鑭系金屬-有機(jī)框架免修飾熒光各向異性探針檢測磷酸根離子

關(guān)鍵詞熒光各向異性；探針；發(fā)光金屬-有機(jī)框架；鑭系金屬-有機(jī)框架；磷酸根離子

熒光各向異性（Fluorescence anisotropy， FA）是熒光分子的固有屬性。當(dāng)熒光分子定向排列后，熒光分子發(fā)出的熒光具有各向異性。此時，采用取向垂直和水平的檢偏器即可檢測到不同的熒光強(qiáng)度。FA檢測屬于均相分析方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）不需要分離和洗滌等步驟，操作簡便[1-2]；（2）可直接和實(shí)時測定熒光探針的結(jié)合/解離速率[3]；（3）易于實(shí)現(xiàn)高通量和自動化分析檢測[4-5]；（4）探針設(shè)計(jì)簡單，只需要一個熒光分子標(biāo)記[6]；（5）抗光漂白和抗熒光波動的能力強(qiáng)。根據(jù)Perrin 方程，當(dāng)熒光壽命、溶液的粘度和溫度保持不變，熒光體的體積（或質(zhì)量）增大時， FA 值（r）增大；當(dāng)熒光體的體積（或質(zhì)量）減小時，r 減小[7-8]。通過檢測反應(yīng)前后熒光體的分子體積（或質(zhì)量）的改變可實(shí)現(xiàn)對分析物的高靈敏檢測。目前，F(xiàn)A 探針主要分為三類：有機(jī)染料[9-14]、過渡金屬配位化合物[15]以及熒光納米粒子[16]。然而，由于分析物的體積或質(zhì)量較小，與探針結(jié)合不能引起明顯的r 的改變，因此，研究者通常采用具有大體積或質(zhì)量的納米材料（如金納米顆粒[17]、銀納米顆粒[18]、碳納米顆粒[19]、碳納米管[20]和氧化石墨烯[21]等）放大探針的FA 信號，進(jìn)而提升檢測靈敏度。然而，這些方法也存在一些弊端：這些納米材料易通過電子轉(zhuǎn)移或熒光共振能量轉(zhuǎn)移猝滅熒光，導(dǎo)致r 易受散射干擾而降低檢測準(zhǔn)確度；大多數(shù)方法中的熒光探針需要復(fù)雜的修飾步驟，例如以金納米顆粒放大FA 信號需將DNA 通過化學(xué)鍵修飾到納米顆粒表面，其過程較復(fù)雜。因此，非常有必要開發(fā)不需要放大體積和質(zhì)量且不需要修飾的新型FA 探針。

金屬-有機(jī)框架（Metal-organic framework， MOFs）是一種將金屬離子/團(tuán)簇和有機(jī)配體通過配位鍵連接而成的晶體多孔材料[22]，因其結(jié)構(gòu)和功能可定制，并具有超高的孔隙率和大表面積，在催化[23]、氣體儲存和分離[24]、藥物遞送[25]、分離科學(xué)[26]和生物傳感[27]等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[28-29]。其中，發(fā)光金屬-有機(jī)框架材料（Luminescent MOFs， LMOFs）因具有獨(dú)特的發(fā)光性能而備受關(guān)注[30-31]。在MOFs 的結(jié)構(gòu)中同時包含金屬離子/團(tuán)簇與有機(jī)配體兩個部分，因此，可以通過調(diào)節(jié)金屬離子/團(tuán)簇及有機(jī)配體的比例及種類，使MOFs 材料具有豐富且可調(diào)的發(fā)光性能。LMOFs 材料的剛性結(jié)構(gòu)使其容易設(shè)計(jì)傳感的反應(yīng)位點(diǎn)，并且兼?zhèn)錈o機(jī)及有機(jī)材料的特性，在結(jié)構(gòu)與性能方面具有良好的設(shè)計(jì)性及可調(diào)節(jié)性，適用于不同的檢測環(huán)境，呈現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。更重要的是， LMOFs 本身的體積（或質(zhì)量）較大，具有較強(qiáng)的r，不需要額外的信號放大材料，因此可作為一種潛在的FA 探針。

