瘤背石磺腹部皮膚的超微結(jié)構(gòu)及其黏液抗菌特性分析

摘要：【目的】對(duì)瘤背石磺（Onchidium reevesii）腹部皮膚進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察和皮膚黏液抗菌特性分析，為瘤背石 磺皮膚免疫功能的研究和天然抗菌藥物的開發(fā)提供參考依據(jù)?！痉椒ā坎杉霰呈歉共科つw和皮膚黏液，采用光學(xué) 顯微鏡和透射電鏡觀察瘤背石磺腹部（足部和足側(cè)）皮膚結(jié)構(gòu)、腺體和腺細(xì)胞特征，采用組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)黏液 細(xì)胞中的糖綴合物，用瘤背石磺皮膚黏液對(duì)7種致病菌進(jìn)行處理，采用生長(zhǎng)曲線法和抑菌圈法測(cè)定黏液的抑菌效果， 并深入研究黏液對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）的抑菌機(jī)理?！窘Y(jié)果】瘤背 石磺腹部皮膚黏液細(xì)胞中含有較多酸性黏多糖；足部皮膚中的黏液腺呈圓形，含有混合型黏多糖的黏液儲(chǔ)存在中央 腺腔中，足側(cè)皮膚中的顆粒腺也分泌酸性黏多糖。根據(jù)分泌囊泡形態(tài)和致密程度的不同，足部皮膚中的腺細(xì)胞可分 為6種類型，足側(cè)皮膚中的腺細(xì)胞可分為3種類型，分泌囊泡與細(xì)胞膜融合后以胞吐的方式向外分泌。瘤背石磺皮膚 黏液對(duì)7種致病菌的生長(zhǎng)曲線均表現(xiàn)出抑制作用，具有廣譜抗菌活性，且抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果顯示，黏液對(duì)金黃色葡 萄球菌和哈維氏弧菌的抑制效果最好。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，經(jīng)皮膚黏液處理后，金黃色葡萄球菌和哈維氏弧菌 細(xì)胞表面出現(xiàn)畸形和裂紋，胞質(zhì)內(nèi)容物流出，同時(shí)OD，。。變化反映黏液可增加細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，表明黏液可有效 破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性。此外，與不經(jīng)皮膚黏液處理相比，經(jīng)黏液處理后，金黃色葡萄球菌和哈維氏弧菌三羧酸循 環(huán)關(guān)鍵酶活性和ATP含量均顯著降低（Plt;0.05，下同），Nat/K+-ATPase活性顯著升高，說明黏液能破壞細(xì)菌的能量代謝 過程，導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖受阻?！窘Y(jié)論】瘤背石磺腹部皮膚具有多種類型的腺體和腺細(xì)胞，其分泌的黏液可破壞細(xì)菌的 細(xì)胞膜完整性及能量代謝過程，具有廣譜抑菌活性。

關(guān)鍵詞：瘤背石磺；皮膚黏液；抑菌；透射電鏡

文章編號(hào)：2095-1191（2024）04-1225-13

中圖分類號(hào)：S917.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Ultrastructure of abdominal skin of Onchidium reevesii and antimicrobial property of its skin mucusSUN Meng-ying1.2.3， SHEN He-ding1.2.3*

（1National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education（Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China; 2Key Laboratory of Marine Fauna Phylogeny and Evolution of Shanghai University （Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China; 3Shanghai Collaborative Innovation Center for Cultivating Elite Breeds and Green-culture of Aquaculture Animals（Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China）

