36]，加之口腔內(nèi)含有大量唾液，導(dǎo)致極性化合物更易滯留在口腔環(huán)境中，這也可能是鼻呼氣特異性組分中極性化合物占比更高的原因。此外，盡管口呼氣采樣相對鼻呼氣采樣更易實現(xiàn)，當(dāng)口腔釋放出的VOCs對呼氣生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)或篩查造成干擾時[37]，可以考慮采集鼻呼氣以減少影響。

3結(jié)論

以9種VOCs為檢測對象，建立了基于SESI-HRMS的定量分析方法。結(jié)果表明，本方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好，滿足人體呼氣中9種VOCs的定量分析需求。進一步，以實際人體呼氣樣品為研究對象，與以往只針對特定VOCs的分析研究不同，本研究采用非靶標(biāo)分析策略探究口呼氣組分與鼻呼氣組分的差異。分析結(jié)果表明，由于氨主要源自口腔環(huán)境釋放，口呼氣氨的含量高于鼻呼氣，這解釋了在口呼氣內(nèi)氨加合分子離子所占比例更高的現(xiàn)象。進一步根據(jù)元素組成的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)鼻呼氣內(nèi)極性化合物的占比更高，推測可能由于人體鼻呼氣濕度低于口呼氣濕度，減少了極性化合物在鼻腔內(nèi)的滯留，表明采集鼻呼氣可能更有利于分析極性化合物組分。同時，應(yīng)考慮呼氣內(nèi)源性組分是否受口腔內(nèi)VOCs釋放的影響，避免產(chǎn)生錯誤結(jié)果。后續(xù)研究還需進一步基于更大樣本量，以精準(zhǔn)定性和定量分析口呼氣與鼻呼氣的組分為目標(biāo)，更加系統(tǒng)且深入地探索兩種呼氣樣本類型間的差異性組分及其來源，為進一步明確合適的呼氣方式應(yīng)用場景和優(yōu)化SESI-HRMS呼氣檢測方法提供更多的理論依據(jù)。