磷酸根離子（Pi）是水生微生物營養(yǎng)鏈的重要組成部分，當(dāng)發(fā)生富營養(yǎng)化時，磷酸鹽會耗盡溶解氧，導(dǎo)致植被和水生生物腐爛和死亡。在一定程度上， Pi 是一種方便的水體有機(jī)污染指示劑或示蹤劑， Pi 的檢測對于控制和防范水體富營養(yǎng)化的發(fā)生具有重要意義。Pi 的分析方法包括分光光度法[32]、熒光法[33]、色譜法[34]、電化學(xué)分析法[35]和酶生物傳感器[36]等，然而，以上方法存在諸如準(zhǔn)確度不高、定性能力較差、選擇性較差和實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)苛等問題。因此，開發(fā)一種簡單快捷并具備高靈敏度與高選擇性以及成本較低的Pi 檢測方法具有重要的意義。

基于此，本研究采用一種新型FA 探針鑭系金屬-有機(jī)框架（Ce-TCPP MOF）檢測Pi（圖1）。首先，以Ce3+為中心離子、5，10，15，20-四（4-羧基苯基）卟啉（H2TCPP）為配體，通過微波輔助法合成了在662 nm 處有熒光發(fā)射的Ce-TCPP MOF 材料[37]。制備出的Ce-TCPP MOF 納米薄片在溶液中的旋轉(zhuǎn)擴(kuò)散速率較低，導(dǎo)致其自身具有較強(qiáng)的r；加入Pi 后， Pi 會與MOF 中的金屬離子Ce3+發(fā)生反應(yīng)，致使Ce-TCPP MOF 結(jié)構(gòu)破壞，其體積或質(zhì)量顯著減小，降低了r。因此，可以通過檢測r 的降低值（Δr）實(shí)現(xiàn)Pi 的檢測。本方法操作簡便，檢測時無需引入其它材料進(jìn)行信號放大即可實(shí)現(xiàn)Pi 的高靈敏度與高選擇性檢測，在環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-2500 熒光分光光度計(jì)（帶偏振片）、S-4800 掃描電子顯微鏡（SEM）和UV-3010 分光光度計(jì)（日本日立公司）；IRPrestige-24 紅外光譜儀（FTIR，日本島津公司）；JEM1200EX 透射電子顯微鏡（TEM，日本JEOL 公司）；BX51 光學(xué)顯微鏡、U-DCW 暗場聚光鏡、100 倍放大的油浸物鏡和DP27 單芯真彩CCD 相機(jī)（日本Olympus 公司）；Dimension Icon 原子力顯微鏡（AFM）和D8 ADVANCE X-射線衍射儀（XRD）（德國布魯克斯公司）；250Xi X-射線光電子能譜（美國賽默飛公司）；M1-L213B 家用微波爐（美的股份有限公司）

六水合硝酸鈰（Ce（NO3）3·6H2O， 99.95%）、乙酸（HAC， AR 級， 99.5%）和5，10，15，20-四（4-羧基苯基）卟啉（H2TCPP， 97%）購自阿拉丁公司；無水乙醇、N，N-二甲基甲酰胺（DMF， 99.5%）和十二水合磷酸鈉（Na3PO4·12H2O， AR 級， 98%）購自川東化工股份有限公司；曲拉通TX-100 和Tris-HCl 緩沖液（1 mol/L）購自生工生物工程股份有限公司。所有化學(xué)試劑均直接使用，未進(jìn)一步純化；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Ce-TCPP MOF的合成[37]

將39.1 mg Ce（NO3）3·6H2O和23.7 mg H2TCPP分別溶于9 mL DMF中，然后將100 μL Ce（NO3）3·6H2O、100 μL H2TCPP 和15 μL HAc 分別加入3 mL 玻璃小瓶中，用DMF 稀釋至1 mL。將蓋好蓋子的小瓶放入微波爐中低功率（約231 W）微波照射加熱10 min。將得到的納米片冷卻至室溫后，分別用DMF 和乙醇各洗滌2 次，然后以14000 r/min 離心5 min。最后，將得到的Ce-TCPP MOF 重新分散在乙醇中。

1.2.2 FA的測定

采用配有偏振片的熒光分光光度計(jì)測量不同偏振方向上的熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長為420 nm，發(fā)射波長為662 nm；激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設(shè)置為5 nm；積分時間設(shè)置為2 s。樣品池采用石英池， FA 測量實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。根據(jù)公式（1）和公式（2）計(jì)算r：