Abstract：[Objective]To provide a reference for exploring the immune function of Onchidium reevesii skin and developing natural antimicrobial drugs， ultrastructural observation of O. reevesii abdominal skin and analysis of the antimicrobial properties of skin mucus were performed. 【Method]Collected abdominal skin （foot and side of foot） and skin mucus from O. reevesii， observed skin structure， glandular and glandular cell characteristics by light microscopy and transmis- sion electron microscopy， detection of glycoconjugates in mucous cells by histochemical staining technique was con-ducted and seven pathogenic bacteria were treated with skin mucus of O. reevesii， the growth curve method and zone of inhibition were used to determine the antimicrobial activity of the mucus， and the antimicrobial mechanism of the mucus was studied in depth with Staphylococcus aureus and Vibrio harveyi. 【Result]The results showed that the mucous cells had a higher content of acidic mucopolysaccharides; the mucus glands in the foot were round， and mucus containing a mixture of mucopolysaccharides was stored in the central lumen of the glands; and the granular glands in the skin of side of foot secreted acidic mucopolysaccharides. According to the morphology and density of the secretory vesicles， there were six and three types of glandular cells in the skin of the foot and in the lateral skin of the foot respectively. And the se- cretory vesicles were attached to the cell membrane and secreted into the environment via exocytosis. O. reevesii skin mu- cus had an inhibitory effect on the growth curves of all seven pathogens， with broad-spectrum antibacterial activity， and the results of the zone of inhibition test showed the optimal inhibitory effect on S. aureus and V. harveyi. Scanning electron microscope results showed that after being treated with skin mucus， the morphology of S. aureus and V. harveyi appeared malform and crack， cellular contents leaked out. Meanwhile， the change in OD26o reflected that skin mucus could increase the permeability of bacterial cell membranes， indicating that skin mucus could effectively disrupt the integrity of bacterial cell membranes. In addition， the activity of key enzymes of tricarboxylic acid cycle and ATP content in S. aureus and V.harveyi were significantly decreased （Plt;0.05， the same below） and the activity of the Nat/K+-ATPase significantly increased compared to the control group after co-cultivation of mucus with bacteria. This suggests that mucus was able to disrupt the energy metabolism process of the bacteria， which led to the inhibition of bacterial growth and reproduction.【Conclusion】The abdominal skin of O. reevesii has several types of glands and glandular cells which secrete mucus ca- pable of disrupting the integrity of bacterial cell membranes as well as energy metabolism processes， thus exhibiting a broad-spectrum antibacterial activity.

Key words： Onchidium reevesii; skin mucus; bacteriostasis; transmission electron microscopy

Foundation items： National Key Research and Development Plan Blue Granary Science and Technology Innovation\" Key Special Project （2020YFD0900802） ; Shanghai Collaborative Innovation Center Team Project （A1-3605-21-000202）

0 引言

【研究意義】瘤背石磺（Onchidium reevesii）是一 種由海洋向陸地進(jìn)化的兩棲性腹足綱貝類，身體柔 軟，無(wú)外殼保護(hù)，其皮膚與外界環(huán)境直接接觸，因此 成為抵御外界不良環(huán)境的首道防線。瘤背石磺皮膚 黏液作為先天性免疫成分附著在皮膚表面，含有豐 富的免疫活性物質(zhì)，分析其抗菌作用有助于進(jìn)一步 了解瘤背石磺皮膚免疫防御機(jī)制，為其病害防控提 供理論依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】黏液腺和顆粒腺是 2類主要的皮膚腺，腺細(xì)胞可分泌黏液（Toledo andJared，1995）。瘤背石磺的背部皮膚由角質(zhì)層、表皮 和真皮構(gòu)成，真皮中存在黏液腺和顆粒腺，顆粒腺分 泌有毒物質(zhì)，其數(shù)目多于黏液腺（王冬鳳等，2015）。 不同物種腺細(xì)胞的形態(tài)、功能等方面存在差異，葉蛙 （Phyllomedusa distincta）皮膚黏液腺呈球形，主要分 泌黏蛋白和多糖，具有保濕、輔助呼吸和防御等功 能，其顆粒腺較黏液腺大，主要分泌毒性蛋白質(zhì)和刺 激性氣體（Antoniazzi et al.，2013）；綠雨濱蛙（Litoria caerulea）的皮膚黏液腺內(nèi)分布黏液細(xì)胞，顆粒腺內(nèi) 遍布不均勻的顆粒物質(zhì)（Warburg et al.，2000）。在 軟體動(dòng)物中，黏液細(xì)胞數(shù)量可作為檢測(cè)不良環(huán)境應(yīng) 激的免疫指標(biāo)，雜色鮑（Haliotis diversicolor）受非生 長(zhǎng)鹽度脅迫時(shí)，唇部黏液細(xì)胞大量增殖以維持體內(nèi) 離子濃度平衡（Creencia and Noro，2018）。黏液細(xì)胞也是皮膚腺細(xì)胞的一類，可分泌大量黏液。大菱鲆（Scophthalmus maximus）變態(tài)發(fā)育后期，皮膚黏液細(xì)胞含有巖藻糖和半乳糖-N-乙酰半乳糖胺序列的糖綴 合物（Landeira-Dabarca et al.，2021）。水產(chǎn)動(dòng)物黏液層形成覆蓋皮膚表面的保護(hù)性屏障（Esteban，2012），其中含有多種免疫物質(zhì)，如凝集素（Subrama- nian et al.，2009）、抗菌肽（Rollins-Smith，2023）和免 疫酶（Vizcaino et al.，2023）等，已被廣泛證明具有體 外抗菌和抗病毒作用。軟體動(dòng)物中，散大蝸牛 （Helix aspersa）黏液對(duì)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑菌效果，并可從中鑒定 出4種抗菌蛋白（Pitt et al.，2015，2019）。巨石斑魚（Epinephelus tauvina）的皮膚黏液對(duì)魚類致病菌副 溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和人類致病菌奇 異變形桿菌（Proteus mirabilis）均有抑制作用（Mani- kantan et al.，2016）。鯉科魚類皮膚黏液的酸性提取 物對(duì)魚類致病菌具有強(qiáng)大的體外殺菌活性（Aliet al.，2023）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于兩棲性無(wú)脊椎 動(dòng)物皮膚免疫機(jī)制的研究較少，特別是皮膚黏液在 瘤背石磺皮膚免疫機(jī)制中的作用鮮有報(bào)道?！緮M解決 的關(guān)鍵問題】采集瘤背石磺腹部皮膚和皮膚黏液，通 過光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察瘤背石磺腹部皮膚結(jié) 構(gòu)、腺體和腺細(xì)胞特征，采用組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè) 黏液細(xì)胞中的糖綴合物，并測(cè)定瘤背石磺皮膚黏液 抗菌活性。以了解瘤背石磺腹部皮膚的超微結(jié)構(gòu)及其黏液抗菌特性，為瘤背石磺皮膚免疫功能的研究 和天然抗菌藥物的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

瘤背石磺個(gè)體采集自浙江省寧波市海邊灘涂， 帶回實(shí)驗(yàn)室后置于塑料培養(yǎng)箱中暫養(yǎng)7d，每天定 時(shí)、定量投喂玉米粉?？咕钚詼y(cè)定所用菌種金黃 色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis）、銅綠假單胞菌、哈維氏弧菌（Vib- rio harveyi）、副溶血弧菌、大腸桿菌（Escherichia coli） 和嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）均由上海海洋大學(xué)病原庫(kù)保存提供。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑 盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司；Bouin's 液購(gòu)自北京邁瑞達(dá)科技有限公司；Masson三色染 色、阿爾辛藍(lán)一過碘酸希夫（AB-PAS）染色、阿爾辛藍(lán)（AB）染色和過碘酸希夫（PAS）染色染料及2.5% 戊二醛均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；琥珀 酸脫氫酶（SDH）活性、腺苷三磷酸（ATP）含量和Na+/K+-ATPase活性測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；蘋果酸脫氫酶（MDH）、α-酮戊二酸脫氫酶（a-KGDH）活性測(cè)定試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。主要儀器設(shè)備：JB-P5石蠟包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）、RM2016切片機(jī)（德國(guó)Lecia公司）、EMUC7超薄切片機(jī)（德國(guó)Lecia公司）、 Eclipse E100光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）、HT7700透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）、SU3800掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司）、MC1000離子濺射儀 （日本Hitachi公司）、冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Lanconco公 司）、恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）、微 量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)ThermoFisher Scientific 公司）。

1.2皮膚黏液與皮膚樣本采集

隨機(jī)選取30只瘤背石磺（平均體質(zhì)量20.0± 6.0g，平均體長(zhǎng)6.0±0.5cm），用超純水沖洗體表皮 膚，去除土壤污染物后，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用10 mL巴氏吸管吸取適量PBS（pH 7.4）均勻浸潤(rùn)其腹足部，刺激釋放黏液。待黏液流出后，用1mL無(wú)菌注射器收集至50mL離心管，于4℃靜置1～2h，4℃ 下4000r/min離心30min，收集上清液于-80℃冷凍 過夜后，用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，干燥后的皮 膚黏液粉末用10 mmol/L Tris-HC1（pH 8.0）溶解，4℃下12000r/min離心30min后取上清液進(jìn)行過 濾。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定皮膚黏液 蛋白濃度，處理完成的黏液樣本于-80℃保存?zhèn)溆?。收集完皮膚黏液的瘤背石磺立即用清水沖洗并放回 塑料培養(yǎng)箱，用玉米粉繼續(xù)飼養(yǎng)14d后，隨機(jī)選取 6只瘤背石磺用MS-222麻醉，對(duì)腹部（足部和足側(cè)） 皮膚進(jìn)行解剖。動(dòng)物試驗(yàn)經(jīng)上海海洋大學(xué)動(dòng)物倫理 委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3皮膚顯微結(jié)構(gòu)觀察與分析

取5mm×5mm的足部和足側(cè)皮膚，經(jīng)Bouin's 液固定24h、梯度乙醇脫水、二甲苯透明和石蠟包埋 后，用RM2016切片機(jī)進(jìn)行切片，切片厚度為4um。將切片分為4組進(jìn)行組織化學(xué)染色，采用MASSON三色染色觀察纖維結(jié)構(gòu)，AB染色（pH 2.5）檢測(cè)黏液細(xì)胞中的酸性糖綴合物，PAS染色檢測(cè)黏液細(xì)胞中的中性糖綴合物，AB-PAS染色（pH2.6）用于檢測(cè)具 有酸性和中性糖綴合物的黏液細(xì)胞。染色后在 Eclipse E100光學(xué)顯微鏡下觀察和拍照，組織學(xué)圖像采用Image J進(jìn)行測(cè)量分析。