其中， IVV 和IHH 分別為垂直偏振光激發(fā)后垂直和水平偏振光發(fā)射的熒光強(qiáng)度；IHV 為起偏器為水平方向而檢偏器為垂直方向時的熒光強(qiáng)度；IVH 為起偏器為垂直方向而檢偏器為水平方向時的熒光強(qiáng)度；儀器校正因子G 為校正了垂直和平行發(fā)射路徑的不同檢測效率。

1.2.3 Pi檢測實(shí)驗(yàn)

由于Ce-TCPP MOF 具有較大的尺寸，在溶液中易團(tuán)聚沉淀，因此在實(shí)驗(yàn)過程中加入表面活性劑TX-100 阻止其團(tuán)聚。在室溫條件下，將20 μL 1 mg/mL Ce-TCPP MOF、10 μL 1% TX-100、70 μL 超純水以及100 μL 含有不同濃度Pi 的Tris-HCl 緩沖液（20 mmol/L， pH=7.0）混合，反應(yīng)30 min，按照1.2.2 節(jié)的方法測定并計(jì)算不同樣品的r。

1.2.4 實(shí)際樣品檢測

實(shí)際水樣為嘉陵江下游北碚段江水樣品。水樣自然沉淀12 h 后取其上層清液，離心，去除不溶物后，將其調(diào)至pH=7，備用。將20 μL 1 mg/mL Ce-TCPP MOF、10 μL 1% TX-100、70 μL 處理后的實(shí)際水樣與100 μL Tris-HCl 緩沖液（20 mmol/L， pH=7.0）混合，反應(yīng)30 min， 測定并計(jì)算不同樣品的r。

2 結(jié)果與討論

2.1 Ce-TCPP MOF 的表征

由Ce-TCPP MOF 的SEM 圖（圖2A）和TEM 圖（圖2B）可見， Ce-TCPP MOF 呈邊緣清晰、大小均一的片狀結(jié)構(gòu)。AFM 圖（圖2C）表明， Ce-TCPP MOF 為具有一定厚度的納米薄片。在紫外燈照射下， Ce-TCPPMOF 的乙醇分散液呈現(xiàn)紅色熒光（圖2D）。由于H2TCPP 的平面大環(huán)結(jié)構(gòu)能提供π→π*躍遷，使得H2TCPP及其衍生物在可見光區(qū)具有熒光響應(yīng)，因此，以420 nm 為激發(fā)波長， Ce-TCPP MOF 的乙醇分散液分別在662 和712 nm 附近出現(xiàn)了熒光發(fā)射峰（圖2E），這與H2TCPP 的乙醇分散液出峰位置一致（圖2F）。

在FTIR 光譜圖（圖3A）中， 1689 和1604 cm–1 處的峰為H2TCPP 單體中C=O 的不對稱伸縮振動特征峰，當(dāng)H2TCPP 與Ce3+配位后，特征峰分別位移至1581 和1527 cm–1，并且強(qiáng)度顯著降低；在Ce-TCPPMOF 的紅外光譜圖中可以觀察到1261 cm–1 處C—O 的伸縮振動峰消失。這些結(jié)果表明， Ce-TCPP MOF是由Ce3+與H2TCPP 中的羧基配位而構(gòu)建的。粉末X-射線衍射（PXRD）研究（圖3B）表明， Ce-TCPP MOF屬于正交晶系中Cmmm 空間群。Ce 原子采用類八面體配位模式， 4 個橋接羧基分別來自4 個不同的TCPP 連接子， 2 個氧原子來自μ2-OH 基團(tuán)，沿a 軸方向形成CeO4（OH）2 鏈。卟啉中心無金屬，幾乎是平面的，沒有明顯的面外變形[37]。

通過比較H2TCPP 與Ce-TCPP MOF 的XPS 譜圖（電子版文后支持信息圖S1A）發(fā)現(xiàn)，當(dāng)H2TCPP 與Ce3+形成Ce-TCPP MOF 后， Ce 3d（電子版文后支持信息圖S1B）在882.7、886.1、888.8、900.6、904.7 和907.5 eV 處的峰發(fā)生了不同程度位移，這表明H2TCPP 配體中的羧基與Ce3+節(jié)點(diǎn)成功配位；同時，Ce-TCPP MOF 的N 1s 譜圖（電子版文后支持信息圖S1C）與H2TCPP 相比沒有明顯偏移，表明卟啉環(huán)沒有被金屬化；并且O 1s 譜圖（電子版文后支持信息圖S1D）中的C=O 和C—OH 基團(tuán)在531.8 和533.1 eV處的峰也分別位移至531.2 和533.3 eV 處。