1.4皮膚超微結(jié)構(gòu)觀察與分析

取1mm·的足部和足側(cè)皮膚浸于2.5%戊二醛 中，固定后用0.1 mol/LPBS漂洗3次，經(jīng)1%鋨酸固定、梯度乙醇脫水、丙酮置換和樹脂包埋后，用EMUC7超薄切片機(jī)進(jìn)行切片，切片厚度為60～80nm，經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色后，在HT7700透射電子顯微鏡下觀察并拍照，使用ImageJ軟件測(cè)量 分析圖像。

1.5皮膚黏液抗菌活性測(cè)定

1.5.1細(xì)菌生長(zhǎng)曲線繪制將甘油保藏的菌種以 1%的接種量接種至LB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫振 蕩培養(yǎng)箱中37℃下200r/min活化24h，分區(qū)劃線接 種至LB固體培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)24h，挑取1～2mm 單菌落放人5mLMHB肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培 養(yǎng)。將細(xì)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以0.5%比例加入 皮膚黏液粉末，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中37℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)24h，期間每隔2h取樣，測(cè)定600nm 波長(zhǎng)處的OD值（OD60），以不加皮膚黏液粉末作為 對(duì)照組，繪制細(xì)菌24h生長(zhǎng)曲線。

1.5.2抑菌圈直徑測(cè)定菌種活化及培養(yǎng)同1.5.1， 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌（OD660為0.8）用無(wú)菌PBS

調(diào)節(jié)濃度至108CFU/mL。取20mL MHA培養(yǎng)基（40℃），以5%的接種量加入菌液，混勻后置于無(wú)菌 培養(yǎng)皿中，用200μL無(wú)菌槍頭打取3個(gè)直徑6mm的孔，在1個(gè)孔中加入50uL皮膚黏液，另外2個(gè)孔分別加入等量的10ug/mL氯霉素（陽(yáng)性對(duì)照）和Tris-HCI（陰性對(duì)照）。4℃靜置過夜后放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃倒置培養(yǎng)24h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。

1.5.3細(xì)菌形態(tài)掃描電鏡觀察

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 的金黃色葡萄球菌和哈維氏弧菌菌落，用PBS洗滌3次后，重懸于新鮮LB培養(yǎng)基中，8000r/min離心 10min，加入皮膚黏液進(jìn)行培養(yǎng)，以不加皮膚黏液作 為對(duì)照組，分別于培養(yǎng)20min和2h后收集細(xì)菌，于 2.5%戊二醛中4℃固定24h后，用0.1mol/L的PBS漂洗3次，乙醇脫水后，在二氧化碳中臨界點(diǎn)干 燥。置于離子濺射儀樣品臺(tái)上噴金30s，在掃描電 子顯微鏡下觀察。

1.5.4 細(xì)菌細(xì)胞膜通透性測(cè)定

金黃色葡萄球菌 和哈維氏弧菌菌落收集同1.5.3，用PBS洗滌3次后，加入等量的含有黏液粉末的PBS，在37C下 200r/min振蕩培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0、2、4、6、8和12h 時(shí)取樣，測(cè)定260nm波長(zhǎng)處OD值（OD260）。

1.5.5細(xì)菌三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶和Na+/K+-ATPase活性及ATP含量測(cè)定

金黃色葡萄球菌和哈維氏弧菌 菌落收集同1.5.3，用PBS洗滌后重懸于新鮮LB培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)濃度至108CFU/mL，加入皮膚黏液，在 37℃下培養(yǎng)20min，8000r/min離心10min收集細(xì) 胞，采用相應(yīng)試劑盒測(cè)定細(xì)菌MDH、SDH和α-KGDH活性及ATP含量和Na+/K+-ATPase活性。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS27.0進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)、單因素方差分析（One-way ANOVA） 和Duncan's多重比較，使用GraphPad Prism 8.0和 Origin2023作圖。

2結(jié)果與分析

2.1瘤背石磺皮膚顯微結(jié)構(gòu)觀察與分析結(jié)果

通過光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，瘤背石磺腹部皮膚 的表皮由單層柱狀上皮細(xì)胞構(gòu)成，足部上皮細(xì)胞（長(zhǎng)11 μm，寬5μm）長(zhǎng)于足側(cè)上皮細(xì)胞（長(zhǎng)8pm，寬4um）， 皮膚表皮層覆蓋著肌纖維，真皮層膠原纖維間穿插 肌纖維（圖1）。

瘤背石磺腹部皮膚的黏液細(xì)胞屬于上皮下分泌 細(xì)胞，呈長(zhǎng)條狀、圓形、水滴形和不規(guī)則狀，表皮層和 真皮層間由1層基底膜隔開，黏液物質(zhì)通過基底膜 向外彌散，其附著在表皮外形成的黏液層經(jīng)AB-PAS染色后呈藍(lán)色（AB+），表皮上的微絨毛也呈藍(lán)色（圖2-A和圖2-B）。足部皮膚黏液細(xì)胞密集排列，經(jīng)AB-PAS染色后呈藍(lán)色，藍(lán)紫色（AB+、PAS+）和紫紅色（AB+、PAS*），足部皮膚中的黏液腺呈圓形（圖2-A）；足部皮膚黏液腺中間是儲(chǔ)存黏液物質(zhì)的腺腔， 周圍黏液細(xì)胞釋放黏液物質(zhì)后呈空泡狀，混合型黏 液物質(zhì)匯聚到腺腔中（圖2-C）。足側(cè)皮膚的黏液細(xì)胞排列松散，經(jīng)AB-PAS染色后呈藍(lán)紫色，足側(cè)皮膚 中分布著顆粒腺，染色后呈藍(lán)紫色，說明分泌酸性黏 多糖，顆粒腺較黏液腺大（圖2-B）；足側(cè)皮膚黏液細(xì) 胞的細(xì)長(zhǎng)頸部穿過上皮細(xì)胞向表皮延伸，扁平的細(xì) 胞核位于細(xì)胞基底處（圖2-D和圖2-E）。

瘤背石磺足部和足側(cè)皮膚的黏液細(xì)胞多為藍(lán)紫 色，表明含有較多酸性黏多糖，進(jìn)一步通過AB和PAS染色進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH2.5條件下，足部和足側(cè)皮膚黏液細(xì)胞經(jīng)AB染色后呈藍(lán)色，表明黏液細(xì)胞中含有羧化型黏蛋白（圖2-F和圖2-G）；用PAS對(duì)黏液細(xì)胞單獨(dú)染色后呈陽(yáng)性，說明黏液細(xì)胞中含有中性黏蛋白（圖2-H和圖2-I）。

2.2瘤背石磺皮膚超微結(jié)構(gòu)觀察與分析結(jié)果

2.2.1足部皮膚的超微結(jié)構(gòu)通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，瘤背石磺足部皮膚黏液腺的直徑為28.39±1.01um，黏液腺的細(xì)胞核直徑為5.54±0.40um，細(xì) 胞核周圍有粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和大量線粒體，質(zhì)膜內(nèi)褶豐富，其中分布大量糖原顆粒（圖3-A和圖3-B）。根據(jù) 腺細(xì)胞內(nèi)分泌囊泡大小和電子密度，足部皮膚中多 細(xì)胞腺的腺細(xì)胞可分為6種類型：1型和2型腺細(xì)胞 內(nèi)分泌囊泡排列緊密，具有清晰的多邊形輪廓，1型 腺細(xì)胞的分泌囊泡電子密度一致，而2型腺細(xì)胞邊 緣分布高電子密度的分泌囊泡，3型腺細(xì)胞較小且囊 泡電子密度不均一，腺細(xì)胞間分布著縱肌和橫?。▓D 3-A和圖3-D）；4型腺細(xì)胞呈梨狀，囊泡較1型和2型腺細(xì)胞多，囊泡平均直徑為1.45±0.33um（圖3-C）； 5型和6型腺細(xì)胞內(nèi)部具有高電子密度的分泌物質(zhì)，可能是黏液，5型腺細(xì)胞呈不規(guī)則狀，內(nèi)部含有空泡， 6型腺細(xì)胞邊緣有細(xì)胞器和向外分泌的囊泡（圖3-A和圖3-E）。足部皮膚的上皮細(xì)胞緊密連接，頂部具 有排列整齊且緊密的微絨毛，上有微生物附著，可能 是細(xì)菌和藻類等，細(xì)胞核內(nèi)有核仁，胞質(zhì)內(nèi)含有線粒 體和高爾基體等細(xì)胞器（圖3-E），黏液細(xì)胞排出顆粒物質(zhì)到細(xì)胞質(zhì)中，隨后變成空泡（圖3-F）。