2.2 Ce-TCPP MOF 檢測Pi的性能研究

2.2.1 Ce-TCPP MOF 對Pi的響應(yīng)

為了探究Ce-TCPP MOF 對Pi 的響應(yīng)，測定了Ce-TCPP MOF 在加入Pi 前后的r。如圖4A 所示，未加入Pi 時， Ce-TCPP MOF 具有較大的r；加入Pi 后， MOF 中的Ce3+與Pi 發(fā)生反應(yīng)， r 降低。因此，利用Ce-TCPP MOF 顯著降低的r 可以實(shí)現(xiàn)Pi 的靈敏檢測。

為了研究Pi 與Ce-TCPP MOF 之間的反應(yīng)，對二者反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行了測定與表征。加入Pi 后，混合體系的熒光顯著增強(qiáng)（圖4B），表明Ce-TCPP MOF 被Pi 破壞，產(chǎn)生了游離的TCPP。SEM 圖像顯示，Ce-TCPP MOF 與Pi 反應(yīng)后，其二維片狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榱捷^小的不規(guī)則結(jié)構(gòu)，表明MOF 空間結(jié)構(gòu)被Pi 破壞（圖4C）。此外，對Ce-TCPP MOF 與Pi 反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行了分析。在FTIR 光譜圖（電子版文后支持信息圖S2A）中，屬于Ce-TCPP MOF 的特征峰消失，產(chǎn)物在1085 cm–1 處出現(xiàn)較強(qiáng)的PO4 反對稱伸縮振動峰。PXRD（電子版文后支持信息圖S2B）和XPS（電子版文后支持信息圖S2C）結(jié)果證明了Pi 與Ce-TCPPMOF 反應(yīng)后的產(chǎn)物為CePO4，表明Pi 與Ce-TCPP MOF 中的Ce3+發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致MOF 裂解， r 降低。采用暗場顯微鏡實(shí)時觀察了Ce-TCPP MOF 與Pi 之間的反應(yīng)，結(jié)果表明，隨著反應(yīng)的進(jìn)行， Ce-TCPP MOF 的暗場散射圖像發(fā)生了顯著變化：0 min 時， Ce-TCPP MOF 具有較強(qiáng)的散射光以及明顯的片狀特征性結(jié)構(gòu)（圖4D）；15 min 時， Ce-TCPP MOF 散射光強(qiáng)度有所下降（圖4E）；30 min 時， Ce-TCPP MOF 散射光強(qiáng)度降到最低，并且邊界處發(fā)生裂解（圖4F），這進(jìn)一步證明了Pi 能破壞Ce-TCPP MOF 的結(jié)構(gòu)。

2.2.2 Pi檢測條件的優(yōu)化

為了獲得良好的Pi 檢測性能，考察了反應(yīng)體系中溶液pH 值、反應(yīng)時間（t）與MOF 濃度（CMOF）對Pi檢測的影響。首先，對溶液的pH 值進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖5A 所示。當(dāng)溶液pH 值從6.8 增至9.0 時， Δr 先增加后降低；當(dāng)pH=7.0 時， Δr 最大。由于大多數(shù)金屬陽離子對OH?的親和力高于羧酸鹽的親和力，導(dǎo)致由高價金屬構(gòu)成的羧酸MOFs 在堿性環(huán)境中會逐漸降解[38]，所以隨著溶液的pH 值增大， Ce-TCPPMOF 的r 降低。因此，選擇pH=7.0 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對Pi 的檢測時間進(jìn)行了優(yōu)化，選擇最佳反應(yīng)時間為30 min（圖5B）。MOF 濃度的影響如圖5C 所示，可見隨著MOF 濃度逐漸增大， Δr 呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)MOF 濃度為100 μg/mL 時， Δr 最大。