2.2.2足側(cè)皮膚的超微結(jié)構(gòu)瘤

背石磺足側(cè)皮膚的腺細(xì)胞與足部皮膚不同，足側(cè)皮膚中含有3種類 型的腺細(xì)胞，1型腺細(xì)胞呈長(zhǎng)條狀，細(xì)胞內(nèi)的分泌囊泡緊密排列，電子密度不均一，高電子密度呈黑色， 電子密度低的顏色較淺且占多數(shù)，腺細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞 器被分泌囊泡擠到邊緣，細(xì)胞周圍有空泡（圖4-A）； 2型腺細(xì)胞近似三角形，細(xì)胞內(nèi)充斥著較大且電子密 度一致的分泌囊泡；3型腺細(xì)胞較1型和2型腺細(xì)胞 小，細(xì)胞內(nèi)的分泌物質(zhì)呈透明狀；2型和3型腺細(xì)胞 間有縱肌（圖4-B）。1型腺細(xì)胞內(nèi)分泌囊泡間有粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（圖4-C），囊泡與細(xì)胞膜融合以胞吐方式向外分泌（圖4-D）。足側(cè)皮膚真皮層中可見少量自噬溶酶體和橋粒（圖4-E），細(xì)胞器間有縱肌分布（圖4-F）。

2.3瘤背石磺皮膚黏液的抗菌活性測(cè)定結(jié)果

2.3.1細(xì)菌生長(zhǎng)曲線

瘤背石磺皮膚黏液對(duì)革蘭 氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）和革蘭 氏陰性菌（哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌、 銅綠假單胞菌、大腸桿菌）生長(zhǎng)曲線的影響如圖5所 示，與對(duì)照組相比，經(jīng)皮膚黏液處理的細(xì)菌生長(zhǎng)速度 變慢，對(duì)數(shù)期明顯滯后。革蘭氏陰性菌中，皮膚黏液 抑制大腸桿菌生長(zhǎng)速度的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，滯后8h才 進(jìn)入穩(wěn)定期，抑制哈維氏弧菌生長(zhǎng)速度的持續(xù)時(shí)間 最短。革蘭氏陽(yáng)性菌中，皮膚黏液抑制枯草芽孢桿 菌生長(zhǎng)速度的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，滯后2h才進(jìn)入穩(wěn)定期。進(jìn)入穩(wěn)定期后，對(duì)照組和黏液組的曲線匯合，說 明瘤背石磺皮膚黏液對(duì)細(xì)菌數(shù)量無(wú)明顯影響。

2.3.2抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果

測(cè)定瘤背石磺皮膚 黏液對(duì)上述7種細(xì)菌的抑菌圈直徑，結(jié)果表明皮膚 黏液對(duì)不同細(xì)菌的抑菌圈直徑有差異（圖6）。皮膚 黏液對(duì)人類致病菌金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑最 大，為12.12±0.90mm，顯著高于其他病原菌（Plt;0.05， 下同）。皮膚黏液對(duì)海水致病菌均具有抗菌活性，對(duì) 哈維氏弧菌的抑制效果最明顯，其抑菌圈直徑為10.10±0.59mm，副溶血弧菌的抑菌圈直徑為7.65±0.10mm。皮膚黏液對(duì)淡水致病菌嗜水氣單胞菌有輕微抑制作用，其抑菌圈直徑為7.99+0.38mm。

2.3.3瘤背石磺皮膚黏液對(duì)細(xì)菌形態(tài)的影響

為進(jìn)一步分析瘤背石磺皮膚黏液的抗菌作用機(jī)制，利用掃描電鏡觀察分析皮膚黏液對(duì)金黃色葡萄球菌和哈維氏弧菌形態(tài)的影響。對(duì)照組中的金黃色葡萄球菌為球形（圖7-A），經(jīng)皮膚黏液處理20min后細(xì)胞表面出現(xiàn)裂紋，并釋放出棉絮狀物質(zhì)（圖7-B），2h時(shí)后細(xì)胞噴出更多棉絮狀物質(zhì)（圖7-C）。對(duì)照組中的哈維氏弧菌呈飽滿的短桿狀（圖7-D），經(jīng)皮膚黏液處理20min后細(xì)胞明顯畸形，表面出現(xiàn)褶皺和凹陷（圖7-E），2h后表面出現(xiàn)裂紋，一端細(xì)胞膜破裂（圖7-F）。

2.3.4瘤背石磺皮膚黏液對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的影響

檢測(cè)經(jīng)瘤背石磺皮膚黏液處理后，金黃色葡萄球菌和哈維氏弧菌OD260變化，分析皮膚黏液對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的影響。結(jié)果如圖8所示，經(jīng)皮膚黏液處理后，2種細(xì)菌OD260隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，而對(duì)照組趨于平緩。哈維氏弧菌經(jīng)皮膚黏液處理4h后，OD260的增長(zhǎng)速度變快（圖8-B）。

2.3.5瘤背石磺皮膚黏液對(duì)細(xì)菌三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶活性的影響

經(jīng)瘤背石磺皮膚黏液處理后，金黃色葡萄球菌和哈維氏弧菌三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶活性變化如圖9所示。與對(duì)照組相比，2種細(xì)菌經(jīng)皮膚黏液處理后，MDH、SDH和 a-KGDH活性均顯著降低。金黃色葡萄球菌黏液組的 MDH活性較對(duì)照組降低86.5%，哈維氏弧菌黏液組的 MDH活性較對(duì)照組降低73.4%（圖 9-A）;金黃色葡萄球菌黏液組的 SDH活性較對(duì)照組降低80.3%，哈維氏弧菌黏液組的SDH活性較對(duì)照組降低57.6%（圖9-B）;金黃色葡萄球菌黏液組的a-KGDH活性較對(duì)照組降低78.5%，哈維氏弧菌黏液組的 a-KGDH活性較對(duì)照組降低77.9%（圖9-C）。

2.3.6瘤背石磺皮膚黏液對(duì)細(xì)菌ATP含量及Na*/K+-ATPase 活性的影響

經(jīng)瘤背石磺皮膚黏液處理后，金黃色葡萄球菌和哈維氏弧菌的 ATP含量及Na/K+-ATPase 活性變化如圖 10 所示。經(jīng)過黏液處理后，2種細(xì)菌ATP含量均顯著降低。與對(duì)照組相比，金黃色葡萄球菌ATP含量降低61.1%，哈維氏弧菌 ATP含量降低5.4%（圖 10-A）。而 Na/K+-ATPase活性變化趨勢(shì)與 ATP含量相反，經(jīng)黏液處理后2種細(xì)菌Na/K+-ATPase 活性均顯著升高，金黃色葡萄球菌對(duì)照組的Na/K+-ATPase 活性為 0.18±0.01 U/mg，黏液組升高至 0.24+0.02 U/mg;哈維氏弧菌對(duì)照組的 Na+/K+-ATPase 活性為 0.03±0.02 U/mg，黏液組升高至0.24±0.02 U/mg（圖10-B）。

3討論

腹足綱貝類的皮膚黏液是一種具有吸附作用的化學(xué)防御物質(zhì)，在復(fù)雜的海洋灘涂環(huán)境中，瘤背石磺的皮膚黏液是其與外界環(huán)境接觸的首道屏障，可防止磨蝕性顆粒損傷皮膚和病原微生物入侵機(jī)體。陳楚等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，魚類皮膚黏液細(xì)胞大量分泌具有免疫作用的酸性黏多糖，可溶解病原菌，有效防止病原菌侵入機(jī)體，表明黏液細(xì)胞的分泌物在皮膚防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用;本研究結(jié)果與之相似，瘤背石磺皮膚黏液細(xì)胞中含有以酸性黏多糖為主的免疫物質(zhì)，可有效防止病原體人侵。石磺科貝類皮膚組織中具有多細(xì)胞腺，可分泌具有威懾性的物質(zhì)到皮膚表面（Darias et al.，2006）。本研究觀察到的瘤背石磺足部皮膚黏液腺細(xì)胞與其他物種相似，巴爾干歐螈（Triturus ivanbureschi）的腹部皮膚中也分布著混合型黏液腺（Ajdukovic et al.，2023）。石磺科的其他物種如好望角石磺（Onchidella capensis）和海氏角石磺（O.hildae）皮膚的顆粒腺與瘤背石磺極為相似，由多種類型的分泌細(xì)胞組成，細(xì)胞周圍有肌纖維，腺細(xì)胞間分布著縱肌，肌纖維可推動(dòng)細(xì)胞內(nèi)容物的排出和釋放（Pinchuck and Hodgson，2010）。其他腹足綱動(dòng)物也具有類似的多細(xì)胞腺，其腺細(xì)胞可根據(jù)囊泡的致密程度和大小進(jìn)行分類。von Byern 等（2018）對(duì)花園蔥蝸牛（Cepaea hortensis）的足部皮膚進(jìn)行解剖觀察，發(fā)現(xiàn)其具有4種顆粒腺，腺體大小及分泌物各不相同，腺體內(nèi)存在酸性糖胺多糖。本研究中，未在瘤背石磺的腹部皮膚觀察到角質(zhì)層，與一種陸生蛞蝓（Incilaria fruhstorferi）相似，表皮由微絨毛層覆蓋（Yamaguchi et al.，2000），瘤背石磺黏液細(xì)胞的細(xì)長(zhǎng)頸部穿過表皮層向外分泌，與海兔（Aply-sia depilans）的鰓部黏液細(xì)胞相似（Lobo-da-Cunhaet al.， 2023 ）。