2.2.3 方法對Pi的檢測性能

在最佳條件下，采用本方法測定不同濃度的Pi 所產(chǎn)生的Δr。如圖6 所示，隨著Pi 濃度增加，Ce-TCPP MOF 的Δr 逐步增大， Δr 與Pi 濃度在0.5～3.5 μmol/L（0.016～0.108 mg/L）范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Δr=0.066C（μmol/L）–0.017（R2=0.99）。檢出限（LOD， 3σ/k）為0.41 μmol/L。與已報道的方法相比（表1），本方法的檢出限相當(dāng)或更低，并且本方法操作簡便，無需制備復(fù)雜的熒光探針，成本較低。

2.2.4 選擇性與抗干擾性

真實(shí)水體的組成相對復(fù)雜，通常存在多種陰離子，并可能與Pi 形成競爭關(guān)系，從而影響Ce-TCPPMOF 對于Pi 的檢測。選取水體中常見的共存陰離子（Cl?、Br?、NO3?、CO32?和SO42?），考察其對本方法檢測Pi 的影響。如圖7A 所示，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，向Ce-TCPP MOF 中加入上述常見的共存陰離子后， r 只有很小的變化；向Ce-TCPP MOF 中加入相同濃度的Pi 后， r 顯著降低。SEM 圖顯示， Ce-TCPPMOF 與上述陰離子反應(yīng)后，其二維片狀結(jié)構(gòu)并未發(fā)生改變（電子版文后支持信息圖S3）。通過暗場顯微鏡實(shí)時觀察Ce-TCPP MOF 與上述常見共存陰離子之間的反應(yīng)，隨著反應(yīng)進(jìn)行， Ce-TCPP MOF 的暗場散射圖像也并未發(fā)生變化（電子版文后支持信息圖S4）。加入Pi 后， Ce-TCPP MOF 結(jié)構(gòu)遭受破壞，產(chǎn)生游離的TCPP，使混合體系產(chǎn)生了明顯的熒光增強(qiáng)現(xiàn)象，加入上述常見共存陰離子后，混合體系的熒光并未增強(qiáng)（電子版文后支持信息圖S5），再次證明了Cl?、Br?、NO3?、CO32?和SO42?并不會破壞Ce-TCPP MOF的結(jié)構(gòu)。因此，本方法對Pi 的檢測具有良好的選擇性。

進(jìn)一步研究了Na+、K+、Ca2+、Mn2+、S2O32?、SO32?、HCO3?和Ac?等水體中常見離子對Pi 檢測的影響。如圖7B 所示，向檢測體系中加入濃度為Pi 濃度10 倍的上述干擾物質(zhì)后， Δr 未發(fā)生明顯變化，表明本方法對Pi 的檢測具有較強(qiáng)的抗干擾能力。

2.3 實(shí)際水樣的檢測

為了驗(yàn)證本方法在復(fù)雜水樣中的檢測性能，選取嘉陵江下游北碚段江水作為實(shí)際樣本。嘉陵江擁有豐富的水資源，具有較高的社會經(jīng)濟(jì)價值，但由于其流經(jīng)范圍較廣，難免存在多種污染物，包括重金屬離子和陰離子（如Pi）等，因而對于嘉陵江江水水質(zhì)的檢測具有重要意義。采用本方法檢測得到的Pi 濃度約為0.078 mg/L，鉬酸銨分光光度法[44]檢測得到的Pi 濃度約為0.080 mg/L（表2），兩種方法的檢測結(jié)果基本一致；同時，檢測結(jié)果顯示該江段的嘉陵江水也符合Ⅱ類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)[45]。上述結(jié)果表明本方法可用于復(fù)雜水體中Pi 的檢測。

3 結(jié)論

制備了一種新型FA 探針Ce-TCPP MOF，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜水質(zhì)環(huán)境中Pi 的檢測。與現(xiàn)有的分析檢測方法相比，本方法無需構(gòu)建復(fù)雜的熒光探針便可實(shí)現(xiàn)對Pi 的靈敏檢測，具有簡便快捷和準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)；此外，由于Ce-TCPP MOF 自身具有較大體積及質(zhì)量，無需額外加入FA 放大材料，因此實(shí)驗(yàn)操作簡便，成本低。本研究為檢測復(fù)雜水樣中Pi 含量提供了一種新方法。