皮膚黏液中的免疫物質(zhì)是保護(hù)皮膚和防止病原體入侵的重要成分，而冷凍干燥后的皮膚黏液具有殺滅致病菌的功能（Brinchmann， 2016）。AbdelShafi等（2019）研究尖齒胡鯰（Clarias gariepinus）皮膚黏液對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌經(jīng)皮膚黏液處理后，生長(zhǎng)曲線較對(duì)照組明顯滯后，細(xì)菌數(shù)量顯著降低；而本研究中，細(xì)菌生長(zhǎng)曲線表明瘤背石磺皮膚黏液對(duì)7種病原菌的生長(zhǎng)速度具有抑制作用，但對(duì)細(xì)菌數(shù)量無(wú)明顯影響，可能是不同物種的皮膚黏液抑菌效果不同，瘤背石磺作為一種低等的軟體動(dòng)物，皮膚黏液的抗菌活性相對(duì)較低。關(guān)于皮膚黏液抑菌功能的研究在魚類中有較多報(bào)道，大刺鰍（Mas-tacembelus armatus）皮膚黏液酸提物對(duì)人類致病菌大腸桿菌和副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi）的抑菌圈直徑最大，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為6士1 mm（Uthayakumar et al.，2012）；兩棲性魚類大彈涂魚（Boleophthalmus pectinirostris）的皮膚黏液具有廣譜抗菌活性（劉宏漢等，2019）；鯉（Cyprinuscarpio）皮膚黏液粗提物的抑菌效果優(yōu)于抗生素（Kumari et al.，2019），魚類的皮膚黏液還可與抗生素發(fā)揮協(xié)同抗菌作用（Hussain and Sachan，2023）；鸚嘴魚屬魚類皮膚黏液經(jīng)不同方式提取有效成分后，提取物均具有抑菌效果，黏液水提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為4.33+0.47 mm（Nazurally et al.， 2023）。本研究結(jié)果表明，瘤背石磺皮膚黏液對(duì)海水 致病菌和淡水致病菌均具有抑制效果，對(duì)人類致病 菌金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑在7種病原菌中最 大，為12.12±0.90mm，表明瘤背石磺皮膚黏液具有 較好的廣譜抑菌活性，黏液中含有能阻礙細(xì)菌正常 生長(zhǎng)繁殖的生物活性物質(zhì)。經(jīng)蚓螈目的Gegeneo- phis ramaswamii黏液處理后，大腸桿菌和肺炎克雷 伯菌（Klebsiella pneumoniae）表面出現(xiàn)凹陷，細(xì)菌形 態(tài)扭曲（Arun et al.，2019）；經(jīng)克氏雙鋸魚（Amphi- prion clarkii）皮膚黏液處理的副溶血弧菌，表面出現(xiàn)皺紋且伴有絮狀物質(zhì)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌破 裂程度加劇（Wang et al.，2019）。細(xì)菌細(xì)胞膜通透性 改變后，細(xì)胞內(nèi)的核酸流出，在260nm波長(zhǎng)處的吸 收值會(huì)發(fā)生變化，因此OD260可反映細(xì)胞膜通透性是 否改變（Chen and Cooper，2002）;用鯰魚（Parasilu- rus asotus）體表黏液處理大腸桿菌，與對(duì)照組相比， 大腸桿菌OD2。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，且作用4h后OD260增長(zhǎng)速度變快（李婷婷等，2017）。本 研究結(jié)果與上述前人研究結(jié)果一致，表明瘤背石磺 皮膚黏液可破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物 流出，從而起到破壞細(xì)菌正常生長(zhǎng)繁殖的作用，且隨 著黏液處理時(shí)間延長(zhǎng)，破壞程度加劇。皮膚黏液的 抗菌作用可能是由皮膚分泌物中的一種或多種物質(zhì) 共同作用的結(jié)果（Pérez-Polo et al.，2023）。本研究發(fā) 現(xiàn)，瘤背石磺皮膚黏液可導(dǎo)致金黃色葡萄球菌和哈 維氏弧菌三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶活性及ATP含量顯著降 低，Nat/K+-ATPase活性顯著升高，與Leng等（2021） 的研究結(jié)果一致，說明瘤背石磺皮膚黏液可干擾細(xì) 菌的能量代謝過程，導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖受阻。

4 結(jié)論

瘤背石磺腹部皮膚具有多種類型的腺體和腺細(xì) 胞，其分泌的黏液可通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜和能量 代謝過程阻礙細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，具有廣譜抑菌活性，推測(cè)其可作為一種新型抗菌成分應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖或人 體健康領(lǐng)域。

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（責(zé)任編輯劉可丹）